环孢霉素A在乌尔里希先天性肌肉萎缩症:长期的结果

文摘

六个人,乌尔里希先天性肌肉萎缩症(UCMD)和突变基因编码胶原VI,老化5 - 9,收到3 - 5毫克/公斤的环孢霉素(CsA)每日1 - 3.2年。主要结果测量指标是肌肉力量评估megalimbs myometer和表达。megalimbs评分有明显改善()在5 6例。运动机能并没有改变。呼吸功能恶化。CsA治疗纠正线粒体功能障碍,增加肌肉再生,减少凋亡细胞核的数量。这项研究的结果表明,长期治疗CsA改善性能的四肢,但不是UCMD呼吸肌肉的病人,和良好的耐受性。这些结果表明考虑CsA的审判或nonimmunosuppressive环孢菌素,保留PTP-desensitizing CsA的属性,尽早UCMD患者当隔膜不妥协。

1。介绍

胶原蛋白VI (ColVI)是一种广泛表达细胞外基质(ECM)的蛋白质组成的三个连锁店,α1 (VI), alpha2 (VI),和alpha3 (VI),编码的COL6A1,COL6A2,COL6A3基因,分别。在这三个基因突变导致两个主要临床形式,贝特莱姆肌病(BM [MIM158810]) (1)和乌尔里希先天性肌肉萎缩症(UCMD [MIM 254090]) (2),少肌硬化症肌病(毫米(MIM 255600]) [3]。BM的特点是慢慢进步的轴向和近端肌肉无力的手指弯曲挛缩[4]。BM通常是轻微的(4),有时会慢慢进步的一些影响个人50岁以上需要艾滋病户外流动(5]。相比之下,UCMD是一种严重的疾病,其特征是先天性肌无力与轴向和近端关节挛缩和远端关节高流动性对企业有利6]。电动机的里程碑是延迟,大多数的孩子从来没有获得独立行走能力(6]。早,进步和严重呼吸道参与可能需要人工通气支持在第一或第二个十年的生活(7]。隐性和显性ColVI突变导致BM和UCMD [8,9]。普遍被估计为0.5:100000 BM和0.1:100000 UCMD [10),但这些障碍可能是诊断。

在Col6a1^−−/突变鼠(11),肌肉纤维收缩力量的丧失与超微结构的变化组成的肌浆网的标志相呼应,线粒体的改变,细胞凋亡和核的特性12]。肌肉纤维的Col6a1^−−/老鼠显示除了线粒体功能障碍的迹象。线粒体膜电位是影响休息,但添加寡霉素造成去极化,异常响应由镀纤维阻止ColVI或通过环孢菌素治疗(CsA) [12),一个逐渐脱敏药物还有线粒体渗透性转换孔通过绑定到D [13]。为了确定线粒体还参与UCMD和BM的发病机制,我们研究了从病人肌肉活检和成肌细胞14]。UCMD病人显示骨骼肌的细胞凋亡率增加在活的有机体内和在原代成肌细胞培养14]。后者还显示一个可测量的分数改变线粒体(形态学改变从形状变化明显的肿胀)和一个潜在的线粒体功能障碍可以通过添加寡霉素透露,导致从病人只在线粒体去极化14]。与CsA在公开审判,我们五个病人代表了临床和分子各种ColVI肌肉疾病(15]。肌肉活检是发病前的治疗和细胞内线粒体去极化的与病人分离添加寡霉素后,确认在活的有机体内先前确定的潜在障碍的存在Col6a1^−−/老鼠和文化从UCMD患者(14]。CsA的一个月后口服剂量的5毫克/公斤/天,分两次,一个新的活组织检查是在侧的网站,和实验重复了15]。引人注目的是,线粒体膜电位响应寡霉素主要是标准化在所有患者的肌肉细胞,表明在本研究中使用的剂量,CsA达到药物活性浓度肌肉。此外,与正常样本捐助者,细胞凋亡是发现不了的,所有样本病人有相当多的凋亡细胞核在第一个切片,和治疗CsA大大减少细胞凋亡的发生在所有患者中,表明因果关系正常化的线粒体功能和减少细胞死亡。CsA治疗后,发现再生肌纤维数量增加,特别是著名的三个年轻的患者纳入研究。

的最后一个月试点试验治疗,三个孩子的父母要求继续治疗CsA。此外,我们可以招募与UCMD三个孩子。本研究的目的是评估长期治疗CsA的功效在六UCMD病人。

2。方法

2.1。研究人群

六个乌尔里希先天性肌肉萎缩症患者(UCMD),三个最初参加一个月的试点试验(15)和三个新,接受了CsA治疗。

2.2。试验设计

这是一个潜在的长期的、开放、noncomparative飞行员临床试验CsA UCMD患者的疗效。试验设计符合EMEA指南(16非常罕见的疾病的临床试验。

2.3。有效性的测量

试验的主要终点是增加肌肉力量和手持测力计测量。第二个端点CsA的效果是在肌肉的变化,运动机能,在UCMD患者的呼吸功能。在两个新病人,线粒体的生物端点是生物标志物的评价功能,细胞凋亡,再生在基线和CsA治疗3个月后。

肌肉力量测量的最大志愿等长收缩,与手持测功器(Cit工艺,格罗宁根、荷兰)确定megalimbs,复合分数造成肘部弯曲的双边肌肉力量的总和,手柄,膝盖弯曲,膝盖扩展。获得的测量标准技术和在标准位置是重复三次,和最好的成绩是指出17]。我们已经提供了证据的可靠性和灵敏度的技术(17,18),我们已经在临床试验中使用19]。

用力肺活量是衡量标准的呼吸测试肺活量计。

6分钟步行距离的测试执行的两个病人能够走(20.]。

肌肉萎缩症的运动功能评估功能功能分级量表评价(21]。

肌肉和脂肪进行评估,利用双能x线骨密度仪密度计(DXA对)。

身体成分进行测量与诺兰庄园XR-36测定仪(威斯康星州阿特金森堡诺兰庄园),仰卧位。DXA对身体成分的估计是基于three-compartment模型测量骨矿物质含量(BMC)、脂肪组织质量(英尺分),瘦肉组织(LTM)。全身骨矿含量(BMD)作为一个分数与同龄儿童的正常范围的(22]。身体脂肪也估计与身体质量指数(BMI)基于一个人的体重和身高(wt / ht²)。不同于成年人,解释BMI儿童,年龄和性别应该考虑考虑到身体脂肪的数量随着年龄的变化,女孩和男孩之间的不同23]。CDC符合增长图表女孩和男孩考虑这些差异,让翻译的BMI数量到百分位儿童或青少年的性别和年龄23]。

我们从健康的捐赠者和肌肉活检获得患者知情同意和批准后,费拉拉大学的伦理委员会。肌肉活检的胫骨前执行之前和之后的一个月的治疗在前三个病人15),3个月后全剂量治疗的最后两个病人。没有肌肉活检的患者4,病人2的兄弟姐妹,CsA的积极影响在活的有机体内已经显示。

肌肉活检的准备工作为细胞培养和免疫细胞化学被广泛描述(15]。特别是,早期再生纤维(24- - - - - -27)被检测到免疫荧光分析antidevelopmental肌凝蛋白重链(dMHC) (Novocastra克隆RNMy2/9D2,识别肌凝蛋白重链胚胎形式),和肌间线蛋白抗体15],坏死与酸性磷酸酶组织化学分析和免疫组织化学检测补充C5b-9沉积在肌肉纤维(28]。1000纤维再生的统计分析,从三个不同的地区,每个样本被认为活组织检查。

2.4。检测细胞凋亡

我们测量了肌肉活检的细胞凋亡率使用TUNEL方法(15]。Seven-micrometer-thick冻结部分是由肌肉活检,固定在50%丙酮/ 50%甲醇,TUNEL分析和加工利用Apoptag过氧化物酶原位细胞凋亡检测设备(Chemicon)。可视化的原子核是由染色与赫斯特33258年(σ)。TUNEL-positive核的数量确定在随机选择的领域用蔡司Axioplan显微镜(×40放大)配备了数码相机。对于每一个切片,30 - 85字段包含肌肉纤维和覆盖面积≅1 - 7毫米²被观察到。

2.5。线粒体膜电位检测

线粒体膜电位测量基于TMRM的积累(分子探针)29日]。原代细胞培养获得病人活检是镀在4 h手术活检的完全培养基+ 20% FCS在层粘连蛋白/ poly-L-lysine-coated盖玻片(BD实验室),并允许附加9-14 h和传播。中被替换为无血清DMEM补充10 nM TMRM 30分钟,和细胞荧光图像获得了一个奥林巴斯IX71 / IX51倒置显微镜,配备了氙气光源(75 W)这项工作照明和一个12位的数字CCD相机(Micromax,普林斯顿仪器)冷却。数据获取和分析使用细胞R软件(奥林巴斯)。荧光检测,568±25海里带通励磁和585 nm长传球排放过滤器设置。图像采集与使用40 x 100毫秒的曝光时间,1.3 NA油浸物镜(尼康)患者的细胞。细胞的程度,因此线粒体与电位探针加载是影响多药耐药性质膜泵的活动,由CsA抑制。使用这种药物进行治疗可能因此导致增加线粒体荧光可以被错误地解读为线粒体膜电位的增加。为了防止这工件和规范化加载条件下,在所有实验TMRM中补充了1.6μM CsH抑制多药耐药性泵,而不是20元(30.]。在每个实验中,线粒体被完全极化的4μ米的protonophore羰基氰化物p-trifluoromethoxy-phenyl腙。集群的几种线粒体被确认为感兴趣的区域,和字段不包含细胞作为背景。获得了连续的数字图像每2分钟。

2.6。研究药物

CsA (sandimmun neoral)在5毫克/公斤/死亡的剂量(一个月15]在第一个4患者和3个月的最后两个病人。初期(1 - 3个月)后,逐渐逐渐减少计划执行长期低剂量(1.25 3毫克/公斤/模)维持治疗(目标血药浓度> 200 ng / mL 2 h afterdosing)。每日剂量是分两次(早晚),饭后,溶解在一杯。CsA的血清浓度监测适应治疗剂量与目标C2水平250 - 500 ng / mL的范围(31日,32]。CsA-induced肾毒性很少开发使用剂量低于5毫克/公斤/天,一般是可逆的及时减少剂量的CsA或中止,如果血清肌酐水平增加> 25%以上患者的基线值(31日]。血液CsA水平,初始剂量和两个h afterdose no-pretreatment单克隆抗体类免疫分析法测定,affinity-column-mediated免疫测定(ACMIA)使用的测量维度Xpand-HM CsA在全血。

2.7。安全性评价

副作用是评估使用一个不良事件检查表,一个完整的血细胞计数,肝脏和肾脏功能测试,在基线和每1 - 3个月完成。

2.8。数据分析

数据分析与未配对的学生- - - - - -测试,和价值观被认为是重要的。描述性分析计算为每个病人和所有的病人。提出了连续变量的意思。

3所示。结果

病人的特点总结表1。ColVI水平是基于immunoistochemistry中描述原始引用(2,14),也包含更多细节关于继承的基因突变及其模式。三个病人参与最初的试点试验(P1, P2, P3)收到CsA 2到3.2年和三个新病人(表1 - 1.2年2)。UCMD患者有一个非常低的残留肌肉力量在基线,11%的人口在年龄/性别预测——匹配(33)(表2)。megalimbs从163.8 N 195.3 N的6个患者平均增长19% (值为0.0597,被认为是不太重要;5自由度)(表2)。患者5已经开始治疗前明显进展的障碍。他从未能够运行和失去了上升的能力从地板上6岁和7点爬楼梯。他的全身脂肪49%至6.5岁(精益质量12.7公斤),70%至9.1岁(精益质量8.6公斤)当他开始治疗,和79%(精益质量7.1千克)在最后一年后(表3)。如果我们考虑P5 nonresponder,其他五个病人,megalimbs从148.4 N增加到190.0 N平均增长28% (值0.0142,被认为是重要的;4自由度)。

运动机能与肌肉萎缩症功能分级量表评估保持不变在所有患者在治疗期间。

在治疗期间呼吸功能下降(表2)。除了病人3,他没有能够执行肺量测定法,因为有限的咬开,其他五个病人显示稳步下降(−7%)%预计在治疗期间用力肺活量。这两个古老的病人(P1和P2),在治疗已经FVC %的预测低于50%,分别下降到24%和32%,标志着在夜间血氧饱和度下降。此时(13岁和12),CsA治疗被打断,晚上他们收到无创机械通气。患者3有时间经验的症状慢性肺换气不足如疲劳、昼夜头痛,和损失的重量和原定了夜间血氧定量法评价和治疗。患者4有急性呼吸道感染和死于几天后加剧呼吸窘迫的胸部x光片显示支气管肺炎,膈麻痹性痴呆和严重胸部体积减少。尸检显示严重右心室肥大符合肺心病,广义的严重减少肌肉纤维,大多是被纤维组织取代脂肪和肝纤维化的隔膜和其他肌肉群(34]。这些结果的框架内的呼吸功能在UCMD [7]。

根据BMI(表3),2例(3和6)仍在减持的类别在基线和跟踪,一个病人(2)在健康体重类别在基线和搬到肥胖类别在跟踪,一个从超重肥胖患者(5),和2个病人(病人1和4)肥胖孕妇仍在基线和跟踪。然而,测定仪(表3)显示所有的患者已经在基线高体脂%,包括2减持。此外,治疗期间,精益质量下降了8.5%,而在5例脂肪量增加了37.6%(表3)。病人的BMD明显减少无论运动机能的水平:步行者和nonwalkers相同分数平均值(−3.8)。CsA的BMD不会受到治疗。

两个病人经历了hyrsutism(1和3)病人1中尤为明显。没有一个病人显示肾脏功能障碍的迹象。

符合文化从第一个3中的结果UCMD患者(15]CsA治疗1个月后,最后2例还表明,线粒体膜电位响应寡霉素主要是肌肉细胞(图的规范化1)。如果一个荧光阈值是任意设定在90%,与线粒体去极化转移细胞的数量从89%,91%,95%,59%,69%,45%,38%,41%,13%,和15% CsA对患者治疗前后1,2,3,5,6,分别从80.6%到30.4%(平均)。这些发现符合文化从UCMD患者的结果14)和纤维Col6a1^−−/老鼠(12),他们表明,在本研究中使用的剂量,CsA达到药物活性浓度肌肉。

治疗CsA的患者5和6,像在第一个3 UCMD患者(15),也显示出显著减少细胞凋亡的发生(图2)。细胞凋亡的发生率是评估在相同的活组织检查的材料用于线粒体功能的测量。与样本健康的捐赠者,细胞凋亡在哪里几乎检测不到每平方毫米(0.39±0.3)[15),样本病人5和6的凋亡细胞核每平方毫米(15.3±0.3),都大大降低了CsA治疗后每平方毫米(1.8±0.9),表明因果关系正常化的线粒体功能和减少细胞死亡。

治疗CsA之后,我们发现了一个显著数量的增加肌纤维发育肌凝蛋白重链阳性也显示弥漫性肌间线蛋白染色,特征信号的再生(27,35]。效果尤为突出的病人1,2,3,6。值得注意的是在病人6中,一个标志着再生仍明显活检后3个月(数字3和4)。寻找坏死纤维与酸性磷酸酶组织化学分析活动和anti-C5b9抗体是阴性的活检之前和之后的治疗除了基线活检的患者5一个独特的坏死纤维检测。

4所示。讨论

与UCMD五出了六个孩子,长期治疗CsA导致一个令人鼓舞的,统计上显著的增加肌肉力量的复合测量。然而,应该指出的是,改善肌肉力量不是改变电动机匹配的函数。与积极的影响相比四肢肌肉力量,CsA无法阻碍呼吸功能的逐步恶化。

正如我们已经预期[15),这种治疗的临床效果衰减疾病的进展和/或肌肉转化为更好的性能取决于多种因素,如肌肉萎缩和纤维化程度的治疗,和潜在的患者个体的肌肉再生。因此,肌肉功能的结果之间的差异和肌肉强度可能有不同的解释。因为在肌肉萎缩症只有少数功能分级量表分数,改进可能没有注意到,直到一个一致的改变发生36,37]。力量的基本措施,如等距最大随意收缩估计测力计,可能显示的趋势更早(36]。这是支持的经典研究Bohannon [38)评估抵抗运动的影响在肌萎缩性脊髓侧索硬化症患者。有18 14 45 - 65%的变化由手持测力法测量肌肉测试,但没有改变肌肉的力量。还应该认识到,治疗可能会有不同的反应在不同的相同的障碍患者(37]。鉴于UCMD的渐进性质,是预期的更有效的治疗,越早启动它(37当肌肉替换/变性那么严重。最年轻的治疗病人(病人6)实际上一个好的临床结果匹配的更分散再生肌肉活检在治疗后3个月。它也表明,治疗更有利于肌病患者贝特莱姆,轻度的疾病(34]。另一个可能性是,不同的肌肉可能对CsA的反应不同。选择性参与不同的肌肉的肌营养不良是一个一致的发现一再拒绝解释(39]。广义遗传基因表达的研究可能有助于解释为什么侮辱导致一致的模式的弱点影响一些肌肉比其他人更39),为什么同样的待遇有不同的影响在同一患者不同的肌肉(40]。特别是微分CsA对肢体与呼吸道肌肉力量的影响可能与肌肉参与的品位,更严重影响呼吸肌肉不容易反应。隔膜事实上是否则受损最严重的肌肉轻微影响Col6a1^−−/老鼠(11]。隔膜也总是UCMD患者的影响,导致早期和严重的呼吸衰竭,需要呼吸支持在第一或第二个十年的生活(7,10]。广义严重减少的肌肉纤维大多是被纤维组织取代隔膜尸检中发现的病人死亡后支气管肺炎(34]。呼吸功能不全的快速发展一直在UCMD患者(6,10,37]。回顾的过程中呼吸衰竭患者在13个UCMD表明FVC被发现异常在所有患者从6岁每年下降6.6%的预测(%)从6到10岁(7),69.2%的患者已经无创性夜间通风,和2例死于呼吸衰竭(7]。除了6 UCMD病人在这项研究中,4年轻的6年,无法进行肺量测定法,我们跟随其他4个病人,他们都FVC的逐步下降,一个死在11年期间并发呼吸道疾病,和其他3开始机械通风的平均年龄11.1(标准差2.8)。

在我们的病人,身体成分的评价给了一些对比的结果之间的BMI和测定仪。测定仪,所有患者明显过剩的脂肪量体重。身体脂肪58%的体重在基线(范围31 - 74)和跟踪达到72.2%(范围53% - -80%)。然而,计算符合的体重是这些患者的“健康体重”和2患者“减持”。很明显,因为BMI并不区分脂肪和肌肉,这不是正确的方式评估营养不良的病人的身体成分。此外,清楚地记录DXA对身体成分的完整和进步推翻UCMD %患者体内脂肪增加从60.4到72.6在治疗期间相比,只有不到30%的身体脂肪在正常儿童(23]。BMD显著减少在UCMD患者与健康对照组相比,这些差异BMD值和动态状态也没有联系,随着年龄增长,因为它被发现在杜氏肌萎缩症患者41]。

与CsA的使用相关的主要不良反应是肾脏功能障碍,高血压、头痛、肠胃失调,和hyrsutism /多毛症。我们的两个病人hyrsutism /多毛症,患者1中更明显,是一个女性。

生物研究的结果证实了之前的(15),证明用适量的治疗CsA的线粒体功能产生积极影响胶原蛋白VI肌肉疾病在活的有机体内和大大减少患者的肌肉细胞死亡的频率。肌纤维坏死几乎没有肌肉活检的UCMD患者治疗前后CsA,确认在UCMD稀缺坏死纤维(35,42]。在过去的两个病人像前315),我们发现,再生在基线非常有限,但显著增加CsA治疗3和1个月后,分别。有趣的是,一个奇特的再生模式被发现在晚期患者2 UCMD [35和肌病患者的贝特莱姆42]。日本作者(35)的基础上发展肌凝蛋白重链的缺失表现在肌纤维再生口径很小,表明胶原VI不足不仅会打扰骨骼肌纤维的机械完整性也不断再生或完全成熟的肌肉纤维至少在UCMD的高级阶段。他们还预计,这将是重要的确定缺乏表达发育肌凝蛋白重链UCMD患者是很常见的,特别是在患者在疾病的早期阶段35]。确实我们的研究结果表明,年轻患者UCMD表达发育重链的小纤维和再生的数量非常小的口径再生纤维表达发育重链和肌间线蛋白比基线CsA治疗后显著增加。我们的数据表明,在年轻患者UCMD,异常再生或成熟过程不影响老年患者的情况相比,CsA治疗是有效的纠正异常。乍一看,观察治疗CsA增加再生可能出现矛盾,因为再生应与肌肉纤维的死亡,这是降低当CsA存在。一个很有吸引力的解释15)是在第六胶原疾病,区分肌肉细胞正处于早期细胞凋亡与成熟的纤维,这种情况将会类似于无效的红细胞生成的许多人。通过减少无效的肌细胞生成,CsA能增加肌肉再生的整体效率,符合所有病人的反应。

CsA的潜在好处UCMD病人必须仔细权衡与免疫抑制的可能的风险。但是它应该提到,其他环孢菌素,像MeAla3EtVal4-cyclosporin (Debio 025),可能代表另一个CsA (43]。025年我们已经证明Debio nonimmunosuppressive环孢菌素,保留了PTP-desensitizing CsA的性质,CsA一样有效保护线粒体功能和防止细胞凋亡在肌肉文化UCMD患者(14),这一发现为治疗带来了胶原蛋白VI紊乱。

这个试验完成后,我们已经表明,肌肉病理Col6a1^−−/老鼠缺乏胶原蛋白VI是改善低蛋白饮食和基因和药物的方法,包括CsA,激活自噬(44,45]。现在以及以前的研究(12,14,15,44)正从胶原蛋白VI肌病的动物模型及其与药物的修正确认相同的肌病发病机制和疾病患者修正贝特莱姆和UCMD。

5。结论

澄清肌肉纤维损伤的致病机制的动物模型的胶原蛋白VI肌肉营养不良是允许快速转移实验治疗的人基于CsA抑制线粒体功能障碍。目前证明长期治疗CsA改善性能在特定肌肉5 6 UCMD病人和改善再生是一个令人鼓舞的结果,还有抑制剂的使用提出了一些希望和可能的其他肌肉疾病的治疗。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

l . Merlini p Sabatelli、p . Bonaldo和p·贝尔纳迪导致概念和设计;采集的数据;参与起草论文;最终批准的版本出版。a . Armaroli s Gnudi a . Angelin p . Grumati m . e . Michelini a . Ferlini和f . Gualandi导致采集的数据;修改手稿批判性;最终批准的版本出版。e·贝尔蒂尼n·m·Maraldi和a . Ferlini导致了概念和设计;修改论文批判;最终批准的版本出版。

确认

l . Merlini Telethon-UILDM助学金(GUP08006)和Bio-NMD格兰特(EC, 7日FP,建议没有。241665;http://www.bio-nmd.eu/,a Ferlini协调员)感激地承认。

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