文摘
氧化应激和能源消耗被认为参与前脑缺血后海马神经元的损伤。这项研究已经开始调查航行的潜在的神经保护作用,降脂药物具有较强的抗氧化性能,对瞬态前脑ischemia-induced在鼠海马CA1区神经元损伤和生化异常。成年男性纯种白化病老鼠受到前脑缺血和注射航行在接下来的连续7天,和与控制。前脑缺血导致明显降低的数量完整神经元(77%)、谷胱甘肽(谷胱甘肽)和三磷酸腺苷(ATP)和硫代巴比土酸显著增加活性物质(TBARS)和总硝酸盐或亚硝酸盐,(没有x)在海马组织生产。航行管理减毒前脑ischemia-induced神经元损伤,表现为完成逆转的完整的神经元数量减少,ATP谷胱甘肽和TBARS的增加x在海马组织。这项研究表明航行治疗消退前脑ischemia-induced海马神经元损失,能量损耗,氧化应激在海马CA1区。因此,航行可能是一个有前途的神经保护治疗前脑缺血。
1。介绍
损伤脑组织由于缺血性中风是第一个致命的神经系统疾病的主要原因,第三个心脏病和癌症死因后,和成人长期残疾的主要原因在工业化国家(1- - - - - -3]。大量的中风是一个闭塞的结果的一个主要或次要脑动脉(4,5]。暂时性缺血(前脑缺血),发生在实验动物呼吸在患者或被捕,引发选择性和延迟神经元细胞死亡。海马体,尤其是CA1锥体神经元,是最严重影响全球缺血大脑结构(2,5]。损害海马CA1部门发展未经处理的小鼠前脑缺血后3 - 7天,沙鼠,和人类2,6]。前脑缺血是供血不足引起的海马神经元,导致中线粒体能量代谢紊乱,导致葡萄糖利用减少,由此减少生产三磷酸腺苷和磷酸肌酸(7,8]。随后导致无氧糖酵解和乳酸酸中毒膜去极化,钙离子的流入,谷氨酸的释放到细胞外空间,诱发助氧化剂诱导一氧化氮合酶等酶(间接宾语)9,10]。大多数这些变化与大规模生产活性氧(ROS),导致严重的氧化损伤脑组织(11]。同时,再灌注与大规模生产的有毒活性氧它强化前脑缺血引起的初始脑损伤(12]。有毒活性氧的积累显著增加大脑组织氧化损伤的易感性通过膜脂质过氧化作用、蛋白质和DNA氧化(11- - - - - -13]。早期的研究报道,氧化损伤是各种模型的主要因素的急性脑损伤包括前脑缺血(13- - - - - -15]。此外,增加氧化应激生物标记和损耗的酶和非酶的抗氧化剂已报告在许多疾病,包括前脑ischemia-induced神经损伤(16,17]。因此,一个策略来保护大脑免受前脑ischemia-induced海马神经元损伤的减少氧化损伤被中和的有毒活性氧产生的缺血组织。
航行是一种临床上使用降胆固醇药物有明显的抗氧化作用18]。除了它的抗氧化性能,航行了预防糖尿病和doxorubicin-induced心肌病与氧化应激通过刺激内源性抗氧化酶(19- - - - - -21]。先前的研究已经表明,航行改善生存与大鼠心肌梗死降低心脏纤维化和炎性细胞因子的表达22,23]。在阿霉素cardiomyopathic鼠模型,航行防止doxorubicin-induced心肌病的发展通过提高心肌组织ATP生产(24]。此外,在isoproterenol-induced心力衰竭大鼠模型,航行了减弱氧化应激和能源消耗(25]。航行变弱的恶化充血性心力衰竭和心肌细胞缺血再灌注诱导细胞凋亡26]。它保护大鼠心脏对缺血再灌注arrhythmias-induced心脏损伤(27]。最近,据报道,等降低胆固醇药物辛伐他汀已被证明对大脑神经ischemia-induced神经损伤(28- - - - - -31日]。尽管航行的治疗潜力治疗多种心脏疾病,包括心肌缺血再灌注,良好的文档记录,它直接参与前脑ischemia-induced海马损伤尚未被研究过。因此,本研究旨在考察航行是否会保护大鼠前脑缺血后海马神经元死亡。
2。结果
10分钟的前脑缺血的影响,航行及其组合的数量完整的神经元在大鼠海马CA1区,如图所示1。组织病理学检查的海马CA1区控制(图1(一)),sham-operated(图1 (b)),和probucol-treated(图1 (d))组织显示正常完整的神经元。然而,前脑缺血后7天内,有广泛的破坏海马的CA1区,证明了一个完整的神经元的数量显著减少77%(图1 (c))。在CA1海马神经元死亡领域明显减少缺血后立刻航行管理,继续连续7天(图1 (e))。这是表现为显著增加的数量完整神经元缺血组相比。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
前脑缺血的影响,航行和他们的组合在TBARS层面上,海马组织中的脂质过氧化的指数,如图所示2。前脑缺血诱导海马TBARS水平大幅增长71%相比sham-operated和对照组。治疗脑缺血大鼠前脑的航行导致完成逆转ischemia-induced TBARS水平增加控制的值。然而,政府独自航行连续7天导致海马TBARS无意义的变化。
图3显示了航行的影响,缺血,及其对谷胱甘肽水平的组合,反映了细胞在大鼠海马组织非酶的抗氧化防御系统。前脑缺血诱导海马谷胱甘肽水平大幅下降32%。航行管理缺血后立即和持续的连续7天导致的逆转前脑ischemia-induced减少谷胱甘肽水平控制的值。
前脑缺血的影响,航行和组合x浓度在大鼠海马组织,如图所示4。前脑缺血诱导显著增加260%x在海马组织浓度。治疗脑缺血大鼠前脑的航行导致逆转ischemia-induced没有增加x集中控制的价值观。独自航行管理连续7天导致无意义的海马没有变化x浓度。
图5显示10分钟前脑缺血的影响,航行及其组合对大鼠海马ATP水平。前脑缺血导致海马ATP水平大幅下降51%相比sham-operated和对照组。独自航行管理(61毫克/公斤)连续7天导致无意义的增加海马ATP水平。然而,治疗脑缺血大鼠缺血后立即与航行,继续连续7天导致完成逆转的前脑ischemia-induced消耗ATP水平海马组织控制的值。
3所示。讨论
在目前的研究中,老鼠的航行管理预防延迟引起的海马CA1区神经元死亡的瞬态前脑缺血。这种保护的是显著减少海马CA1区神经细胞死亡,恢复non-protein-SH内容和TBARS减少生产,预防的高程x浓度,前脑缺血后ATP水平正常化。此外,政府减少航行导致完全恢复的ATP水平观察缺血后相比,控制价值。
本研究的结果表明,10分钟的前脑缺血大鼠诱发大规模和选择性神经元损害脆弱的地区,即海马CA1区。大约77%的海马CA1神经元缺血后再灌注(图7天后去世了1 (c))。这些结果证实之前报道(3,14,15,32]。航行管理提供脑缺血大鼠的保护海马CA1神经元损伤诱导的前脑缺血10分钟就是明证,航行拯救大多数CA1锥体神经元缺血死亡(图1 (e))。
在目前的研究中,ATP的浓度在大鼠海马测量再灌注后7天,发现控制值(图的下降了51%5)。这些结果是一致的与之前报道,在海马CA1区,三磷酸腺苷和磷酸肌酸下降超过48小时,发生再灌注(7,8]。类似的实验条件下,作者之前的研究报道,前脑缺血ATP产量降低大鼠海马再灌注后7天(14,15]。这个观察ATP产量下降前脑缺血后大鼠海马可能是二次事件后基质利用率和线粒体氧化磷酸化的抑制。据报道,改变线粒体的呼吸作用可以诱导二次损耗磷酸肌酸和ATP (8),以及水平的提高脑乳酸和丙酮酸脱氢酶酶活性降低33]。此外,缺血后的有毒活性氧的积累显著增加大脑组织氧化损伤的易感性通过膜脂质过氧化与随之而来的许多线粒体酶活性的下降(34,35]。
前脑缺血显著增加海马脂质过氧化反应,由TBARS测量,水平相比正常海马。这些结果与早期的研究在我们的实验室和其他协议(11- - - - - -15]。脂质过氧化反应,由于自由基攻击细胞膜,导致脂质过氧化反应副产物的形成包括4-hydroxynonenal,丙二醛,和许多其他有毒的醛与稍后通知高活性和对神经perikarya有毒,轴突,和少突胶质细胞36]。本研究报告没有增加x缺血后的浓度。一氧化氮(NO)是一种有效的氧化分子能够引发的脂质过氧化和细胞损伤37]。有人建议,不能够起到多个细胞毒性作用包括花生四烯酸代谢的增加以及过氧硝酸盐的形成,ONOO−。一氧化氮也可能破坏DNA通过核苷酸基脱氨基作用和可能触发程序性细胞死亡(38]。也有显著减少缺血海马神经元的谷胱甘肽的水平。谷胱甘肽,在动物细胞中发现的一种内源性抗氧化剂与自由基反应并提供免受自由基损伤。TBARS水平的增加和减少缺血海马表明谷胱甘肽水平荷载的增加自由基在缺血再灌注损伤。
通常,平衡之间存在ROS的生成和抗氧化防御系统,维持体内平衡控制细胞的氧化状态。海马神经元可能特别容易受到氧化应激因为氧化代谢活动率高和低水平的抗氧化酶。谷胱甘肽被认为是最重要的在哺乳动物细胞和胞内非蛋白巯基化合物作为自由基清除剂中扮演着关键角色,对氢氧自由基特别有效,没有已知的酶促防御系统。因此,谷胱甘肽的能力nonenzymatically清除单线态氧和氢氧自由基提供抗氧化的第一道防线(39]。有强有力的证据表明谷胱甘肽耗竭导致前脑缺血后神经细胞死亡(14,15]。谷胱甘肽的损失可能会导致线粒体损伤,线粒体功能的损伤可能导致胞质减少谷胱甘肽。除了其重要作用作为自由基清除剂,谷胱甘肽可能作为氧化还原调制器ionotropic谷氨酸受体和作为neuroprotectant会,在谷胱甘肽一起建议改变状态可能是有害的,正常神经功能(40,41]。
由于自由基和能源消耗越来越多地涉及神经损伤的重要介质,神经保护抗氧化剂和ATP水平支持者被认为是一种很有前途的方法来限制神经细胞丧失的程度。据报道,例如,许多抗氧化剂减少ischemia-reperfusion-induced ROS-mediated反应和救援海马体神经元神经损失前脑缺血的动物模型14,15,35,42,43]。此外,他汀类药物预防脑缺血通过限制氧化应激损伤(28- - - - - -30.]。
在目前的研究中,脑缺血大鼠的航行管理的规范化提供了相当大的保护作用体现ATP水平和增加完整的海马神经元的数量。这个观察ATP生产增加航行是平行于完整的海马神经元的数量的增加,这可能指出可能的考虑,ATP是一个关键机制航行变弱前脑ischemia-induced神经元损伤。这个假说是一致的报道称,之前的研究成果,航行增加ATP / ADP比率在心肌缺血再灌注对线粒体功能至关重要(25,44]。一个可能的解释是,航行可以改善线粒体氧化磷酸化底物氧化和继发于其强大的抗氧化活性,保留了许多线粒体酶的活性。
航行ischemia-induced显著减少产生的氧化应激可能归因于至少部分的恢复non-protein-SH内容和TBARS减少生产。航行也大大阻碍了高程x浓度。航行减总谷胱甘肽由前脑缺血引起的损失,提供证据表明航行治疗减少氧化应激通过恢复天然抗氧化剂的水平,减少谷胱甘肽。这可能是实现通过谷胱甘肽代谢改变的调节作用。航行的抗氧化活动曾被报导过(18- - - - - -21]。萨米尔最近,阿斯利报道,航行不仅增加内源性抗氧化酶的活性也增加抗氧化基因的mRNA表达和抑制细胞凋亡与随之而来的心脏组织改善线粒体氧化磷酸化和能源生产44]。
4所示。方法
4.1。动物
共有75名成年男性纯种白化病老鼠,重230 - 250克,来自动物保健中心,药学院,沙特国王大学,利雅得,沙特阿拉伯和被安置在代谢笼在控制环境条件下(25°C和12 h光/暗周期)。动物们自由获取标准鼠粉颗粒食品和自来水,除非另有指示。本研究的协议已通过研究伦理委员会的药学院,沙特国王大学,利雅得,沙特阿拉伯。
4.2。药物和化学物质
航行(西格玛化工有限公司,圣路易斯,密苏里州,美国)溶解在玉米油和腹腔内接种(I.P)的剂量61毫克/公斤根据先前的研究23,25,44]。腹腔内注射被选中,因为航行从胃肠道吸收较差,只有2 - 8%的剂量达到循环(45]。硫代巴比土酸从西格玛化工有限公司购买(圣路易斯,密苏里州,美国),而Ellman试剂(盘中′-dithiobis-2-nitrobenzoic酸;DTNB)从丙烯酰胺化学公司购买(瑞士)。所有其他化学物质分析成绩最高的商业应用。
4.3。实验处理协议
75只成年雄性纯种白化大鼠随机分为5组,每组15个动物。在第一组(对照组)大鼠注射航行的车辆,玉米油,(0.5毫升/体重200克/天,ip)连续7天。在第二组大鼠(虚假的集团)受到sham-operated缺血和注射航行的车辆,玉米油,连续7天。老鼠在第三组(缺血组)后立即注射相同剂量的玉米油的感应连续10分钟前脑缺血,持续了7天。第四组(航行组)的老鼠注射航行(61毫克/公斤/天,ip)连续7天。老鼠在第五集团(缺血+航行集团)后立即注射相同剂量的航行的感应连续10分钟前脑缺血,持续了7天。
4.4。瞬态前脑缺血模型
瞬态前脑缺血诱导的大鼠全身麻醉下(戊巴比妥钠;30毫克/公斤,ip)船舶闭塞结合全身低血压根据史密斯的方法等。46)和Henrich-Noack et al。47]。首先,从颈静脉血液逐渐撤回到肝素化注射器来减少系统性血压45 - 50毫米汞柱。动物在仰卧位,颈总动脉受到通过下腹正中颈部切口。颈总动脉都暴露,与迷走神经分离,并与microaneurysmal阻挡10分钟片段(他斗牛犬夹,25毫米,直,德国)。在闭塞的最后时期,夹子公布允许恢复颈动脉血流,与2 - 0,切口缝合的针脚缝合。在sham-operated动物动脉从结缔组织获释,但没有阻挡。体温保持在37°C通过使用一个控制加热垫和加热灯在整个时间的缺血和post-ischemic麻醉复苏。直肠温度计用于监测体温(Apelex直肠温度计、Panlab Bagneux,法国)。
4.5。组织学分析海马CA1区
从每组缺血后7天,5大鼠与戊巴比妥钠麻醉(100毫克/公斤)。老鼠然后用冷盐水灌注transcardially其次是4%的福尔马林磷酸盐(0.1 M;pH值7.4)。大脑从头骨和固定在同一固定剂24 h。此后,大脑是嵌入在石蜡,5μ米厚的冠方削减的部分被旋转的背侧海马切片机(徕卡CM3050S,徕卡Microsystems Bensheim,德国)。的部分每1000 -海马CA1区μ米长度从前囱−3.3−3.8−4.3是可行的细胞数。组织部分被苏木精和伊红染色。海马损伤是由计算完整的地层锥体神经元的数量在CA1子域的放大20(数码相机DXM1200F Nikkon E 600年,尼康公司,东京,日本)。只有正常的神经元可见核数。CA1神经细胞的平均数量每毫米线性长度的两个半球的部分背海马计算每组的动物。一个观察者不知道每个老鼠的条件使所有的组织学评估部分。
4.6。组织抽样
缺血后七天,从每一组被斩首,剩下的10大鼠大脑很快被删除,海马是收获在寒冷的阶段。海马是用生理盐水洗净,涂抹干燥滤纸,称重,然后10% (w / v)匀浆在6%高氯酸(ATP)的评估和冰冷的生理盐水(谷胱甘肽的海马组织的评估内容,TBARS,也没有x,使用布兰森声波降解器(美国Danburg VWR科学)
4.7。测定脂质过氧化作用和减少谷胱甘肽
海马神经组织的脂质过氧化程度决定通过测量TBARS浮在表面的组织匀浆(48]。匀浆离心机在3500 rpm,上层的收集和TBARS用于估计。吸光度测量spectrophotometrically在532 nm,浓度被表示为nmol TBARS / g湿组织。酸溶性的组织水平硫醇,谷胱甘肽,化验calorimetrically在412 nm根据Ellman[的方法49),用日本岛津公司(日本东京)分光光度计。谷胱甘肽的内容表示为μ摩尔/ g湿组织(14,15]。
4.8。硝酸盐和亚硝酸盐(NO总量的测定x)在海马组织浓度
硝酸盐和亚硝酸盐(NOx)浓度测定稳定的最终产品,亚硝酸盐,根据米兰达的方法等。50]。分析基于硝酸盐的还原钒三氯化结合酸性格里斯反应的检测。磺胺酸重氮化作用的亚硝酸盐在酸性pH值和随后的耦合与N -(10萘基)乙二胺产生了强烈的彩色产品测量spectrophotometrically 540海里。的浓度不x被表示为nmol / g湿组织(14,15]。
4.9。测定三磷酸腺苷在海马组织生产
三磷酸腺苷根据在海马组织使用高效液相色谱法测定的方法Botker et al。51]。总之,海马组织均质在冰冷的6%高氯酸,离心机在1000 rpm 15分钟0.5°C,和上清液注入高效液相色谱在中和pH值6 - 7。色谱分离了在1.2毫升/分钟的流量,使用ODS-Hypersil,毫米的身份证,5μ米列(Supelco SA、腺、瑞士)和75毫米磷酸二氢铵作为流动相。洗脱后峰值在254海里。ATP的含量表示为nmol ATP / g湿组织(14,15]。
4.10。统计分析
获得的差异值(平均±S.E.M.)是由单向方差分析(方差分析)其次是Tukey-Kramer多重比较检验。一个值为0.05或更少被作为一个标准的统计上的显著差异。
5。结论
从本研究数据表明,航行管理从ischemia-induced脑损伤大鼠的保护。这种保护可能是由于减少氧化应激和海马ATP水平的提高。这些观察表明,航行可能是临床可行的防护剂对各种情况的细胞损伤是氧化应激的结果和能量损耗。此外,航行可能潜在的用于预防神经退行性疾病如前脑缺血。然而,其他临床因素也必须考虑在内,比如航行的递减效应对低密度脂蛋白和高密度脂蛋白含量。然而,这项研究的结果打开新的视角使用航行治疗神经退行性疾病特别是那些与或继发于心肌缺血有关。
的利益冲突
这项研究的作者声明没有利益冲突。
承认
目前的工作是支持的操作由研究中心,药学院院长职的研究,沙特国王大学。