在ALS D-Serine生产、退化和运输:方法论的关键作用

文摘

在哺乳动物系统中,D-serine也许是最具有生物活性分子酸描述。D-serine coagonist在门冬氨酸受体,受体的激活依赖于D-serine绑定。因为D-serine绑定显著增加谷氨酸受体的亲和力,它可以产生谷氨酸会没有任何变化本身。D-serine是双重的更高的脊髓mSOD1 (G93A)肌萎缩性侧索硬化症小鼠和丝氨酸消旋酶的删除(SR)所产生的酶D-serine,结果在早期出现症状,但与疾病进展的速度慢得多。本地化研究大脑内表明mSOD1和随后的胶质激活可能有助于改变SR和D-serine ALS。也退化D-serine和L-serine SR似乎是一个主要双向监管机构的免费丝氨酸的水平在活的有机体内。因此,准确和可重复的测量老D-serine了解其监管至关重要的几种方法测量D-serine已经工作,和重要的验证和标准化问题仍然没有解决。进一步洞察的胞内运输和组织划分D-serine在中枢神经系统将帮助理解D-serine在ALS的发病机制中的作用。

1。介绍

已知的分子酸存在于哺乳动物,D-serine似乎是最丰富的,当然最具有生物活性。激活谷氨酸NMDA受体(NMDA-Rs)需要绑定的NR2亚基及其coagonist D-serine NR1分子[1]。(co-agonist最初认为是甘氨酸,因此“甘氨酸的年长的命名法_B“网站。)不仅D-serine绑定所需受体激活,但也增加了谷氨酸受体的亲和力和调节受体功能通过减少受体脱敏,同时促进受体通过内化(营业额2]。鉴于NMDA-Rs在哺乳动物中枢神经系统的广泛分布,和大量的谷氨酸,这要求co-agonist可能代表一个大自然的安全机制,旨在防止过度刺激,会引起。因此,它有点讽刺意味的是,D-serine实际上可能在ALS excitotoxic神经元死亡的一个主要原因。由于它能够增加谷氨酸亲和力,D-serine可能产生excitotoxic运动神经元死亡即使没有谷氨酸水平的变化本身。

2。监管D-Serine在活的有机体内

尽管引人注目的进步D-serine以来的20年是首次发现在老鼠大脑3),生产机制、退化、运输、存储和释放D-serine保持神秘。丝氨酸消旋酶(SR)被认为是主要的内源性D-serine来源(使用L-serine作为底物),而分子酸氧化酶(DAO)通常被认为是退化的主要机制。否则直接视图大大蒙羞的是,老有α,beta-eliminase活动3-4-fold更有效(Kcat /公里)比其消旋酶活性(4]。即从L-serine SR D-serine产生,但同时降低D-serine和丙酮酸和氨L-serine不可逆转。据我们所知,没有其他哺乳动物的酶能够使一个产品,同时降低其产品和衬底。老指的是作为一个“奇怪”的酶是一种轻描淡写(5]。SR基因敲除小鼠最初创建检查D-serine在精神分裂症等疾病的作用6),但它可能是精神分裂症行为本身就是最好的例子就是由老。

检查反应机理的揭示了如何以及为什么老同时,本构消旋酶和eliminase活动。两种反应途径的SR共享相同的共轭负碳离子中级(上7,8]。是否继续外消旋反应L-serine D-serine,或脱氨基作用/消除(生产丙酮酸和氨)似乎取决于是否-哦Ser84捐赠一个质子的中间。虽然仍有可能,一些代数余子式或其他变构调制器可以切换从一个活动到另一个,所有这些因素确定日期增强活动大致相等(8]。Wolosker [9)证明在活的有机体内D-serine通过净化的生物合成丝氨酸消旋酶从60老鼠的大脑,包括低分子量代数余子式的艰苦的考试和活动调节器(9]。这最初是通过增加分离组织上层清液,其次是识别特定的因素(如磷酸pyridoxyl,毫克^{2 +}ATP,等等)。直到三年后,米兰达et al。(包括Wolosker)描述SR的eliminase活动(10),导致Wolosker备注在最近的一次审查,“如果消除反应并没有被发现后外消旋化,老会被归类为丝氨酸脱水酶酶”8]。SR-eliminase活动的重要性在活的有机体内将在稍后讨论。

3所示。SR淘汰赛D-Serine水平的影响在活的有机体内

至少有三个不同的SR敲除老鼠菌株被创建,每个使用不同的策略,但都针对相同的37 kD蛋白(6,11- - - - - -13]。在所有情况下,老D-serine水平基因敲除小鼠与野生型小鼠相比,要低,但不为零;在某些情况下非常重要的水平依然存在,尤其是在某些大脑区域和组织(6,11- - - - - -13]。SR基因敲除小鼠的首次报道,米亚et al。13D-serine水平),没有统计上显著的改变被认为在小脑或十其他周边器官和组织14,15]。不幸的是,脊髓并不在这个分析——迄今为止最全面的检查。Horio et al。14]确实发现D-serine在小脑和周边器官水平大约10倍低于其他大脑区域,表明大脑区域和器官水平较低的本构D-serine在很大程度上独立于老的值得注意的是小脑和脊髓水平非常类似人类,和10倍低于其他地区的中枢神经系统16]。因此,它是可能的,组织持续低水平的D-serine较少依赖SR-racemase活动为生产,至少在没有神经病理学。据我们所知,我们的研究是第一个测量脊髓的D-serine SR基因敲除小鼠(17]。在这个研究中,淘汰老对脊髓D-serine水平几乎没有影响。

4所示。SR淘汰赛和ALS D-Serine水平

突变对铜、锌超氧化物歧化酶(SOD1)首次报道在1993年人类ALS的原因,和G93A SOD1 SOD1突变是在老鼠两年后,产生第一ALS的小鼠模型。所有后续研究的角色在ALS D-serine利用这良好的模型。第一个测量D-serine脊髓是Sasabe et al。18)报道,D-serine高出1.5倍的脊髓肌萎缩性侧索硬化症小鼠;这些结果使用DAO-dependent化学发光测定D-serine(见部分12)。使用一种新型D-serine生物传感器(见部分11),我们发现绳D-serine水平2倍G93A老鼠比野生型(17),而D-serine G93A老鼠的大脑与野生型相同。部分删除SR水平显著降低,并完成SR淘汰赛进一步降低,但只有在野生型小鼠的正常水平(17]。因此,删除的SR逆转病理D-serine增加G93A老鼠,但不是基底D-serine。同样,敲出老老鼠没有表达mSOD1没有影响脊髓或大脑D-serine水平。线相比,D-serine G93A老鼠的大脑中并未增加。正在进行的工作的目的是更好的理解不同的D-serine池产生的确切位置,以及控制D-serine水平在不同的器官和组织。然而,迄今为止的研究成果显示脊髓D-serine绝对要求,但水平必须被小心地保持在一定限度内,也许是因为脊髓神经元敏感。为什么D-serine升高G93A ALS老鼠还不清楚,但可能是一个广义的结果胶质激活发生在这些老鼠(参见吗7进一步讨论)。

5。SR和ALS D-Serine表型的影响

Sasabe et al。18)第一次表明,主要从G93A分离小鼠脊髓神经元更容易NMDA-mediated毒性,D-serine-dependent的方式。这个结果帮助建立一个潜在的ALS D-serine和excitoxicity之间的联系。或许更重要的是,Sasabe等人显示一个明显增加D-serine A4V人类ALS病人,和两三个零星的ALS患者绳样品,这表明D-serine可能发挥作用在其他non-mSOD1-mediated ALS (18]。D-serine之间的关联度和小鼠肌萎缩性侧索硬化症(和人)的进一步工作。因此,我们着手研究一个更直接的因果关系跨越SR G93A小鼠基因敲除小鼠,以及治疗与D-serine G93A老鼠,检查D-serine对疾病的影响动力学。

很意外,我们发现SR酶减少50% (SR + /−: G93A),这降低了D-serine(上面提到的),导致疾病发作早些时候13天(17]。然而,一旦开始运动神经元疾病的症状,疾病进展是放缓,这些老鼠住大约10天的时间比老G93A同窝出生的正常表达。当生存方面的检查间隔(从发病到endstage)——衡量疾病率progression-the SR + /−: G93A老鼠住在发病后的60.5天,相对于38.8天治疗G93A老鼠。这种效应发生和发展更戏剧性G93A小鼠完整的SR淘汰赛,这些老鼠显示出现在61天的年龄,和endstage推迟到146天的年龄。在这种情况下(SR淘汰赛)竞争,生存时间间隔是85.8天,进展非常缓慢,老鼠比正常情况更长的一段时间。

治疗G93A小鼠D-serine进行相反的想法(SR淘汰赛)会影响观察。尽管这些期望,治疗G93A发生前症状小鼠D-serine (pre-dissolved chow)有一个定性相似的效果与SR淘汰赛;早期的发病和进展缓慢。D-serine在正常治疗发病年龄(90天)有一个“纯”治疗效果;发展为endstage放缓了19天。这些结果开始的矛盾的本质意义只有当绳D-serine水平检查。正如前面提到的,未经处理的G93A小鼠脊髓D-serine 2倍水平。部分敲除SR降低D-serine水平仅略高于野生型小鼠,并完成SR淘汰赛D-serine水平下降更多,与野生型老鼠。奇怪的是,D-serine治疗,presymptomatically或发病,几乎相同的效果在D-serine水平SR击倒,也就是说,D-serine在绳子下降到野生型老鼠。此外,这种效应只有在脊髓,随着D-serine-treated老鼠的大脑显示增加的1.5倍(汤普森,Marecki和乌鸦,未发表)。 Thus, D-serine added to chow was crossing the blood brain barrier but was somehow being handled differently in cord than in brain.

6。矛盾的结果G93A老鼠

自然产生了这样的问题:如何D-serine治疗产生相同的表型变化,导致降低脊髓D-serine SR击倒?最简单的答案是,D-serine退化不知怎么被诱导尤其是脊髓。然而,在刀被认为没有显著变化,这可能解释这种。因此,答案一定是藏在别的什么地方。唯一的其他已知D-serine处理蛋白质是transporters-primarily称为aspartate-serine-cysteine-1或Asc-1之一。(需要注意的是,运输车命名尚未标准化,和“ASC”——“ASCT”海尔转运蛋白存在文献中以不同的名字)。Alanine-serine-cysteine转运体1 (Asc-1)是一个sodium-independent D-serine[运输车与相对高度的亲和力19,20.]。sodium-dependent运输车类似于b型alanine-serine-cysteine运输车,称为ASCT,亲和力较低L -和D-serine和一直在观察星形胶质细胞19- - - - - -21]。Asc-1首次发现在突触前神经元,它占用D-serine突触,从而终止D-serine神经传递(20.]。在我们的研究中,发现Asc-1调节在D-serine-treated G93A鼠标脊髓,但不是在他们的大脑17]。因此,看起来似乎D-serine可能局部不同的细胞/隔间由于D-serine治疗。然而,尽管D-serine的组织位置的变化可能会改变神经传递,可能会引起位置的变化本身不能占D-serine的整线水平较低,除非这一变化也伴随着退化。因此,我们推断,SR的eliminase活动本身负责D-serine退化,而Asc-1代理将D-serine回SR最高的细胞。由赫尔曼Wolosker最近的一个评论,他们首先纯化和SR特征,提供了一些额外的洞察力(8]。

7所示。修改视图的本地化SR和D-Serine:对ALS和其他疾病的影响条件

几年来,免疫荧光研究,基于colocalization SR的胶质标记,强烈建议SR主要被发现在星形胶质细胞和小胶质细胞22- - - - - -24]。然而,一些研究表明,大脑的神经元在一些地区如大脑皮层和后脑glutamatergic神经元也包含自己的SR(来源25,26]。最近的研究,其中一个使用一个老敲除小鼠作为对照(13),以及一个原位杂交研究[27老),建议主要是在神经元,不是神经胶质8]。在任何情况下,神经元似乎不能使衬底L-serine和依赖于星形胶质细胞的来源L-serine为了合成D-serine新创(28]。许多可以和好如果我们假设有差异的结果老神经胶质通常不会表达,但存在ALS-associated SOD1突变体诱导SR表达由于病理激活。这可能占一个重要的发现,Sasabe等人在孤立的小胶质细胞的转染G93A mSOD1导致明显的表达SR (18]。这种感应也占SR蛋白的增加(18和D-serine出现在肌萎缩性侧索硬化症小鼠脊髓17,18),甚至可能降低线D-serine水平D-serine治疗后(17]。

SR和D-serine的位置,在正常和病理条件下,不仅是重要的提高生产和潜在的会,但也通过SR-eliminase D-serine监管水平的活动。Wolosker使一个令人信服的论点SR-eliminase最终胜出的生产和降低D-serine并发战斗(8]。如果D-serine仍在同一隔间SR-an酶降解D-serine和L-serine-then D-serine最终会被降解。如果SR在神经元,D-serine和L-serine最终会退化,需要补给的L-serine从神经胶质28]。转运蛋白像Asc-1法案保护D-serine水平由SR-eliminase身体分离神经元。然而,如果SR表达的激活神经胶质在病理条件下如ALS,然后Asc-like运输车可以做到相反——“可以将有助于降低D-serine接近SR-eliminase神经胶质。现在才被发现和其他Asc-like运输车,基于冲突的文献关于SR通常表达精确,画任何绝对的结论还为时过早D-serine运输车总体监管的角色,但显然他们可能会终止正常的关键神经传递,并会引起。在任何情况下,基本上可以肯定的是,老中起关键作用的整体监管D-serine,在担任制片人和驱逐舰。

8。分子酸氧化酶(DAO)

因为分子氧化酶(DAO)已经存在了几十年,它已经被视为默认“排毒”分子酸的机制。在哺乳动物中,刀相对特异性的,作用于分子至少7酸基板(29日- - - - - -31日]。然而,除了D-serine,已知分子酸存在于哺乳动物系统似乎没有特别有毒(32]。其他证据反驳道唯一的机制调节D-serine级别:(1)缺乏病理表型或代偿变化小鼠缺乏刀(5)和(2)没有刀在前脑,D-serine存在在相对较高的水平(33,34]。实际上,仔细描述一种天然刀敲除老鼠应变表明,刀的主要目的是降低分子酸,无论从内部产生的,从饮食、获得或肠道细菌作用的酮酸,可以代谢能源(35]。即刀可能获得有用的化学能量,否则“惰性”氨基酸,尽可能多的解毒。

9。刀ALS的突变

2010年,米切尔等人发现了一个突变(R199W)刀和报道这个突变DAO之间有高度的相关性和ALS在一个家庭36]。因为突变被发现废除刀活动,直接推理是突变会导致增加excitotoxic神经元死亡通过过度D-serine积累。NSC34细胞转染和突变刀并揭示重要的毒性,但是D-serine水平细胞没有测量。因此,没有直接相关性D-serine浓度高(大概)和细胞毒性。此外,增加ubiquitinated蛋白质总量的转染细胞。因此,虽然这刀突变在ALS D-serine-mediated毒性的概念是一致的,这还有待观察脊髓D-serine水平确实改变了,而不是突变刀仅仅是拥有一个折叠和聚集倾向增加。

10。测量D-Serine

进一步细化的角色D-serine在健康和疾病,事实上所有相关生物分子酸,将取决于严格的评估,并可能修改和标准化,不同的测量技术和方法。一些不一致的结果报道到目前为止可能是由于比较不同的方法,这可能包含工件;尤其如此,当间接、二次化验工作,如常用的基于dao D-serine化学发光测定。老因为这个分析是常用的测量活动,任何工件的影响超越简单的D-serine组织水平本身。

高效液相色谱法分析D-serine L-serine,基于手性衍生荧光物种,显然是最敏感的和直接的方式识别和量化这些低分子量(质量= 87.1)氨基酸。由于丝氨酸对映体都是这么小的,简单的分子,甚至手性高效液相色谱法列不能轻易解决。此外,他们缺乏任何类型的发色团,这将允许紫外或荧光检测。我们使用了现有的衍生化技术涉及o-phthalaldehyde和boc-L-cysteine产生荧光,手性iso-indole [37)和修改缓冲/梯度系统(使用醋酸钠和乙腈)这D-serine L-serine可以解决超过两分钟(汤普森et al .,未发表)。通过使用真实D-serine标准添加到组织匀浆,加上刀预处理去除D-serine(和其他分子酸),我们能够测量D-serine老鼠组织和验证基于新颖的生物传感器(另一种方法17]。根据我们的经验,我们强烈的感受到,高效液相色谱法应该保持等的黄金标准分析,应该用于验证任何和所有其他方法,特别是间接测量二次酶反应产品的化验,如过氧化氢或丙酮酸。

11。D-Serine生物传感器

D-serine上表演时,刀产生hydroxypyruvate,氨,和H₂O₂。H₂O₂是一个非常有用的产品从生化分析的角度来看,它可以测量在很多方面,包括氧化的电化学探针来产生电流。通过封装刀从酵母获得物种红酵母股薄肌——比哺乳动物刀更稳定,具有较高的特异性和亲和力D-serine [38)之内的电化学探针,D-serine可以有选择地反复量化非常迅速。免费D-serine扩散进入探测器,由酵母刀产生H退化₂O₂,反过来,金属探测器被氧化,产生电流正比于D-serine浓度的解决方案(39]。因为H₂O₂生物传感器中产生,在近距离(< 100微米)的电化学探针,H问题₂O₂耗散或降解消除。此外,任何干扰的存在(扩散)的物质,如H₂O₂由其他反应中,很容易通过使用类似的生物传感器控制含有白蛋白而不是刀。与大多数基于dao的测量D-serine,生物传感器提供了一种快速测量不依赖于完整的消费所有D-serine礼物。的确,D-serine消耗的量可以忽略不计,这样重复测量相同的示例可以在很短的时间。因为生产的H₂O₂附近的电化学探针达到稳态克莱夫非常迅速一些生物传感器提供了重复测量实时。

12。基于dao D-Serine化学发光测定

最常用的方法,总D-serine生物样品或测量在体外反应是基于DAO-mediated退化在场D-serine hydroxypyruvate和H₂O₂,其次是测量总累积的H₂O₂通过辣根过氧化物酶(合)介导的氧化鲁米诺(8,18,40]。与化合物如dihydrofluorescein或dihydrorhodamine,氧化稳定荧光物种(荧光素和罗丹明、职责),发光氨氧化产生瞬态化学发光信号,必须收集和实时量化光度计。虽然可以精确量化化学发光,这个试验有其他问题存在,这使它的问题。首先,除非使用酵母刀,D-serine几乎没有特异性,因此所有在场分子酸会被测量。而其他分子酸的贡献在人类组织样本的老鼠可能会很小,其范围可以从样品样本。

其次,准确测量D-serine DAO /合+鲁米诺化学发光测定要求刀反应去完成,所有在场的D-serine消费——过程会花费大量的时间给大多数刀酶的高公里D-serine [41,42]。除非非常小心控制,不可能确保DAO / D-serine反应已经完成,即使有,也同样很难知道是否所有的H₂O₂在漫长的孵化生产仍然完好无损,也就是说,它与D-serine积累的化学计量的消费,而不是反应与其他组件或退化。微量的污染物或其他氧化物酶(过氧化氢酶),氧化还原活性金属,或还原剂可以完全无效的结果,就像其他不相关的反应,可以产生H₂O₂之前,期间或延长培养时间,导致D-serine高估了。经常这样的事实,这是一个次要决定化验是蒙面当调查人员图结果的“D-serine浓度”(y设在)时,事实上,H₂O₂被测物质。在大多数情况下,D-serine浓度只是推断是化学计量的相当于H₂O₂,没有雇佣证明所需的控制化学计量。关于控制,这种分析必须采用双重标准curves-one正宗的H₂O₂和第二个D-serine(加上DAO)补充道。只有这样才能真正的化学计量学进行评估。大多数账户在文献中没有提到这样的控制。

13。化学发光分析SR的测量活动

刀的缺点/合+鲁米诺化学发光测定D-serine略管理为目的的测量总D-serine内容deproteinated组织或细胞溶解产物样本。然而,当用于测定酶活性,额外的问题上发挥作用,乏味的三步相关协议,商业与D-serine L-serine衬底,污染和SR-eliminase竞争活动。从本质上(三个不同的酶步骤),SR /刀/合+鲁米诺化学发光测定不适合测量多个时间点intervals-something建立真正的酶率是至关重要的,也就是说,D-serine浓度随时间线性增长。整除与L-serine SR反应必须在时间间隔,淬火以某种方式阻止SR反应,然后孵化与刀长时间间隔,以确保完成D-serine退化,紧随其后的是添加合加鲁米诺测量累积H₂O₂。当用来测量SR(消旋酶)活动,这种分析通常涉及单个端点决定积累的H₂O₂,不考虑是否生产H₂O₂是线性的,是否无关的H₂O₂退化可能发生,或者是否有积累与D-serine化学计量的,多少H₂O₂可能是出现在时间为零。不管有多老的化验,多个时间点来确定线性至关重要,或非线性程度和原因。同样,任何试验完全基于D-serine将反映净生产的D-serine SR,消旋酶的活动所产生的光的量-被SR eliminase活动(4,43]。

14。化学发光分析的验证

化学发光分析的准确性和可靠性只能由同时进行高效液相色谱分析在同一反应整除和测量D-serine生产和L-serine消费。同时,标准曲线必须使用真实的H₂O₂所以,D-serine之间真正的化学计量学和H₂O₂,在特定的条件下,可以确定。在理想的情况下,丙酮酸的分析也应该做在同一整除。通过这种方式,不仅可以在化学发光分析中潜在的工件被发现,但SR-racemase eliminase活动的相对贡献可以量化。我们进行这样的比较,发现DAO /合+鲁米诺化学发光分析高估消旋酶活动的SR 10倍或更高(Marecki,汤普森和乌鸦,手稿准备)。这似乎是由于基底水平高(在时刻0)的H₂O₂和/或生产的H₂O₂孵化期间从其他来源。如果时间点间隔收集和分析,包括时间为零,在存在和没有刀,然后这些构件可以控制。然而,目前还不清楚从许多文献账户这样的控制工作。因此,许多文献中的值的可靠性不能准确评估。

15。Chemiluminecsent试验来评估SR动力学

不幸的是,许多老的动力学特征在体外,从组织和酶纯化重组酶,都涉及这个问题的化学发光分析的使用。此外,由于实际的限制做多个时间点,它通常被用作一个端点类型分析。即L-serine老被添加到反应混合物,反应可以跑30 - 60分钟,然后熄灭,之后按顺序刀及其代数余子式(时尚),然后合+鲁米诺在一个端点样本。然后作出以下假设:(1)由SR-racemase D-serine生产随时间线性段采用(SR-eliminase活动通常是完全忽略),(2)D-serine退化的刀完成,(3)的H₂O₂正好等于D-serine形成,(4),H₂O₂出席时间零,(5)H₂O₂积累并不是影响退化或从其他来源的生产。如果这些假设不正确,那么D-serine生产速度,对SR和动力学常数的计算,是错误的。问题在于,检查单个端点时,是不可能来评估这些假设的有效性。酶动力学的一个基本公理是产品必须增加随着时间的推移,一个必须的计算基于线性区域符合一级动力学控制酶的行为,所谓的“初始利率”。至少,酶活性在被测量的时间必须是已知的;最后一个无法衡量的东西,简单地认为价值开始时确实是零个或介于两者之间的变化是线性的。在许多情况下,涉及使用化学发光测定,调查人员报告,高效液相色谱法是用于验证结果,但色谱和控制通常不显示。即使色谱图所示,它常常是不清楚整个试验验证,妥善控制,还是D-serine只是在几个端点测量样品展示可行性。

16。SR通过丙酮酸生产的试验

考虑到上述分析的问题,有些研究人员在很大程度上避免了他们通过测量通过丙酮酸生产(SR活动18,44- - - - - -46]。当然,这是衡量SR eliminase活动。当作为一个通用的测量“SR活动”的组织或细胞,使用L-serine衬底避免任何干涉的刀,但不是SR-racemase活动。如果D-serine作为衬底,那么SR-racemase活动避免,但必须采取控制潜在的干涉刀。这很容易通过使用DAO抑制剂如苯甲酸(17]。当然,污染刀不会分析问题时的一个老重组应该指出,虽然DAO / D-serine反应的产物是hydroxypyruvate报道,我们和其他人发现,耦合分析用人LDH和NADH作品很好衡量“丙酮酸”的产品。同时,derivatizing代理与丙酮酸反应,以及商业丙酮酸测定工具,所有似乎工作得很好衡量DAO / D-serine产品。因此,要么hydroxypyruvate也有类似的反应活性丙酮酸(包括作为衬底LDH)或者自发脱水给丙酮酸。

17所示。“免费”D-Serine的基于抗体的测定

许多调查人员使用一种基于抗体的技术可视化D-serine细胞/组织定位研究(免疫组织化学)和半定量的比较18,25]。彻底的缺乏抗体描述最近的出版物中促使问题如何选择抗体对于这样一个小分子,以及如何小,可溶性分子仍将细胞内和组织permeabilized允许大量的抗体分子进入。这些问题在很大程度上回答时很明显提高抗体的戊二醛加合物D-serine,不要自由氨基酸。因此,在glutaraldehyde-fixed细胞和组织,抗体D-serine可视化的似乎是一个有用的方法,在理论上和实践上都有。目前还不太清楚抗体是否工作比戊二醛固定液其他工作时,作为结果D-serine加合物不会是相同的。同时,使用这种抗体量化D-serine一样受到限制的任何类型的荧光免疫抗体技术。,小心地使用一种基于抗体的技术可以提供半定量的比较数据,但不能依赖提供绝对定量或微小的变化。

D-serine的基于抗体的测定的真正价值在于它确定细胞/组织定位和能力,当使用这种方式,可以提供有价值的信息,将会失去与其他技术,依靠组织均匀化。的确,没有测量D-serine在整个组织匀浆可以检测局部浓度的变化可能是非常重要的,例如,突触D-serine的变化。这意味着2倍的变化总脊髓D-serine,看到G93A老鼠(17,18),在本地可以转化为更大的变化。这同样适用于蛋白表达的变化,如Asc-1运输车在D-serine-treated老鼠17]或SR蛋白的变化当存在SOD1基因突变(18]。也许最好的希望未来D-serine浓度测量的地方,甚至在活的动物,在于D-serine生物传感器的进一步细化。

18岁。摘要和结论

D-serine似乎是一个重要的球员的出现和传播mSOD1-mediated ALS和潜在的零星的肌萎缩性侧索硬化症。这一事实外生D-serine治疗SR敲除小鼠在G93A产生类似的变化,无论是从表型和降低绳D-serine水平,强烈表明,SR的影响是通过其介导的影响D-serine水平。还有待观察是否通过一个如此excitotoxic机制,但迄今为止的研究成果是一致的前提。虽然机制尚不清楚,很明显,D-serine水平增加了G93A mSOD1,也许通过广义神经胶质和由此产生的感应激活SR表达。鉴于现在已知,D-serine很可能被证明是一个关键在ALS胶质激活和运动神经元死亡之间的联系,也就是说,它可能难以捉摸的中介glial-mediated non-cell-autonomous神经元死亡。在任何情况下,生产、储存、释放,运输,和退化D-serine之前都必须更好地理解其完整的角色在肌萎缩性侧索硬化症或其他神经退行性疾病可以完全阐明。在这方面,验证和标准化的重要性的方法测量D-serine和SR的竞争活动不能被夸大。之前,老问题的描述将挥之不去。在任何情况下,SR基因敲除小鼠的证据表明,它并不是唯一的D-serine来源哺乳动物。正在进行的工作在我们的实验室,与老基因敲除小鼠(有或没有G93A mSOD1转基因)和重组SR在体外旨在了解SR-racemase生产的作用,降解D-serine SR-eliminase,以及其他D-serine的潜在来源。

在证明
最近的一项研究Sasabe et al。47为DAO)表明一个重要的角色在调节D-serine水平G93A老鼠。测量脊髓刀活动的所有六个鼠标表型在我们的研究中(17)无显著差异。虽然这表明刀不是G93A D-serine水平的主要决定因素的老鼠,测量都是在整个声带endstage疾病。因此,它是可能的,可以获得不同的结果与选择(腰椎)线区域在不同的年龄。免疫组织化学数据从2012年Sasabe等人研究并提供证据nonneuronal表达式的SR G93A老鼠,老一致认为由胶质激活诱导。

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