肟 氧化医学与细胞寿命 1942 - 0994 1942 - 0900 Hindawi出版公司 173035 10.1155 / 2011/173035 173035 研究文章 地塞米松治疗逆转认知障碍，但增加了大鼠患肺炎球菌脑膜炎的大脑氧化应激 Barichello Tatiana. 1 桑托斯 安娜·露西亚B。 1 西尔维斯特 而 1 罗索 问。 1 Cipriano Andreza L。 1 Petronilho Fabricia 2 DAL-Pizzol 菲利普 2 Comim 克拉丽莎M。 3. Quevedo. 若昂 3. Fadillioglu Ersin 1 微生物学实验和国立转化医学（INCT-TM）的实验室 健康科学研究生课程 健康科学部门 南圣卡塔琳娜大学 88806 - 000年Criciuma SC 巴西 ufsc.br 2 国家转化医学研究所病理生理学实验室(INCT-TM) 健康科学研究生课程 健康科学部门 南圣卡塔琳娜大学 88806 - 000年Criciuma SC 巴西 ufsc.br 3. 神经科学和国家转化医学研究所实验室(INCT-TM) 健康科学研究生课程 健康科学部门 南圣卡塔琳娜大学 88806 - 000年Criciuma SC 巴西 ufsc.br 2011 21 11 2011 2011 07 02 2011 26 08 2011 07 09 2011 2011 ©2011塔蒂亚娜Barichello等。 这是一篇在知识共享署名许可下发布的开放存取的文章，它允许在任何媒体上无限制地使用、传播和复制，只要原始作品被适当地引用。

肺炎球菌性脑膜炎与显著的死亡率和神经后遗症相关。这些动物要么得到10英镑 μ.盐水或L的 肺炎链球菌并随机分为不同组:sham组:安慰剂+地塞米松0.7 mg/kg/1天;安慰剂+地塞米松0.2 mg/kg/7天;脑膜炎组:地塞米松0.7 mg/kg/1天，地塞米松0.2 mg/kg/7天。诱导10天后，我们评估了海马和皮层的记忆和氧化应激参数。在降压抑制回避任务中，我们观察到脑膜炎组使用地塞米松0.2 mg/kg/7天的记忆障碍。地塞米松组海马脂质过氧化增加，地塞米松0.2 mg/kg/ 7d组皮质脂质过氧化增加。在有地塞米松的脑膜炎组中，海马区和有和没有地塞米松的脑膜炎组中，皮质区蛋白羰基增加。在接受地塞米松治疗的所有组中，海马和皮质的蛋白质完整性均有下降(0.7 mg/kg/1天)。地塞米松0.2 mg/kg/ 7d组海马和皮质线粒体超氧化物含量升高。我们的研究结果表明，地塞米松在肺炎球菌性脑膜炎诱导后10天恢复了Wistar大鼠的认知障碍，但增加了海马和皮层的大脑氧化应激。

 1.介绍

链球菌引起的肺炎导致最严重的中枢神经系统(CNS)急性细菌感染[ 1]．成人肺炎球菌性脑膜炎导致认知速度下降[ 2]，颅内并发症，脑水肿，脑积水，海马细胞凋亡和皮质坏死[ 3.]．三分之一的患者有认知障碍，因此，大量患者在疾病急性期后仍会有可归因于疾病的投诉[ 4]．蛛网膜下腔的炎症宿主反应似乎与不良结果相关，伴有鞘内产生多种介质，包括TNF- α.，IL-1 βIL-6 [ 5]、基质金属蛋白酶;因此，多形核白细胞被吸引和激活。结果，产生大量的一氧化氮和活性氧(ROS) [ 6]．大脑特别容易受到ROS的攻击，脑细胞的细胞膜富含可被氧化的多不饱和脂肪酸[ 7导致脂质过氧化、DNA修饰和细胞功能障碍[ 8]．此外，抗氧化剂治疗已经证明可以防止脑损伤[ 9]，衰减脑膜炎，血 - 脑屏障的破坏，和颅内高压[ 10]．地塞米松是一种糖皮质激素，众所周知，它可以减少炎症级联反应，并被用于各种有益于免疫抑制的临床条件中[ 4]．然而，在细菌性脑膜炎中使用地塞米松是争议的[ 11]．在肺炎球菌性脑膜炎实验动物模型中，地塞米松抑制基质金属蛋白酶表达[ 12]，减少神经后遗症，抑制成年大鼠B组链球菌模型caspase-3活性[ 13， 14]．另一方面，地塞米松作为佐剂治疗加剧了海马凋亡，减少了学习能力[ 15]，并不能防止婴儿大鼠肺炎球菌性脑膜炎的感音神经性听力损失[ 16]．因此，在本研究中，我们研究了地塞米松辅助治疗对肺炎球菌性脑膜炎大鼠认知功能和氧化应激的影响。

 2.材料和方法

雄性Wistar大鼠(3 ~ 4月龄，220 ~ 310g)。这些动物5只被关在一个笼子里，有食物和水可供随意饮用，并维持一个12小时的光/暗周期(早上7点亮灯)。所有实验过程涉及动物按照美国国立卫生研究院进行指导的护理和使用实验动物和巴西社会神经科学和行为(SBNeC)动物保健和建议UNESC动物保健和实验委员会批准,巴西通过协议84/2009。

2．1.脑膜炎模型

所有手术操作和细菌给药均在麻醉下进行，包括腹腔(i.p.)给氯胺酮(6.6 mg/kg)，氧拉嗪(0.3 mg/kg)和乙酰丙嗪(0.16 mg/kg) [ 17]． 肺炎链球菌10 mL Todd Hewitt broth培养基中培养过夜，再培养6 h(35°C, CO25.5%)，增长到对数阶段。培养物5000 × g离心10 min，用无菌生理盐水重悬至所需浓度，用于胸骨内注射[ 18， 19)包含 5 × 10 9 cfu /毫升( 14， 20.]．在第1天，将大鼠进行了23号针头的基底水箱抽头。针的位置被明确脑脊液的自由流动验证。脑脊液被撤回，或者接收到的10动物  μ.L无菌生理盐水0.85%作为对照(假)或同等体积的 肺炎链球菌．感染后16小时经胸壁穿刺获得脑脊液(CSF)，在血琼脂平板上连续稀释培养5 mL以评估细菌负荷[ 18， 21]，后面是抗生素治疗的开始（每天两次Ceftriaxone 100 mg / kg，i.p.，七天）[ 20.]．The animals were randomized into different groups: sham: placebo group with dexamethasone (0.7 mg/kg/1 day) and placebo group with dexamethasone (0.2 mg/kg/7 days) and meningitis group with dexamethasone (0.7 mg/kg/1 day) and meningitis group with dexamethasone (0.2 mg/kg/7 days) [ 22]．诱导脑膜炎10天后进行行为试验。行为测试结束后，处死动物，分离海马和皮质，测定硫代巴比妥酸活性物质、蛋白羰基、巯基、线粒体超氧化物。

 ２.２.行为测试 2.2.1。降下抑制性回避任务

这个任务评估厌恶记忆。该仪器及程序已在以前的报告中描述[ 23]．简单地说，训练器材是 50 × 25 × 25  cm acrylic box (Albarsch, Porto Alegre, Brazil) whose floor consisted of parallel caliber stainless steel bars (1 mm diameter) spaced 1 cm apart. A 7 cm-wide, 2.5 cm-high platform was placed on the floor of the box against the left wall. In the training trial, animals were placed on the platform, and their latency to step down on the grid with all four paws was measured with an automatic device. Immediately after stepping down on the grid, the animals received a 0.4 mA, 2.0 s foot shock and returned to their home cage. A retention test trial was performed 24 h after training (long-term memory). The retention test trial was procedurally identical to training, except that no foot shock was presented. The retention test step-down latency (maximum 180 s) was used as a measure of inhibitory avoidance retention.

 ２.３.生化检测 2.3.1。脂质过氧化作用

通过在Esterbauer和Cheeseman的方法后形成硫氨基吡啶酸（TBA）反应性物质（TBAR）测量脂质过氧化[ 24]．脑解剖后，用PBS清洗脑结构，收获并裂解。在每根试管中加入0.67%的TBA并进行旋涡。在535 nm处用分光光度计测量每种溶液的光密度。数据以每mg蛋白质的TBARS当量的nmoL表示。

 2.3.2。蛋白质羰基形成

用2,4-二硝基苯肼(DNPH)分光光度法测定脑匀浆中的蛋白质羰基含量[ 25]．在370nm处用分光光度计记录dnph处理和盐酸处理的样品的吸光度。蛋白质羰基水平用每毫克蛋白质的羰基nmol表示。所有结果均由Lowry测定法测定的蛋白质浓度归一化[ 26]．

 2.3.3。含巯基的组

采用5,5-二硫代二(2-硝基苯甲酸)(2-硝基苯甲酸)法(DTNB)测定脑内总硫醇含量(巯基-SH)。DTNB测量条件如前所述[ 27，只做了一些修改。测量412 nm处的吸光度，计算形成的TNB的数量(相当于巯基(SH)的数量)。所有结果均由Lowry测定法测定的蛋白质浓度归一化[ 26]．

 2.3.4。线粒体超氧化物

作为电子转运链(ETC)解耦的一个指标，线粒体超氧化物( O 2 - )的确定如前所述[ 28]．以0.1-0.3 lM终浓度的超氧化物歧化酶(E.C. 1.15.1.1.)作为阴性对照，以确定检测的特异性。

 2.3.5。统计分析

来自抑制回避任务的数据被报告为中位数和四分位数范围，组间比较使用Mann-Whitney进行 U测试。各个组内采用Wilcoxon检验分析。从生物化学分析数据通过接着Tukey检验单因子变异数分析（ANOVA）进行分析时F为显著，并表示为平均值±标准偏差。所有分析均使用统计软件包社会科学（17.0版）软件进行。

 3.结果

在图 1，我们显示了肺炎球菌脑膜炎诱导后10天的降压抑制回避试验的结果。在急性治疗方案中，两组在训练阶段的表现没有差异( P > ０．０５ ）.在测试会话中，有没有在脑膜炎组中的降压潜伏期训练和测试之间的差异（ P ＝ 0.153 ）.然而，地塞米松治疗0.7 mg/kg/1天的脑膜炎组在训练和测试阶段之间有统计学差异( P ≤ ０．０５ ）.在重复的地塞米松协议中，培训会议中的组之间没有差异（ P > ０．０５ ）.在测试阶段，脑膜炎组的降压潜伏期没有差异( P ＝ 0.080 )，脑膜炎组给予地塞米松0.2 mg/kg/7天( P ＝ 0.240 )，与训练课程相比。海马中脂质TBARS的氧化损伤，如图 2(一个)，地塞米松组(0.7 mg/kg/1天和0.2 mg/kg/7天)较假手术组( P ≤ ０．０５ )和图 2 (b)，地塞米松治疗组(0.2 mg/kg/7天)与假手术组( P ≤ ０．０５ ）.在图 3(一个)，与假手术组相比，地塞米松辅助治疗组(0.7 mg/kg/1天和0.2 mg/kg/7天)海马蛋白的碳基含量分别增加( P ≤ ０．０５ ）.在图 3 (b)在Cortex中，在与假组（以下）相比，脑膜炎组和脑膜炎组和脑膜炎血细胞腺炎组中羰基水平分别增加了（0.7mg / kg / 1天和0.2mg / kg /天）。 P ≤ ０．０５ ）.通过图中的巯基（sh）组测量蛋白质的完整性 4(一)；在海马中，地塞米松辅助治疗组和脑膜炎组的蛋白质完整性均下降。在皮质区，所有地塞米松治疗组(0.7 mg/kg/1天)的蛋白质完整性图均有所下降 4（b）（ P ≤ ０．０５ ）.我们展示了图 5（a）和Figure 5（b）地塞米松治疗组(0.2 mg/kg/7天)线粒体超氧化物酶活性增加，与假手术组( P ≤ ０．０５ ）.

递减抑制性回避。The step-down inhibitory avoidance test showed meningitis group with dexamethasone treatment (0.7 mg/kg/1 day) and demonstrated group meningitis with dexamethasone treatment (0.2 mg/kg/7 days). Data was presented as media and interquartile ranges, n ＝ 10 老鼠每组。＊ P < ０．０５ 与培训。

氧化变量。TBARS。在地塞米松(0.7 mg/kg/1天或0.2 mg/kg/7天)治疗期间，对海马(a)和皮质(b)中的硫代巴比妥酸反应物质(TBARS)进行了评估。值表示为平均值±SD ( n ＝ 5 为每个组)。*不同于sham ( P < ０．０５ ），**来自与地塞米松不同假。

蛋白质羰基．在地塞米松(0.7 mg/kg/1天或0.2 mg/kg/7天)治疗期间，对海马(a)和皮质(b)中的蛋白羰基进行评估。值表示为平均值±SD ( n ＝ 5 为每个组)。*不同于sham ( P < ０．０５ ），**来自与地塞米松不同假。

硫糊精组．在地塞米松(0.7 mg/kg/1天或0.2 mg/kg/7天)治疗期间，在海马(a)和皮质(b)评估巯基组。值表示为平均值±SD ( n ＝ 5 为每个组)。*不同于sham ( P < ０．０５ ），**来自与地塞米松不同假。

线粒体超氧化物歧化酶(SOD)．在地塞米松(0.7 mg/kg/1天或0.2 mg/kg/7天)治疗期间，评估海马(a)和皮层(b)的SOD活性。值表示为平均值±SD ( n ＝ 5 为每个组)。*不同于sham ( P < ０．０５ ），**来自与地塞米松不同假。

 4。讨论

与 肺炎链球菌大量被膜下细菌成分被释放，包括脂多糖、脂壁酸、肺炎溶素和细菌DNA [ 29]．细菌成分被toll样受体(TLRs)或其他病原体识别受体识别，导致NF-kappaB的激活，并触发炎症细胞因子的表达。结果，多形核白细胞被吸引和激活;此外，一氧化氮合酶(nitric oxide synthase, iNOS)的诱导表达，产生大量超氧阴离子( O 2 - )和一氧化氮(NO)，导致过氧亚硝酸盐的形成(ONOO-）.因此，氧化应激导致细胞因子和趋化因子活化、中性粒细胞活化增强、脂质过氧化、DNA单链断裂和线粒体损伤[ 30.]．引起各种病理生理改变，如血脑屏障通透性增加、脑水肿、颅内高压和血栓形成，这些可能导致学习障碍、神经精神障碍、感觉运动障碍、失明和耳聋[ 31]．糖皮质激素用于临床，其免疫抑制特性被认为是其有益作用的原因[ 4]．地塞米松辅助治疗与蛛网膜下腔炎症过程减少有关[ 32];它的胱天蛋白酶-3激活降低，抑制在大鼠脑内接种的MMP-9的表达 肺炎链球菌［ 12]和改善脑膜炎中的神经系统结果[ 13， 14]．我们证实与地塞米松以单剂量施用该处理之前的抗生素治疗防止与肺炎球菌性脑膜炎引起的动物中的认知障碍。与此同时，引起的脂质过氧化反应和蛋白质羰这个辅助治疗，在海马降低的细胞完整性和增加的线粒体超活性水平。已经表示，类固醇降低血 - 脑渗透性，从而抗生素渗透进入蛛网膜下腔[ 33]．Irazuzta等人，2005，证实了地塞米松治疗的动物在水迷宫任务中的表现得到了改善，表明地塞米松可以减轻脑膜炎记忆缺陷[ 13]．溶菌抗生素会导致扩大宿主炎症反应的细菌成分，释放，这反过来，有助于细菌性脑膜炎的脑损伤[ 21]．这种高度的促炎性响应将与第一抗生素剂量之前使用地塞米松治疗的抑制。莱布和同事[ 15与对照组相比，感染肺炎球菌性脑膜炎的婴儿大鼠接受地塞米松(0.7 mg/kg，间隔8小时，从18小时到34小时)治疗后，学习能力明显受损。在我们的结果中，我们也证实了延长地塞米松的使用并不能防止动物模型的认知障碍。在四项试验中，包括患有 流感嗜血杆菌脑膜炎、地塞米松降低了神经后遗症和感音神经性听力损失的频率[ 34， 35]．同样，在欧洲的研究中，地塞米松辅助治疗将成人细菌性脑膜炎的不良结局率从25降低到15%;在使用第一剂量抗生素之前或使用第一剂量抗生素时给予地塞米松辅助治疗[ 36]．地塞米松抑制了TNF-的生产 α.和IL-1 β，减少脑水肿，并且限制在脑脊液乳酸盐和白细胞浓度的增加[ 4]．van de Beek及其同事，2010 [ 37发表了来自5个试验的2029名患者的荟萃分析。他们证实，在急性细菌性脑膜炎治疗中辅助地塞米松治疗似乎没有显著减少死亡或神经功能障碍。在任何预先指定的亚组中都没有显著的治疗效果。因此，辅助地塞米松治疗对所有或任何亚组细菌性脑膜炎患者的益处仍未得到证实。我们证实，在抗生素治疗开始前用一次剂量的地塞米松治疗可减少肺炎球菌脑膜炎引起的动物认知损害。

 利益冲突

作者没有利益冲突。

 承认

这项研究是由来自的CNPq，FAPESC，UNESC和国家研究所西恩西亚ËTECNOLOGIA Translacional EM MEDICINA（INCT-TM）的资助。

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