文摘

分子机制的研究调查神经突产物(突出伸长)垂体腺苷酸cyclase-activating多肽(PACAP) 38治疗使用老鼠adrenal-derived line-PC12嗜铬细胞瘤细胞。本研究专门看着PACAP38-induced崩溃的规定响应中介蛋白2 (CRMP2)发现在老鼠脑缺血模型中,可以通过PACAP38恢复治疗。以前,DNA微阵列分析显示,PACAP 38-mediated神经保护不仅CRMP2还涉及相关通路糖原合酶激酶3β(GSK-3β)和其他信号组件。因此,澄清是否直接PACAP38或通过GSK-3 CRMP2行为β作为机制的一部分PACAP38-induced神经突产物,我们观察到神经突在GSK-3产物β抑制剂和催化剂。PC12细胞治疗PACAP38被添加到细胞培养基浓度的10⁻⁷10米,⁻⁸10 M,⁻⁹M。帖子PACAP38治疗,免疫染色是用来证实突出PC12细胞的伸长,而rt - pcr、二维凝胶电泳结合西方墨点法,并抑制实验进行确认PACAP基因的表达,它的受体,下游信号组件。我们的数据表明,神经突突出伸长PACAP38 (10⁻⁷米)在PC12细胞中通过PAC1-R受体介导,通过特定抑制剂PA-8镇压。抑制剂实验表明,PACAP38-triggered神经突突出遵循GSK-3β监管的途径,一种蛋白激酶和营地/ ERK途径和ρ的抑制/中华民国能提高神经突下突出PACAP38刺激。虽然我们还不能证实的确切作用和位置在PACAP38-mediated CRMP2 PC12细胞伸长,似乎与神经突的磷酸化和去磷酸化相关突出伸长通过CDK5的相互作用,需要进一步调查。

1。介绍

生理活性神经肽垂体腺苷酸cyclase-activating多肽(PACAP)属于——血管活性肠多肽(VIP) /胰高糖素分泌素家族27或38个氨基酸残基(PACAP27或PACAP38)展品多样化的生物功能(1- - - - - -3]。PACAP的生物活性是多功能的,它被认为是作为一种神经递质/监管机构除了荷尔蒙的行动。是参与神经细胞的分化和生存的维护和激活的神经内分泌系统在中枢和周围神经系统和调节神经突触可塑性、神经前体细胞的分化,glucose-dependent胰岛素分泌。PACAP据报道有促进作用,在脑缺血细胞死亡的抑制作用,cytoprotective效应(2,4- - - - - -17]。一般来说,脊髓和大脑中枢神经系统的关键结构,不恢复一旦受损,受损的神经,这是理由本身造成各种疾病的原因如脑梗塞、交通事故,造成脊髓损伤。治疗尚未建立恢复神经损伤和条件(疾病/障碍)引起的。

PACAP被受体在细胞膜,和贵宾家庭成员一样,股票两种G protein-coupled受体VPAC1 (GPCRs) R和VPAC2 R .然而,PACAP PAC1-R有特别的亲和力,据说是1000倍高于其他两个(4,18,19]。研究PACAP和澄清其功能通过检查大量的下游(受体)中小学信号通路和网络联系可能导致确认的作用在许多细胞过程以及PACAP有助于治疗疾病和药物的发展障碍(5,6]。神经保护大脑研究吸引了很多兴趣,和我们的研究小组一直在调查PACAP影响缺血性脑使用高通量“组学”技术。高通量技术之一,是整个基因组表达分析方法。这种方法提供了几乎所有的快照(取决于样品的质量和实验设计)的分子事件发生的基因(即水平。转录组)和生物的位置在一个特定的实例。使用这种基因的方法,我们已经建立了一个严格的和标准化的DNA芯片协议识别高信心转录组的小鼠大脑中动脉闭塞模型永久(PMCAO) [16]。此外,我们还利用凝胶蛋白质组学的方法使用相同的PMCAO小鼠模型来识别一个崩溃的响应中介蛋白2 (CRMP2)缺血性脑组织样品后脑室PACAP38管理局(17,20.]。

CRMP2,最初叫crmp - 62,于1995年首次发现使用非洲爪蟾蜍卵母细胞表达系统(21]。CRMPs多功能适配器蛋白质/ microtubule-related蛋白质,在大脑中高度表达/中枢神经系统(22,23]。CRMP2特别是等功能,被认为是重要的测定与过程相关的神经元极性和伸长过程损伤和神经元死亡,神经病,脑缺血(24- - - - - -30.]。这些研究让我们假设没有被证明的作用CRMP2参与神经突突出伸长PACAP行动,包括可能的分子机制这样的函数如果它存在。CRMP2诱发突出形成培养的海马,及其行动被报道通过磷酸化,糖原合酶激酶3灭活β(GSK-3β)[31日,32]。此外,除了GSK-3β,CRMP2影响微管蛋白结合能力等通过激酶磷酸化细胞周期蛋白依赖性激酶5 (Cdk5) [33)和Rho-associated蛋白激酶(岩石)(34]。先前的研究还揭示了一个轴突CRMP2磷酸化参与指导和生长锥(35,36]。然而,人们很少知道机制调节树突指导和模式通过PACAP目前还不清楚如何CRMP2磷酸化参与神经突突出伸长。

因此,在这个报告中,我们特别旨在揭开背后的分子机制神经突突出伸长PACAP38行动,其中的参与CRMP2 PC12细胞模型(37),培养永生化细胞分化成神经元,神经生长因子和PACAP刺激。进一步,我们希望找到新的证据的机制PACAP38促进CRMP2的磷酸化的抑制,从而洞察的途径可能参与到治疗神经元/神经损伤和神经退行性疾病/障碍。

2。细胞模型和方法

2.1。细胞培养

从日本获得PC12细胞(RCB0009)细胞库(日本)。细胞培养1640年RPMI介质(写明ATCC修改、热费希尔)有限公司₂孵化器(37°C, 5%)与5%胎牛血清(的边后卫)(16140063,Gibco)、10%马血清(HS) (H1138σ),和抗生素(penicillin-streptomycin P4458,σ)。Cellmatrix IV型(Nitta明胶Inc .)是用于外套培养皿。制度伦理批准不需要这项研究。实验如下执行重复多次,(通常 )正如图中显示的传说,这样的数据 。在抑制剂实验,DMSO调整的最终浓度0.0001% ( )和中被用作控制。除了抑制剂实验,SDW添加1%的介质和作为控制。

2.2。测量神经突突出伸长

PC12细胞被调整 来 细胞/在一个96孔板,大约6小时后,PACAP (PACAP38 052 - 05凤凰Pharmaceuticals Inc .)的细胞培养基浓度添加到10⁻⁷10米,⁻⁸10 M,⁻⁹米板确认完成后粘连。细胞作为一个相衬显微镜的图像使用光学显微镜观察BZ-X710(日本基恩士)随着时间的推移,17岁,72年,144小时后添加PACAP38。细胞与神经突的产物μ从图像被算作1米或更多。细胞数使用ImageJ软件(美国国家卫生研究院,马里兰州贝塞斯达)。细胞的百分比与神经突的产物μ米或更高版本是通过除以每个图像细胞的总数。最后,所有字段检查的结果为每个条件平均( )计算每个状态的神经突细胞产物数量。

2.3。疣状

PC12细胞被播种在盖玻片室(5222 - 004年,磐城),确认粘附后,PACAP被添加到一个工作浓度的10⁻⁷M和细胞培养3天。去除介质后,这些细胞被洗PBS和固定PFA 4%解决方案。洗后,细胞治疗与PBS溶液含有0.1% Triton X 100 10分钟。治疗后与PBS和洗涤,阻塞是PBS溶液含有3%牛血清白蛋白(BSA) (Sigma-Aldrich)和0.1%渐变20,紧随其后的是使用鼠标反孵化α微管蛋白抗体(Abcam Inc .) 1: 1000)在一夜之间在4°C。细胞被洗PBS和crossreacted Alexa 594驴anti-mouse免疫球蛋白(表达载体,1:1000)作为第二抗体室温为60分钟。洗后再用PBS, Alexa萤石488 -标记兔anti-Neu-N抗体(Abcam, 1: 50) crossreacted一夜之间在4°C。与PBS Postrinsing nuclear-specific与DAPI染色进行(D 1306;热费希尔科学,1:10000)3分钟在室温和细胞终于洗PBS和密封。干燥后,荧光显微镜下观察细胞BZ-X 710(日本基恩士)。

2.4。总RNA提取和rt - pcr

总RNA提取PC12细胞培养在10厘米培养皿使用RNeasy迷你包(74104年,试剂盒)。后合成cDNA使用AffinityScript QPCR互补脱氧核糖核酸合成装备(600559年,安捷伦),PCR反应是使用EmeraldAmp PCR执行主(RR300A,豆类)。PCR是在95°C的一个初始变性5分钟,和postfinal周期在72°C扩展进行了10分钟。使用的引物和循环条件如表所示1。PCR产品1.6%琼脂糖凝胶上分离和可视化在紫外光照射下与溴化乙锭染色。

2.5。PACAP受体抑制实验

PC12细胞被调整 来 细胞/在96孔板和培养24小时PAC1-R抑制剂(PA-8: Takasaki一郎教授、工学院、富山大学)(38]。VPAC1-R和VPAC2-R抑制剂(VIP6-28、V4508 Sigma-Aldrich)被添加到细胞培养和孵化有限公司₂孵化器(37°C, 5%) 1小时。PACAP38 10⁻⁷M添加postincubation和细胞观察有或没有添加抑制剂。BZ-X710光学显微镜(日本基恩士)被用来计数细胞的总数,和细胞的数量与细长的突起(20μ米或更多)计算。

2.6。抑制剂实验

PC12细胞被调整 来 细胞/在96孔板和培养24小时,和5μM CHIR99021和光纯化学公司(252917-06-9,富士胶片kouichi) 5μM LY294002和光纯化学公司(154447-36-6,富士胶片kouichi), 2.5μM H89, 2.5μM U0126, 2.5μM GF109203X, 10μM Y27632, 5μM purvalanol添加和放置在一个有限公司₂孵化器(37°C, 5%) 1小时,和PACAP 10⁻⁷M postincubation补充道。培养3天后,使用光学显微镜观察文化BZ-X710(日本基恩士)和细胞和细胞的数量的总数产生突起(大于20μm和20μ米或更少)的测定。

2.7。总可溶性蛋白的提取

提取蛋白质,PC12细胞被洗两次与PBS紧随其后的LB-TT提取解决方案(7米( )尿素,42克;2米( )硫脲,15.2克;4% ( )家伙,4.0克;18毫米( )Tris-HCl (pH值8.0),1.8毫升;14毫米( )Trizma基地,169.5毫克;0.2% ( )特里同x - 100;50毫米(0.2毫升 )德勤,771.5毫克;1% ( )pH值3 - 10两性电解质,1毫升;和两个EDTA-free蛋白酶抑制剂(5892791001,罗氏)平板电脑总量的100毫升)溶解细胞。一(1)毫升LB-TT很快就被添加到培养皿(直径10厘米),立即混合1分钟在rt,蛋白质浓度测定皮尔斯™660海里蛋白质测定试剂(热费希尔科学)使用牛血清白蛋白(BSA)作为标准和DeNovix DS-11分光光度计(美国DeNovix威尔明顿·德·)。

2.8。二维凝胶电泳分离蛋白质和可视化

根据阿二维凝胶电泳进行技术手册。五(5)μ克的蛋白质样本添加到圆盘预制琼脂糖凝胶(pH值5 - 8, ;阿,东京、日本)和一维电泳进行利用wse - 1500 dicRun-R(阿、东京、日本)的恒定电压300 V 210分钟。完成后的一维电泳、琼脂糖盘凝胶被固定在一个固定的解决方案(0.25%柠檬酸)3分钟。的凝胶与蒸馏水洗了三次1分钟,取而代之的是新的蒸馏水,并轻轻摇动2 h,在rt,蒸馏水被丢弃,和SDS的细胞被轻轻摇动均衡解(50毫米Tris-HCl (pH值6.8),1.6% SDS, 0.02%溴酚蓝,8%的甘油,和20毫米德勤)10分钟,紧随其后的是一个二维电泳的一步。二维电泳进行使用e-PAGEL (R) (E-D520L 5 - 20%)的电流20 mA / 90分钟凝胶,利用wse - 1150 PageRunAce(阿,东京,日本)。2 de后,蛋白质转移到PVDF膜(Trans-Blot涡轮Midi PVDF, 0.2μ米,传输包设备;猫。不。170 - 4157年)使用Trans-Blot涡轮增压传输系统(Bio-Rad)混合MW协议后,25 V, 2.5, 7分钟。PVDF膜上的蛋白质转移(也证实了可视化的所有10个颜色的分子质量标准),这是在孵化25毫升的屏蔽解决方案1 h在rt,屏蔽常数缓慢摇晃下解决方案是由溶解5.0 g脱脂牛奶(Difco)在100毫升1 x ttb (10 x ttb:氯化钠80克;1米Tris-HCl (pH值7.5)200毫升;和Tween-20 10毫升/ l)。屏蔽解决方案提供了,在1 x ttb和膜清洗一次(5分钟),其次是在10毫升的孵化主要抗体(2的解决方案μl兔子anti-CRMP2(猫。不。ab62661;Abcam), 3μl鼠标anti-CRMP2磷T555(猫。不。ab215742;Abcam), 3μl兔子anti-CRMP2磷S522(猫。不。ab193226;Abcam),和3μl兔子anti-CRMP2磷T514(猫。不。ab85934;Abcam) 1 h,如上图)。膜然后洗25毫升1 x ttb五倍。倾析最后ttb洗后,细胞膜在10毫升的二次孵化抗体溶液(0.5μl Amersham, ECL anti-rabbit免疫球蛋白,合种特异的抗体(驴);C =猫。不。NA 934;通用电气医疗集团)1 h,慢摇在沿1 x ttb洗步骤重复了五次。图像/乐队发展,发光氨/增强器和过氧化物缓冲的解决方案是混合在一个1:1比例(清晰西方ECL衬底,猫。不。170 - 5060年,Bio-Rad)和分布在细胞膜和孵化RT为5分钟。过度的解决方案是排水通过触摸膜的一端Kimwipe纸巾,和信号(crossreacting蛋白质乐队)在ChemiDoc XRS +可视化成像系统(Bio-Rad)。

2.9。统计分析

所有的实验都重复多次六次(除非另有说明)。数据了 偏差。Microsoft Excel是用来分析数据。意味着用单向方差分析进行比较,以确定意义,和图基方法被用于多个比较。

3所示。结果与讨论

3.1。PACAP及其受体的表达在PC12细胞

这里的主要目标是确认是否存在PC12细胞的受体基因表达;因此,PACAP及其受体的基因表达分析PC12细胞检查。半定量rt - PCR,这是一个已经确立正确的引物设计方法和可视化的产品/乐队凝胶,,45 PCR循环之后,PACAP, PAC1-R, VPAC1-R, VPAC2-R mRNA表达。然而,在PCR反应时间减少到36个周期,只有一个乐队PAC1-R确认。这表明PAC1-R是主要的受体参与神经突的突出PACAP38在PC12细胞的伸长作用(表1)。对于组织,免疫染色的差异可以清楚地显示由于受体的不同,但是在细胞的情况下,只有类似的图像,我们定量PCR证实了表达水平的研究。

3.2。PACAP38浓度对神经突的影响突出伸长

为了调查的最佳浓度的PACAP38 PC12细胞伸长突起,添加不同浓度的PACAP38 PC12细胞和细胞的变化观察(图1)。疣状被用来观察PC12细胞的突起和PACAP38伸长。在PACAP-added PC12细胞,NeuN特别是局部神经细胞核,而α微管蛋白表达在胞体和过程确认。这表明PACAP38确实是神经突的突起细长的突起(图2)。通过测量突出伸长细胞PC12细胞的比例在不同浓度的PACAP38随着时间的推移,我们可以确认引起突出PACAP38伸长的作用;细胞的数量在PACAP 10⁻⁷米除了集团证实,突出伸长显著增加,而在对照组(图3)。结果意味着不同的数据,误差SD(图所示3)。

3.3。神经突的变化突出伸长行动PACAP受体抑制剂

为了识别受体参与行动的PACAP38 PC12细胞,PA-8,这是一个特定的PAC1-R抑制剂,VIP6-28,增加特定VPAC2-R抑制剂,并突出伸长的变化观察PACAP38采取行动。PACAP38的突出伸长的影响是显著抑制PA-8的存在,但不是VIP6-28。这些数据表明PACAP38的突出伸长作用是通过PAC1-R介导的(图4)。

3.4。观察神经突突出延伸使用抑制剂和活化剂

3.4.1。检查GSK-3β通路

澄清是否直接PACAP38或通过GSK-3 CRMP2行为β作为机制的一部分PACAP38-induced神经突产物,我们观察到神经突在GSK-3产物β抑制剂和催化剂。CHIR99021, GSK-3的抑制剂β促进神经突PACAP38引起的产物,而LY294002, PI3K的抑制剂(磷酸肌醇3-kinase) GSK-3上游β和GSK -激活β,抑制神经突PACAP38引起的产物。在这个实验中,一个神经突不到20的产物μm观察条件下,只有CHIR99021 LY294002添加但大多数神经突结果大于20μm时只有CHIR99021补充道。然而,当LY294002补充道,在那里几乎没有超过20的伸长μm。这些结果表明,突出由GSK-3 PACAP38伸长的影响β(图5)。

尽管PACAP38-induced PC12神经突GSK-3被认为是介导的产物β通路,先前的研究已经表明,PACAP受体的信号级联PAC1行动主要通过AKT通路,营地/ PKA通路,营地/ ERK通路,以及PLC / PKC途径[39]。CRMP2是PI3激酶/ Akt / GSK-3监管β信号通路(31日]。GSK-3β,除了AKT通路,也参与了营地/ PKA,营地/ ERK和PLC / PKC途径[31日,39]。GSK-3β据报道是由营/ PKA,营地/ ERK和PLC / PKC途径除了AKT通路(40,41]。

从实验的结果使用抑制剂(数字6(一)和6 (b)),它被证实的一种蛋白激酶抑制剂LY294002和营地/ ERK抑制剂U0126几乎完全抑制PACAP38在突出伸长的影响。因此,在目前的实验条件下,AKT通路和营地/ ERK通路被证实是主要过程负责神经突PACAP38在PC12细胞的产物。

3.4.2。检查CDK5和ρ/摇滚通路

除了GSK-3βCDK5和RhoA报道,使CRMP2磷酸化。Sema3A激活Cdk5 GSK-3β,Cdk5磷酸化CRMP-2丝氨酸522 (35,42]。关于RhoA,激活RhoA扰乱神经突神经元在初级产物(36,43Rho-kinase-dependent]和myelin-related糖蛋白抑制轴突再生的机制(37,44]。进行实验的结果与CDK5ρ/摇滚通路抑制剂和确认由PACAP38突出伸长的存在与否,这是证实,PACAP的突出伸长作用被提拔当ρ/中华民国抑制剂Y27632是补充道。当只有Y27632补充说,许多PC12细胞突起的20倍μ观察米或更少但突出伸长20μ米以上几乎是可以忽略不计的。因此,它可以建议ρ/摇滚抑制单靠Y27632不会引起突出伸长的影响。另一方面,增加purvalanol, CDK5抑制剂,稍微抑制PACAP38伸出的伸长的影响。从这些结果,突出伸长PACAP38采取行动参与CDK5和ρ/摇滚途径但可以建议,而不是CDK5磷酸化CRMP2, PACAP促进突出伸长通过CDK5(数字6(一)和6 (b))。

从上述抑制剂实验的结果,它也可以显示神经突的主要途径突出伸长,PACAP AKT通路和营地/ ERK通路,ρ/中华民国抑制被认为是进一步促进神经突突出伸长PACAP38采取行动。CDK5,然而如果CRMP2磷酸化CDK5徒CRMP2失活的,添加purvalanol应该导致促进神经突突出伸长PACAP38采取行动,但是在这个实验中,神经突突出伸长行动是抑制。消除Cdk5-mediated CRMP2 ser - 522磷酸化减少海马神经元的树突棘密度在小鼠海马45)和Cdk5-inhibition Ser522 CRMP2磷酸化的视神经。有报道称,它会导致稳定和轴突神经损伤后的再生(46]。此外,3班semaphorins已报告调解成年新生神经元树突增长通过Cdk5 / FAK通路(47]。这是暗示神经突的CDK5激活可能需要突出伸长PACAP38行动的PC12细胞(图6 (c))。

3.5。CRMP2磷酸化和神经突的关系突出伸长

尽管CRMP2磷酸化和去磷酸化是重要的神经突突出伸长,之间的关系的磷酸化/脱磷酸化作用CRMP2 PACAP38和神经突突出伸长还不清楚。特别是CRMP2有许多磷酸化的网站,因此,一个二维凝胶电泳分析实验进行了澄清磷酸化网站可能会涉及到,因此,重要的是神经突突出伸长的PACAP38(图7)。

由于二维凝胶电泳分析(数据7(一)和7 (b)),四(4)斑点与CRMP2抗体检测。当刺- 514,ser - 522,和刺- 555磷酸化CRMP2抗体被用来证实crossreacting磷酸化,现货2显示ser - 522和刺- 555和现货3刺- 514和ser - 522。这是确认现货4刺- 514。点2,3,4丰度降低PACAP38比控制。通过添加 ,,促进神经突增加突出伸长,现货2减少点3和4消失了。4点消失在 ,这也显示出更多促进神经突的突出伸长。此外,新增的 和 ,这消除了突出伸长行动,没有造成点3和4的减少。此外,发现4下降 , ,和 一个突出的伸长略抑制。从上面的结果,认为减少点3和4是促进神经突重要突出PACAP38伸长,即。的你- 514去磷酸化CRMP2是至关重要的。然而,尽管点3和4添加CHIR99021消失的情况下,神经突突出伸长的20倍μ米或更多无法证实。目前我们不能解释这个观察,和一个更详细的分析需要更好地理解它。然而,的比例位置1到位置2,3,4也被认为是重要的神经突突出伸长的20倍μ米或更多。认为磷酸化CRMP2的比例越低,越突出伸长的20倍μ米或更多被提拔。

神经肽PACAP是参与神经突的突出伸长作用,但作用机制尚未阐明。因此,PC12细胞,nerve-like培养无限增殖细胞,被用来阐明行动的机制。这是假设CRMP2参与突出扩展行动PACAP38但还不清楚什么途径是至关重要的。从抑制实验,结果证实是一种蛋白激酶通路和营地/ ERK通路由PAC1受体的主要途径是PACAP38伸长的行动过程。此外,PACAP38发现促进神经突突出CRMP2伸长通过促进去磷酸化。的主要途径去磷酸化CRMP2通过GSK-3已报告β,ρ/摇滚,和CDK5。然而,在这项研究中,结果表明,该神经突突出伸长的影响通过PACAP38进一步被提升去磷酸化的抑制GSK-3 CRMP2β和ρ/摇滚,但神经突突出延伸效果PACAP38被CDK5抑制抑制。CDK5据说参与磷酸化CRMP2 ser - 522,但抑制CDK5不减少景点ser - 522的二维电泳,现货3磷酸化和现货4磷酸化你- 514增加。CDK5抑制导致Ser9脱磷酸作用和GSK-3体内激活β(48,49]。Cdk5活动也与轴突和神经突生长50]。此外,Cdk5老鼠已报告表现出有缺陷的轴突伸长(51,52]。从这个实验的结果,GSK-3β激活CDK5抑制和磷酸化的增加你的- 514 CRMP2表明CDK5活动可能也很重要的神经突突出伸长PACAP38采取行动。

意识到的局限性和进一步研究的需要,我们正在调查的分子机制CRMP2-mediated神经突突出伸长PACAP38使用DNA微阵列和猎枪(质/ MS)蛋白质组学分析,将进一步检查是否磷酸化CRMP2 PACAP38是有效的轴突损伤后再生。近年来,CRMP2磷酸化的抑制作用已被证明是有效的在不同的疾病,如阿尔茨海默病(53),脊髓损伤(54),肌萎缩性脊髓侧索硬化症(55[],视神经损伤46]。研究PACAP抑制CRMP2磷酸化,可能铺平道路对开发新的药物和治疗方法。

缩写

CRMP2:	响应中介蛋白质2崩溃
GSK-3β:	糖原合成酶激酶3β
PACAP:	垂体腺苷酸cyclase-activating多肽
PC12:	老鼠adrenal-derived嗜铬细胞瘤细胞系
PMCAO:	大脑中动脉闭塞永久
贵宾:	——血管活性肠多肽。

数据可用性

所有的数据都是公开的;和数据或方法或引物要求将完全共享。

的利益冲突

所有作者声明没有利益冲突。

确认

这项研究的部分支持由jsp KAKENHI数字h02684 16和18 h05386 (SS)和jsp KAKENHI数量20 k09262 (RR)。