地塞米松治疗可以逆转肺炎球菌性脑膜炎大鼠的认知障碍，但会增加脑氧化应激

摘要

肺炎球菌性脑膜炎与显著死亡率和神经系统的后遗症。该动物接受10 μ盐水或L的肺炎链球菌suspension and were randomized into different groups: sham: placebo with dexamethasone 0.7 mg/kg/1 day; placebo with dexamethasone 0.2 mg/kg/7 days; meningitis groups: dexamethasone 0.7 mg/kg/1 day and dexamethasone 0.2 mg/kg/7 days. Ten days after induction we evaluated memory and oxidative stress parameters in hippocampus and cortex. In the step-down inhibitory avoidance task, we observed memory impairment in the meningitis group with dexamethasone 0.2 mg/kg/7 days. The lipid peroxidation was increased in hippocampus in the meningitis groups with dexamethasone and in cortex only in the meningitis group with dexamethasone 0.2 mg/kg/7 days. The protein carbonyl was increased in hippocampus in the meningitis groups with dexamethasone and in cortex in the meningitis groups with and without dexamethasone. There was a decrease in the proteins integrity in hippocampus in all groups receiving treatment with dexamethasone and in cortex in all groups with dexamethasone (0.7 mg/kg/1 day). The mitochondrial superoxide was increased in the hippocampus and cortex in the meningitis group with dexamethasone 0.2 mg/kg/7 days. Our findings demonstrate that dexamethasone reverted cognitive impairment but increased brain oxidative stress in hippocampus and cortex in Wistar rats ten days after pneumococcal meningitis induction.

1.介绍

肺炎链球菌引起中枢神经系统中最糟糕的急性细菌感染（CNS）[1]。在认知速度损失大人结果肺炎球菌脑膜炎[2，颅内并发症，脑水肿，脑积水，海马细胞凋亡，皮质坏死[3]。认知障碍在三分之一的患者中发现，由于这个原因，大量的患者将继续疾病的急性期过后有归因于他们的病情投诉[4]。在蛛网膜下腔炎性宿主反应似乎与不利的结果相关联，伴随着鞘内生产多种介体，包括TNF-α的α，IL-1βil - 6 (五]，和基质金属蛋白酶;结果，多形核白细胞被吸引和激活。其结果，产生大量的一氧化氮和活性氧物质（ROS）的[6]。大脑是特别容易受到ROS，脑细胞膜是富含多不饱和脂肪酸可以被氧化[7]导致脂质过氧化，DNA修饰，和细胞功能障碍[8]。此外，抗氧化剂治疗已被证明可以防止脑损伤[9]，衰减脑膜炎，血 - 脑屏障的破坏，和颅内高压[10]。地塞米松是糖皮质激素，非常公知的，以减少炎症级联，以及在各种临床病症，其中它们的免疫抑制性质是有益的[使用4]。然而，地塞米松在细菌性脑膜炎中的应用存在争议[11]。在具有肺炎球菌性脑膜炎的实验动物模型中，地塞米松抑制基质金属蛋白酶的表达[12]，神经后遗症减少，由B组链球菌[成年大鼠模型抑制caspase-3活性13，14]。另一方面，地塞米松辅助治疗加重海马细胞凋亡，降低学习能力[15]，并没有阻止幼鼠在肺炎球菌脑膜炎性聋[16]。因此，在这项研究中，我们研究了地塞米松的辅助治疗中的认知能力和氧化应激由肺炎球菌性脑膜炎引起的大鼠。

2.材料和方法

Male Wistar rats (3-4 months, 220–310 g) were obtained from our breeding colony (UNESC). The animals were housed five in a cage with food and water available ad libitum and maintained on a 12 h light/dark cycle (lights on at 7:00 a.m.). All experimental procedures involving animals were performed in accordance with the NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals and the Brazilian Society for Neuroscience and Behavior (SBNeC) recommendations for animal care and approved by the Animal Care and Experimentation Committee of UNESC, Brazil by protocol 84/2009.

2.1。脑膜炎型

All surgical procedures and bacteria administrations were performed under anesthesia consisting of an intraperitoneal (i.p.) administration of ketamine (6.6 mg/kg), xylazine (0.3 mg/kg), and acepromazine (0.16 mg/kg) [17]。肺炎链球菌在10毫升托德·休伊特肉汤培养基中培养过夜，再培养6小时(35℃，CO₂5.5％），并生长至对数期。The culture was centrifuged for 10 min at 5,000 × g and resuspended in sterile saline to the desired concentration and used for intracisternal injection [18，19含有cfu /毫升(14，20.]。在第1天，将大鼠进行了23号针头的基底水箱抽头。针的位置被明确脑脊液的自由流动验证。脑脊液被撤回，或者接收到的10动物 μ的无菌盐水中的0.85％L作为对照（假）或的等体积肺炎链球菌。感染后16小时内穿刺获得脑脊液(CSF)，在血琼脂平板上连续稀释5 mL培养，以评估细菌载量[18，21，然后开始抗生素治疗(头孢曲松100 mg/Kg，每日两次，连续7天)[20.]。The animals were randomized into different groups: sham: placebo group with dexamethasone (0.7 mg/kg/1 day) and placebo group with dexamethasone (0.2 mg/kg/7 days) and meningitis group with dexamethasone (0.7 mg/kg/1 day) and meningitis group with dexamethasone (0.2 mg/kg/7 days) [22]。诱导后10天进行脑膜炎行为测试。行为测试结束后，处死动物，分离海马和皮质，测定硫代巴比妥酸反应物质、蛋白羰基、巯基、线粒体超氧化物。

2.2。行为测试

2.2.1。降压抑制性回避任务

这个任务评估厌恶的记忆。该装置和程序，在以前的报告[被描述23]。简言之，训练装置是一个 cm acrylic box (Albarsch, Porto Alegre, Brazil) whose floor consisted of parallel caliber stainless steel bars (1 mm diameter) spaced 1 cm apart. A 7 cm-wide, 2.5 cm-high platform was placed on the floor of the box against the left wall. In the training trial, animals were placed on the platform, and their latency to step down on the grid with all four paws was measured with an automatic device. Immediately after stepping down on the grid, the animals received a 0.4 mA, 2.0 s foot shock and returned to their home cage. A retention test trial was performed 24 h after training (long-term memory). The retention test trial was procedurally identical to training, except that no foot shock was presented. The retention test step-down latency (maximum 180 s) was used as a measure of inhibitory avoidance retention.

2.3。生化检测

2.3.1。脂质过氧化

脂质过氧化是通过硫代巴比妥酸(TBA)活性物质(tbar)的形成，采用酯bauer和Cheeseman的方法[24]。大脑解剖后，洗涤大脑结构与PBS，收获和裂解。TBA 0.67％加入到各管中并涡旋。The optical density of each solution was measured in a spectrophotometer at 535 nm. Data were expressed as nmoL of TBARS equivalents per mg of protein.

2.3.2。蛋白质羰基形成

蛋白质羰基的含量在分光光度测定中使用2,4-二硝基苯肼（DNPH）在脑匀浆测定[25]。Absorbance was recorded in a spectrophotometer at 370 nm for both DNPH-treated and HCl-treated samples. Protein carbonyl levels were expressed as nmol of carbonyl per mg of protein. All the results were normalized by protein concentration measured by the Lowry assay [26]。

2.3.3。巯基的转移

总在大脑中硫醇含量（巯基-SH）是使用5,5-二硫代双（2-硝基苯甲酸）（2-硝基苯甲酸）方法（DTNB）测定。DTNB测定条件如先前所述[27]，有一些修改。The absorbance at 412 nm was measured and amounts of TNB formed (equivalent to the amount of sulphydryl (SH) groups) were calculated. All the results were normalized by protein concentration measured by the Lowry assay [26]。

2.3.4。线粒体超

作为电子传输链（ETC）的解偶联的指标，线粒体超的产生（）如先前所述测定[28]。使用终浓度为0.1-0.3 lM的超氧化物歧化酶(E.C. 1.15.1.1.)作为阴性对照，以确认检测的特异性。

2.3.5。统计分析

从抑制性回避任务数据报告为中位数和四分位组之间的范围和比较采用曼 - 惠特尼执行ü试验。各个组内采用Wilcoxon检验分析。从生物化学分析数据通过接着Tukey检验单因子变异数分析（ANOVA）进行分析时F为显著，并表示为平均值±标准偏差。所有分析均使用统计软件包社会科学（17.0版）软件进行。

3.结果

在图1中，我们发现从肺炎球菌性脑膜炎的诱导后10天降压抑制性回避测试结果。在急性协议有没有在训练课的表现（组之间的差异)。在测试会话中，有没有在脑膜炎组中的降压潜伏期训练和测试之间的差异（)。然而，地塞米松治疗0.7 mg/kg/1 day的脑膜炎组训练与测试间有统计学差异()。在重复地塞米松方案中，两组在训练期()。在测试会话中，有没有在脑膜炎组中的降压延迟差（) and meningitis group treated with dexamethasone 0.2 mg/kg/7 days ()。海马中脂质、tbar的氧化损伤，图图2（a），与假手术组相比，地塞米松(0.7 mg/kg/1 day和0.2 mg/kg/7 days)在脑膜炎组()和图图2（b），in cortex, was increased in meningitis group with dexamethasone treatment (0.2 mg/kg/7 days) when compared with the sham ()。在图图3（a），in hippocampus, protein carbonyl assays, was increased in meningitis group with adjuvant dexamethasone treatment, respectively (0.7 mg/kg/1 day and 0.2 mg/kg/7 days) when compared with the sham group ()。在图图3（b），与假手术组相比，地塞米松治疗组和脑膜炎组的皮质羰基水平分别升高(0.7 mg/kg/1 day和0.2 mg/kg/ day) ()。图中用巯基(SH)测定蛋白质的完整性图4（a）;在海马体中，所有接受辅助治疗的组和脑膜炎组的蛋白完整性均有所下降。皮质区，地塞米松治疗(0.7 mg/kg/1 day)组蛋白完整性均下降图4（b）（)。我们展示了图图5（a），在海马体和图形图5（b）与假手术组相比，地塞米松治疗组(0.2 mg/kg/7天)中线粒体超氧化物活性增加()。

4.讨论

同肺炎链球菌在蛛网膜下腔的增殖中，大量被膜下细菌成分被释放，包括脂多糖、脂壁酸、肺溶菌素和细菌DNA [29]。细菌的部件由识别To​​ll样导致NF-κB的活化，并且它触发炎症细胞因子表达受体（TLR）或其它病原体识别受体。结果，多形核白细胞被吸引和激活;此外，一氧化氮合酶的诱导（iNOS）的表达时，产生大量的超氧阴离子（）和一氧化氮（NO），导致形成过氧亚硝酸盐（ONOO^-)。其结果是，氧化应激导致的细胞因子和趋化因子的活化，增强嗜中性粒细胞活化的，脂质过氧化，DNA单链断裂，和线粒体损伤[30.]。各种病理生理改变被诱导，如增加血脑屏障通透性，脑水肿，颅内高压，和血栓形成，这可能会导致学习障碍，神经精神障碍，感觉运动障碍，失明，耳聋[31]。糖皮质激素在临床条件下，他们的免疫抑制特性都应该说明其有益效果[使用4]。与地塞米松辅助治疗与在蛛网膜下腔的炎症过程降低相关联[32]。它的胱天蛋白酶-3激活降低，抑制在大鼠脑内接种的MMP-9的表达肺炎链球菌[12，并改善脑膜炎的神经学预后[13，14]。我们证实与地塞米松以单剂量施用该处理之前的抗生素治疗防止与肺炎球菌性脑膜炎引起的动物中的认知障碍。与此同时，引起的脂质过氧化反应和蛋白质羰这个辅助治疗，在海马降低的细胞完整性和增加的线粒体超活性水平。已经表示，类固醇降低血 - 脑渗透性，从而抗生素渗透进入蛛网膜下腔[33]。Irazuzta等人，2005年，经核实在水迷宫任务的性能地塞米松治疗的动物进行了改进，这表明地塞米松衰减脑膜炎记忆障碍[13]。溶菌抗生素会导致扩大宿主炎症反应的细菌成分，释放，这反过来，有助于细菌性脑膜炎的脑损伤[21]。这种高度的促炎性响应将与第一抗生素剂量之前使用地塞米松治疗的抑制。莱布和同事[15] showed a significantly impaired learning performance in infected infant rats by pneumococcal meningitis treated with dexamethasone (0.7 mg/kg with an interval of 8 hours from 18 to 34 h) when compared with the control group. We also verified, in our results, that the prolonged dexamethasone use did not prevent cognitive impairment in animal model. In four trials including children with流感嗜血杆菌脑膜炎，地塞米松减少神经续集和感觉神经性听力损失[频率34，35]。同样的，在欧洲的研究中，它显示了用地塞米松辅助治疗将成人细菌性脑膜炎的不良转换率从25降低到15%;使用地塞米松辅助治疗前或首次使用抗生素[36]。地塞米松抑制TNF-的产生α和IL-1β，减少脑水肿，并且限制在脑脊液乳酸盐和白细胞浓度的增加[4]。范·德·比克和他的同事，2010 [37]，从五个试验公布的2029例患者的荟萃分析。他们证实在急性细菌性脑膜炎的治疗方法，辅助塞米松处理似乎没有显著减少死亡或神经功能障碍。有在任何预设亚组中没有显著的治疗效果。辅助塞米松处理的全部或细菌性脑膜炎患者的任意亚的利益因而仍未经证实。我们证实，治疗与地塞米松，用一剂，抗生素治疗开始减少与肺炎球菌性脑膜炎引起的动物的认知损害。

利益冲突

作者没有利益冲突。

承认

这项研究是由来自的CNPq，FAPESC，UNESC和国家研究所西恩西亚ËTECNOLOGIA Translacional EM MEDICINA（INCT-TM）的资助。

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