文摘

背景。氯胺酮已被证明具有持久的抗抑郁药的属性。然而,研究其对卒中后抑郁的影响机制的是不存在的。方法。调查这些机制,Sprague-Dawley老鼠与当地一个剂量的氯胺酮治疗大脑中动脉闭塞后和慢性出乎意料的轻微的压力。分析了影响海马齿状回通过评估n -甲基- d受体/钙/ calmodulin-dependent蛋白激酶2 (NMDAR / CaMKII)通路,突触可塑性,和行为测试。结果。克他命政府迅速产生显著而持久的抑郁症状的改善。生化分析显示快速、选择性upregulation NMDAR2——差别和对这些β和NMDAR2 -α亚型及其下游信号蛋白β-CaMKII和α分别磷酸化在齿状回。此外,colocalization分析表明一个重要的和选择性的结合增加β-CaMKII和突触后密度蛋白95 (PSD95)加上NMDAR2显著减少β与PSD95氯胺酮治疗后。这些变化转化为重大和扩展在齿状回突触可塑性。结论。这些研究结果不仅表明,氯胺酮是一种可行的候选治疗卒中后抑郁而且氯胺酮的持久的抗抑郁作用可能通过调制NMDAR / CaMKII-induced突触可塑性的关键脑区。

1。介绍

抑郁症是一种常见的缺血性中风患者精神并发症和不良结果的一个重要指标和更高的死亡率1]。虽然有报道的卒中后抑郁患病率的变化研究,广泛接受,它影响大约30%的中风患者(2]。即便如此,卒中后抑郁仍然是一个缺乏了解和诊断条件由于其多因子的特性,其发病机理的复杂性,以及缺乏一个全球性的管理方式(3,4]。到目前为止,标准治疗卒中后抑郁的临床抑郁症的主要药理和模仿,(5]。然而,这样的策略是有限的由于可能的病理生理学差异和缺乏一个更综合的治疗方法(4]。

先前的研究抑郁症的病理生理机制指出在这个过程中谷氨酸的重要性(6]。大量证据表明可能谷氨酸系统的异常和神经可塑性之间的联系以及抑郁科目的可塑性。这是更明显的关键脑区如海马齿状回由于其在这些过程监管的作用。事实上,研究表明,齿状回的调制积极参与应激反应在成人神经可塑性(通过其核心作用7,8]。我们以前的工作在卒中后抑郁模型表明,啮齿动物接受压力明显受损的齿状gyrus-related突触可塑性以及谷氨酸循环(9,10]。对抑郁症的病理生理学的研究不仅表明n -甲基- d受体的重要upregulation - (NMDAR)依赖钙/ calmodulin-dependent蛋白激酶2β(β-CaMKII或CaMK2B)的外侧habenular核则中枢神经系统的动物模型也表明,一些抗抑郁药物可以降低海马的CaMK2B水平(11]。CaMKII家庭组成的α和β亚型和不仅是下游信号分子NMDAR还NMDAR的第二信使。NMDAR-dependent涌入导致可逆易位CaMKII钙从肌动蛋白丝到突触后密度区和启动CaMKII和NMDAR2——之间的一条纽带βNMDAR (NR2B),一个亚基,因此延长CaMKII激酶活性和增加突触连接(12]。NMDAR也可以施加负面影响棘突的形成,导致收缩和神经尖尖的解体过程后长期增加细胞内钙离子浓度(13]。

有趣的是,追求新的药物治疗重度抑郁症和其他精神疾病已经表明,氯胺酮NMDAR拮抗剂,能改善患者的结果(14- - - - - -17]。单一剂量的化合物被证明引起有利影响,持续一个星期以最小的副作用(18- - - - - -20.]。调查其机制表明,氯胺酮不仅抑制NMDAR活动调节的磷酸化α-CaMKII (CaMK2A) thr286在海马齿状回(DG)神经元则以及正常啮齿动物(21- - - - - -23]。由于其快速行动,其半衰期短,其持久的抗抑郁作用可能由synaptic-related蛋白质的变化,突触可塑性和/或突触可塑性源于NMDAR堵塞(而不是一个直接的影响24,25]。然而,克他命的行动NMDAR复杂会导致增加突触活动和突触后信号仍然是一个重要的问题需要澄清。这项工作的基本原理来源于缺乏调查研究氯胺酮对卒中后抑郁的作用机制及其与NMDAR / CaMKII途径以及突触可塑性。

因此,在这项研究中,我们探讨了氯胺酮的抗抑郁效果在大脑中动脉闭塞(MCAO)模型则症状,其影响NMDAR / CaMKII途径,无论是抒发可塑性的齿状回区以及整体连接有着持久的影响。我们假设慢性应激导致失调NMDAR / CaMKII的途径和海马齿状回突触可塑性和氯胺酮不仅疗法这种变化也会导致持久的抗抑郁作用达到通过NMDAR / CaMKII-mediated upregulation突触可塑性。在这项研究中,一个单一剂量的氯胺酮在Sprague-Dawley大鼠大脑中动脉闭塞后的管理和慢性出乎意料的轻微的压力。我们的研究提供了新的视角理解氯胺酮的抗抑郁机制在卒中后抑郁。

2。材料和方法

2.1。动物模型和实验设计

成年男性Sprague-Dawley (SD)大鼠相似的增长(230 - 260 g)由东南大学医学院(中国南京)。受试者训练和适应在温度- 14天,光,和湿度环境(26°C, 12/12小时光明/黑暗,和60%,分别)。培训由三个蔗糖偏好测试(SPT)在动物提供两瓶(水和1%蔗糖溶液)的持续时间8小时。瓶子头寸切换4小时后,最后训练被用来建立一个基线值。此外,大田试验进行建立基线值之前经过八天的驯化和大脑中动脉闭塞和慢性不可预知的轻微压力(图1(一))。

(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
(d)
(d)
(e)
(e)
(f)
(f)
(g)
(g)
(h)
(h)
图1
及对MCAO大鼠的行为的影响。(一)学习计划和行为测试时间框架。(b)代表热图的静止时间公平贸易局的每组。(c)动态变化实验对象的重量。(d)蔗糖偏好三周后应力的变化。(e)预处理静止在两组之间的差异。(f)饲养经常项每组。(g)路程后慢性压力的变化。(h)平均速度变化的主题在不同组三周后压力。单向方差分析其次是图基的多重比较测试和重复测量方差分析被用于分析。 每组。 , , ,和 。

适应环境和培训后,SD大鼠(250 - 280 g)分为4组:实验MCAO, MCAO +暨,MCAO +和+尿酮体,和虚假的团体。除了虚假集团受到大脑中动脉闭塞(MCAO)。MCAO +暨和MCAO +和+尿酮体组织也受到慢性不可预知的轻微压力(累积),而MCAO +和+尿酮体组额外的克他命(刃)治疗。

所有实验在光阶段(8 AM-6点)。所有执行程序是预先批准东南大学动物伦理和福利委员会(201902150001)和符合美国国立卫生研究院实验室动物保健和使用指南。

2.2。政府的治疗
2.2.1。大脑中动脉闭塞(MCAO)

受试者与戊巴比妥钠腹腔麻醉(40毫克/公斤),和一个中线手术切口进行暴露左侧颈总动脉(CCA),其次是识别和隔离左外部和内部的颈动脉(ECA和ICA)。左边的一个微小的切口是CCA接近其分叉;这时,一个覆盖了poly-L-lysine 3/0-gauge单丝尼龙缝线引导的起源左侧大脑中动脉(MCA)通过ICA。当时单丝和切口缝合固定。

对照组也进行了类似的过程除了切口CCA和插入的单丝。主题的体温监测和手术期间维持在37°C。注意,过程是高度侵袭性,整体成功率80%,存活率为60%。过程评估的成功24小时使用时间均隆等。研究结果描述的方法是用5点量表得分(见补充文件(可用在这里),只有那些分数1和2被保留。

2.2.2。慢性不可预知的轻微的压力(和)模型

MCAO +暨和MCAO +和+尿酮体组织收到的9不同压力一段3周。压力是实现随机白天或晚上,根据他们的需求(见补充表S1)。受试者被关在单独的笼子里(在不同的房间),没有接触其他老鼠或强调同行除非它所需的过程。每周称重和其他蔗糖偏好测试进行评估的整体进化和健康。

所有的受试者都接受行为压力测试在最后的三周时间。一个主题是否保留,包括在研究依赖于他们的分数和评价的综合评价的成功和模型。只有模型显示出抑郁的迹象所定义的行为的变化在评估的至少两个参数(SPT测试和静止时间或饲养测试)保留了进一步的研究。筛选方法采用从李et al。抑郁模型的研究(26]。这个模型有一个总体的40%的成功率。

2.2.3。克他命管理

盐酸氯胺酮(刃)(2 ml: 0.1 g)从东南大学医学院获得(中国南京)。SD大鼠分为三个不同的组,每组12(暨,暨+ ket1暨+ ket2)和受到3周的累积过程。之后,那些暨+ ket1和累积+ ket2收到一次性剂量的1μl(25克他命的浓度μ克/μl,管理双边和单方面(左)在齿状回区域使用立体定位框架(RWD、深圳、中国)。管理浓度是改编自一项研究由杨et al。27]。经常和SPT氯胺酮治疗后进行4小时的可行性评估和比较两个交付方法,抗抑郁作用和随后的变化行为。结果表明,两种方法取得了有前景的结果就是明证改进行为的不动时间和蔗糖的偏好结果(数据S1一个和S1B)。单边克他命管理方法(单剂量在左侧海马DG地区)最终被采用所有剩下的实验由于两个原因:(1)两国注入不允许长期评估和观察由于三星期的存活率很低,需求大幅增加样本容量占死亡率和(2)两个交付方法取得了类似的结果,与单一政府远远微创的研究对象,即使它可能引起半球变化的问题。所有大鼠MCAO +和+尿酮体组一个氯胺酮注入后立即评估成功的累积过程。老鼠大脑的立体定位坐标被用作参考的立体定位坐标与少量修改占重量差异科目(28]。我们继续验证的准确性研究中描述的坐标计算方法由杨Pengfei et al。29日),利用占体重的变化在我们的主题。开放领域的研究对象被评估测试(OFT)和蔗糖偏好试验(SPT)根据各自的时间点。每组大鼠后被牺牲了根据既定的研究时间和测试(见图1(一)详细的研究设计)。

2.3。生物化学和测试分析
2.3.1。西方墨点法、存在、免疫荧光和透射电子显微镜

蛋白质含量和mRNA表达在左侧海马DG的实验对象被西方墨点法测量并使用标准协议中存在。与此同时,免疫荧光和透射电子显微镜是用来评估关键蛋白质之间的关系以及感兴趣的形态和结构变化的区域。详细的分析方法和步骤,包括西方墨点法,存在,免疫荧光,透射电子显微镜所示补充文件(可用在这里)。

2.3.2。共焦分析

之前用4%多聚甲醛灌注老鼠大脑的解剖和收获。提取的器官是脱水,固定,并分为片在-20°C使用低温恒温器(徕卡CM1950)。从不同群体被permeabilized冠状组织切片,封锁,并与Anti-CaMKII孵化过夜β(白平衡:1:1000,如果:1:100;Proteintech), Anti-CaMKIIα(白平衡:1:1000,如果:1:100;Abcam)、Anti-NMDAR2B (WB: 1: 1000,如果:1:200;Abcam)、Anti-NMDAR2A (WB: 1: 1000,如果:1:100;罗福斯生物或Abcam),或Anti-PSD95 (WB: 1: 1000,如果:1:100;Proteintech或Abcam)在4°C。接下来,样本清洗和孵化1小时在黑暗中与山羊anti-rabbit免疫球蛋白g h和l (Alexa萤石647)(1:200;Sparkjade,中国),驴anti-mouse免疫球蛋白g h和l (Alexa萤石488)(1:200;Abcam)或驴抗体免疫球蛋白g h和l (Alexa萤石405)(1:200;Abcam)安装和可视化。Triple-stained图像(Anti-CaMKIIβ/ Anti-NMDAR2B Anti-PSD95 Anti-CaMKIIα/ Anti-NMDAR2B Anti-PSD95 Anti-CaMKIIα/ Anti-NMDAR2A Anti-PSD95, Anti-CaMKIIβ/ Anti-NMDAR2A / Anti-PSD95)获得使用一个高分辨率激光共焦显微镜(日本奥林巴斯)和保存在TIFF格式,以避免损失。获得的图像然后使用自由软件处理ImageJ斐济(https://fiji.sc)和皮尔逊相关系数。的coloc2插件的ImageJ斐济计算几个colocalization-pixel-intensity correlation-based参数,包括皮尔森系数,用于获取分析数据(30.]。所有通道都是平衡的强度范围内,以避免分歧。相关测量,以及散点图,记录,用于与荧光定量和可视化。每组10视觉领域进行了分析。

2.3.3。蔗糖偏好试验(SPT)和开放的现场试验(OFT)

老鼠受到SPT快感缺乏评估过程中实验。获得更准确的结果,消除极端thirst-induced偏见,我们决定以避免水剥夺研究对象在测试之前。结果,测试时间延长至8小时。水和蔗糖溶液(1%)摄入量评估测试之前和之后两瓶装的解决方案。两瓶位置被随机分配(左/右侧笼)和仔细交换在一半的时间点(4小时)。在SPT,通常在MCAO pair-housed动物和虚假的组织分离和single-housed测试的持续时间。在相似的条件下获得的基线值在任何手术或压力过程之前,期间和SPT进行每周的学习。蔗糖消耗值的计算使用以下公式:

运动、静止时间和饲养使用经常进行评估。测试房间通风,测试仪器消毒前48小时测试。同时,动物是留给适应每天的测试环境。在测试过程中,每一个主题是放置在空地的中心,由一个黑人垫底 高的木盒子。地板被分为25相等的正方形,每个1厘米宽。执行的测试是在一个安静和昏暗的房间充足和平衡测试箱的照明。行为记录期间的5分钟。公平贸易局是由经验丰富的技术人员。得分和分析进行了自动ANY-maze行为跟踪软件(美国Stoelting有限公司)。

2.4。统计分析

统计分析和数据绘制在SPSS版本22 (IBM公司,纽约)或8.0棱镜(GraphPad软件,Ca)。免疫印迹的定量数据和实时定量PCR是相对的大小归一化β肌动蛋白蛋白质和mRNA表达。数据表示为 。SPT和体重数据分析使用重复测量单向方差分析。OFT差异蛋白质表达和其他关键因素在多个组评估单向方差分析(图基)。斐济软件和皮尔森相关系数是用来计算colocalization荧光相关系数分析(31日]。 值< 0.05被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。和协议引发则行为MCAO模型

评估强调MCAO大鼠的影响,每组受试者接受了一系列的行为测试压力期间和之后三周的压力方案。在这项研究中,公平贸易局的结果表明,强调主题的调查能力显著降低。绝大多数,MCAO +暨集团不仅表现出显著的减肥由于压力和厌食症(图1 (c)),而且逐渐增加的快感缺乏程度在最初一周压力(图1 (d))。如数据所示1 (b),1 (e)- - - - - -1 (h),重要改变行为定义为高热量签名,再静止期,减少饲养行为,显著减少旅行时间和速度在强调学科相比骗局和MCAO组( , 每组和时间点),表示则症状。这些结果进一步证实了卒中后模型的有效性。

3.2。克他命政府缓解症状则在MCAO +和老鼠

结果表明,氯胺酮引起快速抗抑郁效应MCAO +和+尿酮体组显著改善则行为就是明证更好的静止和饲养活动中观察到4 h后处理(数字2(一个)- - - - - -2 (c))( , )。公平贸易局还显示,治疗抑郁症受试者表现出更好的探究的行为的更好的结果在平均速度和时间等参数在不同的区域比参与同行(数字2 (d)- - - - - -2 (g))( )。此外,SPT也显示出显著改善的快感缺乏MCAO +和+尿酮体组织相比其参与同行(MCAO +和, , )(数据2 (h)- - - - - -2 (j))。

(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
(d)
(d)
(e)
(e)
(f)
(f)
(g)
(g)
(h)
(h)
(我)
(我)
(j)
(j)
图2
克他命的行为的影响则MCAO大鼠。(a)的比较学习小组后,克他命的静止时间管理(OFT)。(b)代表运动轨迹不同的群体(OFT)。(c)饲养各种氯胺酮治疗后组的数量。(d)路程氯胺酮治疗后的变化。氯胺酮后(e)时间平均速度的改善管理。(f)的变化探测的时间花在每组的中心地带。角落里(g)的变化时间区氯胺酮治疗后。氯胺酮后(h)蔗糖消耗量的变化管理(SPT)。(我)水消费群体之间的差异在不同的时间点。 (j) Temporal variations in sucrose intake preference after ketamine treatment. 1w: 1 week. One-way ANOVA followed by Tukey’s multiple comparison tests. 每组。 , , ,和 。
3.3。克他命政府选择性地调节NMDAR在海马DG单元区域MCAO +和老鼠

正如上面提到的,氯胺酮的抗抑郁性能与其对立的性质密切联系向NMDAR复杂。因此,我们着手研究氯胺酮的影响政府对个人NMDAR子单元。蛋白质定量的NMDAR海马DG组织显示,政府的氯胺酮显著降低NR2A亚单位的表达(数字3(一个))( 小时的时间点 2小时,MCAO +和+刃与MCAO +和, )。而与此同时,MCAO +和组的受试者NR2B亚基表达较低;产生影响,弥补了氯胺酮管理局(数字3 (b))( 小时的时间点 2小时,MCAO +和+刃与MCAO +和, )。结果还表明,氯胺酮对变异都是瞬态的影响,持续了不到4个小时。这些研究结果进一步支持的NR2A和B的表达蛋白免疫荧光结果(补充数据S2和S3)。进一步分析蛋白质的表达剩余NMDAR子单元,NMDAR1 NR1和NMDAR3 (A / B) (NR3)表明,氯胺酮对这些变量没有显著的影响(补充数据S1C和S1D)。总的来说,这些发现表明,氯胺酮的抗抑郁行为是有选择性的,NR2A和2 b-dependent,通过调节施加特定的子单元。

(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
(d)
(d)
(e)
(e)
(f)
(f)
(g)
(g)
(h)
(h)
(我)
(我)
图3
NMDAR和氯胺酮后CaMKII单元管理的变化。(一)免疫印迹和NMDAR2——代表α(NR2A或NMDAR2A)海马DG的表达式不同的研究对象。免疫印迹和NMDAR2——(b)代表β(NR2B或NMDAR2B)表达式在各种团体的海马DG氯胺酮。(c)相对的mRNA表达CaMK2A大脑的海马DG地区。(d)代表免疫印迹和蛋白质的表达CaMK2A DG地区的各种测试。(e)相对的mRNA表达CaMK2B海马DG地区的各种学习小组。免疫印迹和蛋白质的表达(f)代表CaMK2B大脑的海马DG地区。(g)蛋白的磷酸化状态水平CaMK2A (pCaMK2A或phospCaMK2A)在不同的组。免疫印迹(h)代表pCaMK2A表达式。(我)代表免疫印迹和蛋白质水平的磷酸化状态CaMK2B (pCaMK2B或phospCaMK2B) GD地区的各种实验对象。1 w = 1星期。MCAO + c: MCAO +累积; MCAO+c+k: MCAO+CUMS+ketamine. One-way ANOVA followed by Tukey’s multiple comparison tests. 每组。 , , ,和 。
3.4。克他命政府调节NMDAR下游信号通路通过调节α- - - - - -和β-CaMKII表达式

接下来,我们进行调查的影响,氯胺酮的监管NR2A和2 b CaMKII家庭,氯胺酮的快速反应的一个关键球员24]。CaMK2A分析表明,氯胺酮迅速降低蛋白质含量和mRNA表达MCAO +和+刃老鼠(数字3 (c)和3 (d))( 和 ,分别;MCAO +和+刃与MCAO +累积; ),一个持续了大约2个小时的效果( 和 ,分别;MCAO +和+刃与MCAO +累积; )。免疫印迹和mRNA量化表示,CaMK2A相反,和表达下调CaMK2B表达式的DG地区MCAO +和老鼠。氯胺酮的趋势立即缓解。事实上,结果表明,氯胺酮政府引起的一个重要和快速upregulation CaMK2B蛋白质含量以及mRNA表达MCAO +和+刃老鼠(后的一小时内政府)(数据3 (e)和3 (f))( 和 ,分别MCAO +和+刃与MCAO +和, ),影响持续了大约2个小时( 蛋白质含量和 信使rna表达,MCAO +和+刃与MCAO +和, )。这些结果表明,氯胺酮,通过其行动NMDAR,迅速调节下游信号通路占其快速反应。此外,CaMKII的高程或减少子单元是转录水平的变化的结果由于ketamine-regulated NMDAR表达式。上述研究结果进一步证实了免疫荧光分析,这表明强CaMK2B和弱CaMK2A彩色DG组织的信号处理则MCAO大鼠(补充数据S2和S3)。

随后,我们试图调查上述ketamine-induced是否变化反映在他们的磷酸化形式的变化。免疫印迹结果呈负相关性CaMK2B以及CaMK2A蛋白质表达的变化及其磷酸化版本(数字3 (g)- - - - - -3(我))。事实上,克他命的磷酸化作用降低CaMK2B同时增加CaMK2A (( 1小时后, 2小时后)和( 1小时后, 2小时后),分别;MCAO +和+刃与MCAO +暨)产生影响,保持2小时后管理。在一起,结果表明,氯胺酮可能利用选择性监管过程NMDAR / CaMKII途径实现其快速抗抑郁属性,这些属性可能依赖CaMK2A和2 b。

3.5。克他命政府诱导海马突触可塑性的DG区MCAO +和老鼠

我们利用激光共焦显微镜和皮尔逊相关系数的分析来确定的colocalization突触与CaMK2B (PSD95标记),突触与CaMK2A NR2B突触,突触与NR2A(图4 (b))。结果表明,和减少的相关性与NR2B PSD95就是明证减少皮尔逊相关系数,这种效果是大大加剧了政府的克他命(数字4(一)和4 (c))(MCAO +和+刃与骗局, , , ,和 在1小时,2小时,4小时和24小时的时间点分别 )。colocalization实验之间PSD95 CaMK2B表示显著增加与puncta克他命政府后,效果持续了超过2个小时(数字4 (d)和4 (e))(MCAO +和+刃与MCAO +和, , ,和 ,1和2小时后管理,分别 )。有趣的是,分析colocalization PSD95和NR2A之间,以及CaMK2A没有任何明显的变化之间的皮尔逊相关系数组(补充图S4)。这些发现意味着氯胺酮可能通过影响突触连接和功能可逆离解CaMK2B NR2B / PSD95复杂易位的突触后密度地区形成新的CaMK2B / PSD95复合物。

(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
(d)
(d)
(e)
(e)
图4
NMDAR / CaMKII通路之间的关系分析,colocalization在突触后水平的变化。(一)代表共焦图像之间的关系NR2B(用绿色标记)和PSD95(用红色标注)。每张图片的右上角显示像素浓度沿对角线对应的散点图,根据colocalization的程度。在图像采集(b)计划和程序。(c) Colocalization NR2B和PSD95之间,由皮尔森相关系数分析。(d)代表共焦图像CaMK2B之间的关系(用红色标记)和PSD95(标记为绿色)。每张图片的右上角显示像素浓度沿对角线对应的散点图,根据co-localization的程度。(e) Colocalization CaMK2B和PSD95之间,由皮尔森相关系数分析。酒吧规模:20μm。皮尔森相关系数分析是基于每组十视觉领域。 每组。1人力资源:1小时,2小时,2小时,4小时:4小时,24小时,24小时,和3 w: 3周。 , , ,和 。

接下来,我们评估这些过程的整体结构意义DG地区的大脑。突触可塑性是通过量化评估和考核海马超微结构的DG地区。在这项研究中,分析显示,和增加了NR2A / NR2B比一周的时间,克他命管理不仅推翻了这些影响,也进一步降低了比率超过4小时相比,虚假和MCAO组(图5 (b))。超微结构分析显示,及突触可塑性就是明证受损之间的平均距离的扩大和突触后膜(数字5(一个)和5 (c))(MCAO +暨与骗局, 和 ,24小时和1周,分别 ),相对较低的突触密度MCAO +暨集团(图5 (f))( ,24小时和1星期,MCAO +暨与虚假的; ,24小时,MCAO +暨与MCAO, ),和厚度的突触后密度MCAO +暨集团(图5 (e))( 和 ,24小时和1星期,MCAO +暨与骗局, )。见数据5 (c)- - - - - -5 (f),克他命政府不仅逆转后的超微结构变化及但还显示,促进海马突触可塑性的DG区MCAO +和+尿酮体模型。在一起,这些发现表明,氯胺酮可能会选择性地利用其快速调节NMDAR / CaMKII的途径实现重大和持久的(一个星期)突触可塑性在DG地区,进一步扩展它的属性。

(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
(d)
(d)
(e)
(e)
(f)
(f)
图5
氯胺酮对突触可塑性的影响海马DG地区则MCAO大鼠。(a)透射电子显微镜图像代表海马的突触DG地区各种学习小组在两个不同的时间点(10000 x 10000 x) ( 老鼠)。规模的酒吧:1μm和0.1μm,分别。(b) NR2A / NR2B比率在不同的时间点不同的群体。(c)突触间隙的平均宽度比较氯胺酮后管理。(d)之间的突触后密度的平均长度比较组治疗后。(e)比较不同群体之间的突触后密度的厚度有一天,两周后治疗。(f)之间的突触密度相对比较组。1人力资源:1小时,2小时,2小时,4小时:4小时,24小时,24小时;PSD:突触后密度。单向方差分析之后,图基的多重比较测试。 每组。 , , ,和 。

4所示。讨论

抑郁症是中风患者的严重并发症,进一步增加照顾者的负担以及亲戚(32]。生成的可量化的行为变化往往只是表现的深刻改变。接触压力已被证明有持久的和不利影响海马体,无论是在功能、分子或结构水平(33- - - - - -36]。我们先前的研究显示的迹象谷氨酸循环失调,神经再生和突触可塑性的DG地区则MCAO大鼠(9,10),结果被当前的研究进一步证实了(图5)。这样的改变导致异常行为很容易被实验对象,根据我们的预处理结果(图1)。NMDAR拮抗剂氯胺酮,竞争力,已经收到了大量的关注这几年由于其抗抑郁性能(37- - - - - -39]。虽然氯胺酮的作用机制仍在探索,很明显,很多还有待阐明。在这项研究中,获得的数据显示,政府的氯胺酮导致快速和持久的抗抑郁作用抑郁中风模型。最重要的是,我们的结果不仅提供了一个可能的联系氯胺酮的快速抗抑郁作用及其选择性调节NMDARs及其下游CaMKII信号在大脑的海马DG区域但还表明,氯胺酮的持久的抗抑郁药物属性可能是突触可塑性的结果由选择性调制NMDAR / CaMKII的途径。因此,这项研究解释了氯胺酮的快速和持久的抗抑郁作用在卒中后抑郁模型。

NMDARs是必不可少的突触可塑性突触后的控制α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole丙酸受体(AMPARs)系统以及它们的直接结构调制效应(40]。NMDAR系统的激活是突触后钙流入的先决条件,AMPARs走私的一个关键组件,因此突触可塑性(41]。过多的谷氨酸突触地区引起异常激活和调制NMDAR系统导致类似抑郁的症状(42,43]。有趣的是,我们的研究结果表明,氯胺酮选择性调制的政府先前受损NR2A和NR2B亚单位则MCAO大鼠虽然没有对NR1和NR3变异的影响。这些结果表明,氯胺酮的影响不针对所有NMDARs而是NR2A和NR2B亚单位相关的。它提供进一步证明氯胺酮的抗抑郁作用和NR2A和NR2B亚单位内在联系以来的功能水平的四个NMDAR2 (A, B, C, D)子单元本质上包含NMDARs的生理作用44]。之前的研究结果表明,NR2B本地化突触处的感应是至关重要的(LTP)和促进其长期电位化交互与PSD95 CaMKII复杂,突触可塑性的关键过程(45- - - - - -47]。在这项研究中,colocalization结果表明,氯胺酮干扰NR2B CaMK2B但不是NR2A和CaMK2A定位在促进突触的交互CaMK2B / PSD95而不是NR2B / PSD95。它暗示的影响氯胺酮NMDAR / CaMKII途径更有针对性的和复杂的。氯胺酮的管理很可能迅速启动转变CaMK2B从活动(磷酸化)非活动状态,从而显著提高其可用性突触易位。据我们所知,这是第一次这样的特异性被报道。选择NR2B upregulation由氯胺酮可能解释为优惠压力对谷氨酸循环的影响和每个NMDAR亚基的独特性能48- - - - - -50)因为它之前已经发现NMDAR子单元的具体变化导致截然不同的特征,如增强学习和记忆的NR2B超表达(40,51]。此外,NR2s的主要监管者NMDAR的打开/关闭状态,这样,NR2A可以进行反向calcium-dependent失活,NR2B[共享的属性不52]。此外,NR2B受体可能扮演中发挥越来越大的作用glutaminergic突触的密度和强度的规定(53)由于其高灵敏度谷氨酸释放NR2A同行相比,调解一个更直接的突触传递(54]。这些发现进一步表明氯胺酮的分子机制的复杂性在卒中后抑郁状况。

先前的工作已经建立了至关重要的作用的下游信号转导CaMKII家族的NMDAR [55- - - - - -57]。凸显了证据所发挥的主要作用这两个配合物之间的相互作用在信息处理和情绪调节58]。钙流入造成NMDAR激活的形成是一个重要的一步CaMKII / NR2B复杂,推而广之,突触连接(12,59]。CaMKII十分发现glutaminergic突触后密度和由Ca活性2 +钙调蛋白源于NMDAR开口,效果持续太久的刺激后补贴(60]。之前的研究已经表明,债券CaMKII和NR2B亚基之间LTP感应是必要的,和破坏NR2B / CaMKII复杂LTP的差别能导致对这些CaMK2A自身磷酸化在海马体(61年- - - - - -63年]。此外,CaMKII和PSD95为突触NR2B安克雷奇和稳定至关重要47]。目前的结果表明,氯胺酮政府迅速提升的表达CaMK2B海马DG地区而减少CaMK2A的变体。有趣的是,相反的效果观察其磷酸化状态的量化,进一步表明选择性调制的NMDAR氯胺酮诱导出特定从激活状态转向失效,反之亦然,这取决于CaMKII变体。CaMKII和NMDAR亚基之间的相互作用是至关重要的突触可塑性和学习(63年),当前的发现就是明证。

突触可塑性是大脑的能力基本和动态调整刺激和本质上是与条件如抑郁症的病理生理学64年,65年]。能够很好的证明,慢性压力产生异常形态关键脑区在超微结构水平的变化(66年,67年]。之前有研究表明,抑郁症的病理生理特点不仅是观察到的损害齿状回神经发生和细胞死亡也显著减少突触和轴突的数量,因此,降低网络连接大脑关键区域(68年,69年]。我们的研究结果表明,压力增大NR2A / NR2B率和氯胺酮快速和显著降低的影响参数。进一步支持表明压力自平衡NR2A和NR2B削弱突触可塑性是experience-driven可塑性的一个主要指标以及长期势差的调制器/长期抑郁成人神经系统(40,41,70年]。因此,通过降低NR2A / NR2B比率,氯胺酮诱发大规模的超微结构变化在突触水平。这些发现进一步证实了图中所示的结果5表明MCAO大鼠接受附带协议进行了重大不利的重组和形态变化的海马DG地区和氯胺酮的政府不仅弥补这些影响还积极促进突触密度和连通性的增加,影响持续了几天平行于其抗抑郁性能。

在这个研究中值得注意是有限制的。首先,我们没有进行基因敲除的单个组件NMDAR / CaMKII途径明确建立的作用途径在氯胺酮的抗抑郁作用。其次,我们没有研究氯胺酮可以区分的机理和选择性的目标这两个CaMKII子单元的磷酸化和剩下的变异是否影响也扮演了一定的角色。第三,氯胺酮的抗抑郁机制是多目标,涉及到几个通路之间的协同互动,并因此,是否其他已知ketamine-related通路中发挥关键作用合成突触变化需要进一步调查。

总之,氯胺酮是一种很有前途的候选人对抑郁症的治疗中风患者,或许更多的研究方向应该是理解其机制。在这种情况下,我们的数据表明,氯胺酮的快速抗抑郁行为可能是介导通过NMDAR / CaMKII通路,导致显著增加突触可塑性的DG地区则中风(图模型6),使其成为可行的选择治疗中风患者的抑郁和连接其持久的抗抑郁药物特性产生的关键脑区突触可塑性。


图6
Ketamine-mediated持久的抗抑郁作用源于NMDAR / CaMKII诱导突触可塑性。提出了模型的快速和持久的行动氯胺酮通过NMDAR / CaMKII通路。氯胺酮调节钙流入管理通过其行动NMDAR导致快速抑制CaMK2B磷酸化和转录刺激的活动形式。同时,氯胺酮促进离解的PSD95 NR2B / PSD95复杂的新成立的CaMK2B / PSD95复合物,导致相当刺激的突触可塑性。并行,氯胺酮的调节细胞内钙含量也会导致快速的磷酸化CaMK2A,进一步支持可塑性过程通过刺激plasticity-related蛋白质(PSD95)。总的来说,结果表明,氯胺酮的临时监管NMDAR / CaMKII的途径不仅占其快速行动也开始深刻而持久的变化在突触后级别(<一周)导致其持久的抗抑郁作用。插图是部分基于主题http://motifolio.com。

数据可用性

使用的数据集和分析在当前研究可从相应的作者以合理的要求。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

文阿里Abdoulaye概念化,方法,数据管理,原创作品准备草案,writing-review和编辑。鄯善吴做数据管理,调查,和方法论。Enkhmurun Chibaatar做了正式的分析、调查和资源收集。Da-fan Yu的形式分析、调查和验证。Kai Le可视化、验证和方法论。Xue-jin曹了资源收集、调查和正式的分析。郭易经出来的资金收购、监理、项目管理、概念化,writing-review和编辑。

确认

这项研究得到了国家自然科学基金(没有。81471187)。

补充材料

补充材料包含额外的支持数据、表和本文中引用的数据,如一个详细和协议。(补充材料)