文摘

提到痛觉过敏引发的躯体疼痛是常见的炎症性肠病(IBD)患者。据报道,发芽的交感神经纤维背根神经节(DGR)和神经源性炎症相关的神经性疼痛,神经元的兴奋性,传入。这项研究的目的是探讨电针刺激的潜力和机制(EA)在Zusanli (ST36)结肠炎症和痛觉过敏的干预。Sprague-Dawley (SD)随机分为四组,包括控制、模型、EA、sham-EA。我们的调查结果表明EA治疗显著减毒葡聚糖硫酸酯钠- (DSS)诱导结肠直肠损伤和炎性细胞因子分泌,如肿瘤坏死因子-α,il - 1β、PGE2和il - 6的分泌。EA还抑制机械和热疼痛结肠炎大鼠的糖甙。重要的是,EA有效废除DSS的促进效应在侧腰背根神经节sympathetic-sensory 6(16种)耦合,体现为发芽的酪氨酸羟化酶(TH)积极的交感神经纤维的感觉神经元和colocalization和降钙素相关基因肽(CGRP怎样)。此外,EA在Zusanli (ST36)激活神经源性炎症,表现为下降的P物质(SP)的表达,透明质酸(HA)、缓激肽(BK)和环前列腺素(PGI2)结肠炎大鼠皮肤组织相应的16种打钻。机械,EA治疗减少了激活TRPV1 / CGRP怎样,兵,TLR4信号通路在16种结肠炎大鼠DRG。综上所述,我们认为EA治疗改善结肠炎症和痛觉过敏,可能通过抑制交感神经纤维的萌芽到16种DGR和神经源性炎症处于待发状态通过TRPV1 / CGRP怎样,ERK和TLR4信号通路。

1。介绍

炎症性肠病(IBD)是一种慢性的、危及生命的炎性疾病影响胃肠病的系统,包括克罗恩病(CD)和溃疡性结肠炎(UC) [1,2]。病因和发病机理和炎症性肠病(IBD)仍然没有被完全了解(3]。研究已经证实,痛觉过敏引起的炎症性肠病密切相关sympathetic-sensory引发的超敏反应耦合在skin-dorsal根神经节(DRG) [4,5]。一项研究表明交感神经萌芽在DRG结肠炎模型(6]。另一方面,神经源性炎症的重要机制牵涉性痛引起的内脏病变在身体表面(7]。的激活和释放介质,如P物质(SP)从无髓鞘的传入神经末梢引起小静脉血管扩张和通透性增加,导致血浆外渗和水肿等炎症反应(8,9]。因此,监管sympathetic-sensory耦合和神经源性炎症为内脏痛觉过敏的治疗提供了一个新的想法。

已经建立在传统中医穴位,对疾病诊断和疗效之间的关系的一个重要位置子午线和内脏器官(10,11]。感觉异常的穴位是身体的相应部位表面通过神经性反应参与身体的病理过程(12]。最近,研究报道,神经源性炎症网站被发现的背干皮肤的肝损伤大鼠模型中,这是与穴位的位置(13]。与此同时,电针刺激在神经源性斑点减少胆管ligation-induced肝损伤(13]。同样,我们先前的研究发现,结肠炎大鼠表现出二级痛觉过敏,伴随着敏化现象在Zusanli (ST36)穴位。电针刺激对Zusanli (ST36)穴位显著降低结肠病变,解除了体细胞牵涉性痛的结肠炎大鼠(14]。然而,这种现象的潜在机制的电针刺激Zusanli (ST36)减轻结肠炎和疼痛过敏还没有被研究过。

在这项研究中,我们探讨电针刺激是否在Zusanli (ST36)抑制DRG sympathetic-sensory耦合和表面神经源性炎症反应,从而减少结肠病变和消除疼痛在结肠炎大鼠模型。此外,我们还研究电针刺激的分子机制Zusanli (ST36)治疗结肠炎诊断相关规范sympathetic-sensory耦合和神经源性炎症。

2。材料和方法

2.1。动物治疗

所有的实验都是根据伦理委员会批准机构动物福利和使用委员会Acupuncture-Moxibustion研究所中国中医科学院(没有。20170313)。32 Sprague-Dawley (SD)雄性老鼠(SPF级,12周,180 - 200 g)在成都购买漂亮的实验动物有限公司有限公司(成都、四川;SCXY(栓)2020 - 034)。的饲养环境 ,相对湿度 ,和光明/黑暗12 h循环。SD大鼠被允许自由吃喝。SD大鼠随机分为4组( ),即对照组、结肠炎模型组,Zusanli电针刺激(Zusanli-EA)集团和虚假的电针刺激(sham-EA)组。结肠炎模型组,老鼠强饲法为5% ( )葡聚糖硫酸酯钠(DSS)生理盐水(MP生物医学,圣安娜,加利福尼亚,美国)为4天(50毫升/ d)如前所述15,16]。老鼠的状态监测使用疾病活动指数(DAI) [17]。与此同时,对照组老鼠强饲法同等体积的生理盐水。Zusanli-EA组,电针刺激后立即被吸入异氟烷麻醉下进行建模。老鼠接受了电针刺激治疗Zusanli穴位(ST36,两国)使用1.0英寸的金银丝细工针( ,Huatuo品牌,深度约7毫米)。电针刺激治疗设备(G6805-2A Huatuo品牌)是来自苏州医疗器械厂,中国。电针刺激参数与2/100 Hz稀释波,1 mA,强度和执行15分钟,每天一次,连续21天如前所述[18]。sham-EA集团老鼠吸入麻醉的3 - 4%异氟烷,然后接受假假穴位电针刺激以务实的安慰剂针。大鼠的神经功能和戴分数每周进行测试。在抓捕非法政府的结束,所有老鼠用1%戊巴比妥钠麻醉(50毫克/公斤)和安乐死。结肠组织,血清,侧腰6(16种)背根神经节(DRG),和附近的皮肤被移除和保持在-80°C进行后续分析。流动的主体通过图中所描述的实验过程1(一)。

2.2。测量热敏感

热刺激计bme - 410 c(天津伯恩科技有限公司有限公司,天津,中国)是用于检测热延迟撤军(TWL)大鼠后爪根据公布的方法(19]。短暂,老鼠被放置在热板仪(52°C),和paw-withdrawal延迟定义为从脚接触热板仪,直到后爪子舔(s)。

2.3。测量的机械灵敏度

bme - 404电气机械镇痛仪(中国医学科学院生物医学工程研究所、天津、中国)被用来测量机械撤出阈值(MWT)大鼠后爪。不锈钢细丝直径(0.6毫米)被用来刺激足底留给后爪表面压力。收回爪子反应发生时,力(g)是自动记录。

2.4。苏木精和伊红染色())

结肠组织收集和固定在4%多聚甲醛一夜之间,处理,嵌入在石蜡。组织部分被苏木精和伊红染色())来观察病变的程度和炎性细胞浸润在10倍和400倍放大光学显微镜(奥林巴斯BH2、东京、日本)。

2.5。透射电子显微镜(TEM)

结肠组织病理变化的透射电镜的观察。短暂,结肠组织与3%戊二醛固定15分钟和四氧化锇1% 2 h后缀在4°C。结肠组织被孵化与丙酮2 h和嵌入式Ep812树脂。块与徕卡EM UC7切片,和样品部分与柠檬酸acetate-lead铀染色。jem - 1400 flash透射电子显微镜(JEOL;日本东京)是用于检查。

2.6。免疫组织化学染色(包含IHC)

石蜡块分段在4μm。包含IHC染色检测执行5 -羟色胺(5)表达在皮肤组织对应于老鼠的16种DRG IHC协议根据指令。5 -抗体购自北京中山金桥生物技术有限公司有限公司(bs - 1126 r,北京,中国;1/100)。包含IHC图像捕获用数码相机三目的显微镜摄像系统(BA400Digital Motic仪器,Inc .,巴尔的摩,医学博士,美国)。图像量化使用光环软件执行(籼稻实验室;阿尔伯克基纳米)。

2.7。免疫荧光染色(如果)

石蜡的16种DRG脱蜡和水化。部分被孵化QuickBlock™阻断缓冲区(Beyotime生物科技、江苏、中国、P0260)在室温下为30分钟。然后,部分被孵化与降钙素相关基因肽(CGRP怎样)抗体(bs - 0791 r,北京Bosen生物科技有限公司有限公司北京,中国,1/100),酪氨酸羟化酶(TH)抗体(ab129991 Abcam;1/100),或NeuN (ab129991 Abcam;1/100)抗体在一夜之间在4°C和洗3次磷酸盐(PBS, zli - 9062,北京中山金桥生物技术有限公司,有限公司,北京,中国)。然后,DAPI (zli - 9557;北京中山金桥生物技术有限公司,北京,中国)添加一滴一滴地为5分钟的部分。荧光显微镜下观察染色Olyvia(奥林巴斯、东京、日本)在100 x 400 x的放大。图像处理与图像进行J(美国国立卫生研究院的贝塞斯达,MA)。

2.8。免疫印迹分析

16种DRG组织治疗使用缓冲区里帕(信号技术,Inc .)。蛋白质的浓度是由BCA试剂盒(Sigma-Aldrich;默克公司)。总蛋白(30μg /样本)是通过10% sds - page分离。然后,分离蛋白质转移到硝化纤维膜。膜被封锁的5%脱脂奶粉在一夜之间在4°C和孵化与相应的蛋白抗体。然后,膜与Tris-buffered盐水洗/ 0.1%渐变(TBST)和1.5小时孵化合山羊anti-Rabbit免疫球蛋白。乐队使用ECL可视化系统(亲和力生物科学,辛辛那提,俄亥俄州,美国),和β肌动蛋白是作为内部控制。使用数量的净光密度测量一个软件(Bio-Rad)。抗体信息用于免疫印迹分析如表所示1。

2.9。检测血清中炎性细胞因子的水平,可以引起皮肤组织的物质

白介素1 (IL)的水平β、白介素、肿瘤坏死因子(TNF)α、前列腺素E2 (PGE2)和il - 10在大鼠血清和P物质(SP)、透明质酸(HA)、缓激肽(BK)和环前列腺素(PGI2)在大鼠皮肤组织(对应于16种DRG)被量化检测酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(ZhuoCai生物技术,中国)根据制造商的指示。井测定的吸光度与微型板块阅读器(SpectraMAX Plus384,美国)在450 nm波长计算样品浓度。

2.10。统计分析

数据被表示为 。使用SPSS 20.0统计分析(IBM公司)。单向方差分析(方差分析)与图基的事后测试和学生的 - - - - - -测试是用于统计分析。差异与 被认为是显示统计学意义。

3所示。结果

3.1。EA减毒结肠炎严重程度和体细胞DSS-Induced结肠炎大鼠痛觉过敏

戴得分进行每周评估结肠炎的进展。戴与控制相比,得分显著增加DSS治疗后7天(图1 (b))。EA治疗戴不断降低了分数。戴天11和14,分数与sham-EA组相比显著降低(图1 (b))。同时,结肠炎大鼠显示低TWL和参与者在天11和14日(数据由EA显著纠正治疗1 (c)和1 (d))。这些结果表明,EA的治疗效果在Zusanli结肠炎大鼠的早期阶段是显著的。此外,他走时染色的结果显示,模型组结肠黏膜受损严重,大量的浸润炎症细胞与对照组相比(图2(一个))。发现EA组表现出显著降低粘膜损伤和炎症细胞的浸润而sham-EA组(图2(一个))。与此同时,我们还利用TEM观察结肠组织的病理变化。与控制、结肠炎大鼠表现出严重的结肠损伤,严重损害出现包括透壁的浸润的炎症细胞,坏死,隐窝和破坏,巨大的透壁的炎症细胞浸润,增厚的结肠墙(图2 (b))。EA治疗显著提高DSS-induced结肠组织损伤与sham-EA组(图2 (b))。这些数据表明,EA治疗缓解DSS-induced结肠损伤和过敏性结肠炎大鼠。

3.2。EA的减毒Sympathetic-Sensory耦合16种DSS-Induced结肠炎大鼠DRG

与对照组相比,TH-positive交感神经纤维的分布在DRG增加21 d后DSS诱导(数字3(一个)和3 (b))。与此同时,TH-positive交感神经纤维缠绕在感觉神经元形成sympathetic-sensory耦合(数字3(一个)和3 (b))。EA治疗减少的表达TH和抑制交感神经纤维包装感觉神经元(图3(一个))。此外,贴上CGRP怎样的感觉神经纤维,神经源性炎症反应的一个因素。如图3 (b),CGRP-positive感觉神经纤维的密度和TH-positive交感神经纤维都增加了16种DRG结肠炎大鼠(数字3 (c)和3 (d))。与sham-EA组相比,EA治疗交感神经抑制发芽的16种DRG结肠炎大鼠(数字3 (c)和3 (d))。这些发现证实了DSS诱导促进了交感神经纤维的萌芽与交感神经活动增加。EA干预改善这些变化。

3.3。EA减少DSS-Induced结肠炎大鼠神经源性炎症在身体表面

评估DSS-associated神经源性炎症在身体表面,我们执行一个ELISA测定。DSS诱导三周后,神经源性炎症的表达水平与响应相关的炎症可以引起物质SP,哈,BK, PGI2皮肤组织中与对照组相比显著增加(图4(一))。EA治疗SP的表达减少,哈,BK, PGI2相比sham-EA组(图4(一))。与此同时,促炎因子il - 1的分泌β、il - 6、TNF -α,PGE2增强以及抗炎因子il - 10的水平在结肠炎大鼠的血清,减少由EA所有逆转治疗(图4 (b))。包含IHC染色显示,DSS诱导促进神经递质5 -表达在皮肤组织内,也消除了EA治疗(数字4 (c)和4 (d))。与此同时,据报道,是一个关键酶,调节神经递质在神经细胞(20.]。TH DSS诱导表达显著增加被EA治疗结肠炎大鼠16种诊断相关的数据4 (e)和4 (f))。

3.4。EA抑制TRPV1 / CGRP怎样、ERK和TLR4信号通路在DSS-Induced结肠炎大鼠

底层细胞机制的阐明EA刺激,我们分析是否EA ST36增强TRPV1 / CGRP怎样,兵,和TLR4信号通路的激活,这是已知的神经源性炎症的至关重要的作用。我们发现DSS诱导导致激活TRPV1 / CGRP怎样,兵,TLR4信号通路,以TRPV1的表达增加,CGRP怎样,MEK, p-MEK,分子,p-CREB, TLR4 IRF3, p-IRF3, p - 65和p-P65。EA刺激显著抑制这一过程,而在nonacupoint EA没有产生显著改善(数据5(一个)- - - - - -5 (j))。

4所示。讨论

众所周知,称为躯体疼痛是由于激活主要由内脏病变刺激痛觉传入纤维(21]。称为躯体疼痛伴随着二级痛觉过敏,反射肌肉痉挛,温柔深处,和自主多动症(22,23]。研究发现,交感神经系统密切相关痛觉过敏由于内脏病变(24- - - - - -26]。交感神经芽在DRG耦合神经元周围形成sympathetic-sensory耦合被发现在动物模型的病理条件。称为躯体疼痛和峰值交感神经性疼痛模型中的观察发芽的袖口和没有神经损伤(SNI)坐骨区域(27]。先前的研究发现,神经生长因子(神经生长因子)的发芽交感神经纤维释放滑膜和真皮上部导致了行为与关节炎疼痛反应(28]。已经表明,下巴疼痛可以解释为由于心肌缺血心脏内脏传入纤维的收敛与丘脑束(STT)神经元29日]。鼠模型的三硝基苯磺酸(TNBS)诱导结肠炎、交感神经纤维发芽被发现的DRG腰骶段(16种,S1),体现由酪氨酸羟化酶(TH)阳性神经纤维增加(30.]。葡聚糖硫酸酯钠(DSS)治疗引起机械的腹部和面部皮肤过敏性结肠炎小鼠通过增加表达TRPA1在背根神经节神经元培养,有选择地增强电流诱发的TRPA1受体激动剂(31日]。重要的是,在当前的研究中,我们发现,DSS诱导结肠组织损伤和体细胞在大鼠痛觉过敏。此外,DSS治疗增加交感神经纤维的萌芽在16种DRG感觉神经节。

另一方面,神经源性炎症的发病机制是一个重要的部分称为躯体疼痛。发布的初级传入神经元疼痛的神经肽的外围国家,导致肥大细胞脱颗粒,释放生物活性物质产生疼痛和/或炎症如CGRP怎样,SP, 5,哈,BK, PGI2、诱导神经源性炎症的特点是血管舒张,蛋白质外渗,白细胞游走(32,33]。在炎性疼痛模型中,PGI2参与在脊髓疼痛传播(34]。5参与中介实验性关节炎的关节疼痛令人兴奋和敏化内侧关节传入神经(35]。之前的一份报告表明,封锁通道如TRPV1受体和TRPA1在疼痛的感觉神经元被证明减弱实验性结肠炎通过抑制GRP和SP的释放36]。此外,哈敏化伤害感受器TRPV1在小鼠疼痛的背根神经节神经元,并有助于缓解内脏过敏,症状,腹痛IBD患者(37]。我们的研究结果表明,DSS结肠炎调节SP,哈,BK, PGI2、和5 -表达在皮肤和增加TRPV1, TRPA1, 16种DRG TH,暗示DSS提升表面神经源性炎症诱发skin-DRG sympathetic-sensory耦合。

EA,作为传统的治疗方法,已被用于治疗炎症性肠病和痛觉过敏。EA治疗Zusanli (ST36)减毒的宏观损伤和结肠髓过氧物酶活动的样品(38]。此外,EA在Zusanli (ST36)和Guanyuan (CV4)活化的小胶质细胞在DSS-induced结肠炎小鼠海马CA1和CA3区域(39]。有趣的是,EA在Zusanli (ST36)和Shangjuxu (ST37)显著降低结肠炎症的严重程度,以及内脏过敏和转诊结肠炎大鼠后爪痛觉过敏的增加(40]。EA在Zusanli (ST36)消除了表达和活化的肥大细胞,改善内脏过敏实验结肠炎(41]。机制可能是通过抑制神经生长因子/ TrkA TRPV1外围传入通路引发的肥大细胞(41]。我们发现在Zusanli EA (ST36)改善结肠组织的病理状态,躯体疼痛在结肠炎大鼠模型中,这是与哈佛sensory-sympathetic耦合的抑制DRG、神经源性炎症的皮肤。

众所周知,TLR4启动下游基因如NF-KB IRF3和激活炎症因素如il - 1的表达β、il - 6和TNF-a,从而诱导炎症反应和疼痛反应过敏。TLR4的表达增加,p-p65, TNF -α,il - 1β(L4 / L5) drg观察术后疼痛模型(42]。重要的是,TNBS治疗增强TLR4和TRPV1 coexpression在初级传入纤维包括三叉神经感觉神经元和DGR结肠炎小鼠的神经元43]。此外,抑制ERK在DRG的合成已被证明有效的缓解痛觉过敏。失活的MEK / ERK通路慢性收缩损伤大鼠DRG缓解神经性疼痛发展(44]。H₂O₂全身的痛觉过敏有关增加磷酸化ERK在DRG神经元的45]。最近的一项研究发现,在大鼠结肠炎模型,ERK5介导的激活BDNF upregulation DRG的初级传入神经元(46]。在这个研究中,我们证明了DSS诱导激活TRPV1 / CGRP怎样,兵,TLR4信号通路,大大抵消了EA在Zusanli (ST36)。

总之,EA在Zusanli (ST36)缓解结肠炎引起的痛觉过敏通过抑制表面神经源性炎症和同情发芽打钻,由TRPV1 / CGRP怎样,兵,TLR4信号通路失活。EA在Zusanli (ST36)可能是一种有效的治疗被称为体细胞UC患者的疼痛。

数据可用性

使用的数据集或分析在当前研究可从相应的作者在合理的请求。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

YL W、Z为什么和P C的构思和设计实验。YL W, HY Z, XQ L, XY R, YC P,司法院Q, XF S, R S进行了实验。YL W, HY Z、X ML ZH型C H Z,和分析数据。P C试剂和材料。YL W和Z为什么写的手稿。所有作者都充分参与这项研究,采集的数据,分析和手稿准备和阅读和批准最终提交的手稿。YL W和Z的贡献同样为什么这项工作和共同第一作者。

确认

这项研究得到了国家自然科学基金的资助(82004461),中国四川省中医药管理局(2020 jc0022),成都医学院第一附属医院(CYFY2021ZD05、CYFY-GQ27 CYFY2021YB05),和成都医学院(CYZZD20-03和202013705082)。