文摘

本研究旨在调查的潜在角色G protein-coupled雌激素受体1 (gp,也称为GPR30)在人参皂苷的预防效果Rg1对认知障碍和海马细胞凋亡在实验性血管性痴呆(VD)小鼠。影响双边颈总动脉狭窄(bca) GPR30表达式在mRNA水平进行评估。此后,bca鼠标模型是用来评估保护Rg1(0.1、1、10毫克/公斤,14天,知识产权)。空间记忆莫里斯评估水迷宫bca后7天。行为测试后,神经细胞凋亡检测是通过末端脱氧核苷转移酶介导dUTP尼克•结束标记分析和潜在机制使用西方墨点法和定量实时聚合酶链反应测定。我们的研究结果表明,海马地区GPR30表达式在mRNA水平是提升30分钟,3 h, bca后6 h和24小时。人参皂苷Rg1(1或10毫克/公斤,14天,知识产权)提升GPR30表达模型小鼠的海马(行为测试后),但并没有改变GPR30表达式控制老鼠的海马。此外,人参皂苷治疗Rg1(10毫克/公斤)或G1 (5μGPR30受体激动剂g / kg),防止BCAS-induced记忆障碍和海马神经元损失和bcl - 2细胞凋亡,促进了比伯灵顿表达在海马体(行为测试后)。相反,G15 (185μ克/公斤),GPR30的拮抗剂,加重BCAS-induced海马神经元损失和细胞凋亡。最后,药物分子对接指出Rg1较低结合能GPR30与伯灵顿和bcl - 2。在一起,我们的数据表明,人参皂苷Rg1防止认知障碍和VD大鼠海马神经元细胞凋亡,可能是通过促进GPR30的表情。这些结果将提供重要意义Rg1治疗VD的应用。

1。介绍

血管性痴呆(VD)是一种认知障碍综合症引起的脑灌注不足或缺血性脑血管疾病,其中包括病理变化在海马和皮层等脑区(1]。VD患者存在记忆障碍以及行为和心理症状,如焦虑和抑郁2]。目前,VD已经成为第二大类型的痴呆威胁老年人在老年痴呆症,约占-20%的老年痴呆症患者(15%3,4]。

人参已被广泛用于治疗有机和心身疾病自古以来5]。皂苷含量,特别是人参皂苷Rg1,被认为是人参的主要活性成分(6]。药代动力学研究表明,Rg1穿过血脑屏障,可以广泛分布在大脑7,8]。就是明证,Rg1在促进本次高功效,改善神经可塑性和免疫等。9- - - - - -11]。尤其是Rg1在老年痴呆症的治疗进行了广泛的调查,比如改善认知功能障碍小鼠阿尔茨海默病(12]。有趣的是,Rg1也报道,防止在VD大鼠认知障碍和神经损伤13),但离开的机制在很大程度上打开。

G protein-coupled雌激素受体1 (gp,也称为GPR30)是一个7-transmembrane G protein-coupled受体由375个氨基酸组成,已被确认为一种新的雌激素膜受体(14]。GPR30的激活是有利于神经系统疾病和心血管疾病15- - - - - -17]。GPR30参与各种脑部疾病的治疗和中介的各种神经功能,通过调节神经传递素的释放18]。GPR30激活可以改善帕金森病和脑血管疾病(19,20.)以及缺血性脑血管疾病,有可能通过减少神经元死亡引起的缺血,衰减炎症反应等。21,22]。此外,GPR30还在对抗衰老中起着重要的作用23,24]。然而,GPR30的势函数在VD仍不清楚。

人参皂苷Rg1类固醇种类固醇骨架结构,它可以激活雌激素受体通过其特点的雌激素发挥神经保护作用[25]。Rg1报道规范GPR30在帕金森病模型,消除神经炎症(26]。双边颈总动脉狭窄(bca)是公认的轻微减少脑血流量和特定的白质损伤(27]。在这项研究中,bca的小鼠模型是用来研究的潜在角色GPR30在人参皂苷的保护作用对VD Rg1。

2。材料和方法

2.1。动物和药物

雄性C57BL / 6 j小鼠(3个月大的时候,20 - 25 g)购买来自安徽医科大学实验动物中心(许可证号码:SCXK (Wan) 2016 - 0009)。老鼠被保存在一个房间的温度 45 - 65%的相对湿度和经历了12 h光/暗周期提供食物和水随意。所有动物程序伦理委员会批准安徽中医药大学(合肥,中国)。

人参皂苷Rg1得到从原液生物技术( ,上海原液生物技术,中国)。GPR30受体激动剂(G1)和GPR30抑制剂(G15)从Tocris购买(英国布里斯托尔)。Rg1, G1, G15溶解在二甲亚砜(DMSO)和悬浮在盐水(DMSO浓度低于0.1%)和对照组被注射同样体积的生理盐水。

2.2。双侧颈总动脉狭窄(bca)小鼠模型

1%戊巴比妥钠的小鼠麻醉(45毫克/公斤)。通过颈中线切口,暴露颈总动脉(CCA)和释放他们的鞘。两个4 - 0的针脚缝合被放置在远端和近端部分右CCA。然后,动脉被这些缝合线轻轻举起,放在循环之间的microcoil略低于颈动脉分叉。缠绕了microcoil CCA周围旋转。30分钟后,另一个相同大小的microcoil缠住了左CCA。直肠温度维持在36.5°C和37.5°C。停止脑血流量(CBF) > 1分钟是可以避免的。cca的直径直接检查与手术显微镜下测量(模型OMK2,奥林巴斯光学有限公司)在应用microcoils之前。在虚假的集团,只有双边CCA被曝光和孤立麻醉后,然后,伤口缝合。 The death rate of the animals during BCAS was about 22%, which was consistent with previous publication [28]。没有虚假的组的死亡。

2.3。实验小组
2.3.1。实验组1

实验随机分为5组( )(图1(一)):一个虚假的组和四个模型组。海马体收集后在4分的时候建模(30分钟,3 h、6 h和24 h)的实时PCR(图1(一))。

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图1
示意图说明了研究设计。(一)7天的老鼠了。此后,bca产生,海马组织收集30分钟,3 h, 6小时,24小时后。(b) 7天的老鼠了。老鼠在Rg1组收到低,中,高剂量的Rg1连续14天(每天注射一个)。Rg1管理七天后,bca产生的老鼠。(c) 7天的老鼠了。Rg1组的老鼠HRg1连续14天(每天注射一个)。Rg1管理七天后,bca产生的老鼠。G1和G15团体,老鼠收到bca G1和G15紧随其后,分别。 After treatments, Morris water maze was conducted. After the behavioral tests, the animals were decapitated following anesthesia with isoflurane (5%) and the hippocampi were collected.
2.3.2。实验组2

实验随机分为六组( (图1 (b)):一个虚假的组,模型组,LRg1组(0.1毫克/公斤),MRg1组(1毫克/公斤)HRg1组(10毫克/公斤)组,和一个控制+ Rg1(10毫克/公斤)。动物腹腔Rg1组管理与Rg1连续14天(每天注射一个)。Rg1的剂量是根据我们之前选择出版(11]。其他组的动物收到类似的体积的生理盐水。

2.3.3。实验组3

实验随机分为5组( )(图1 (c)):一个虚假的组,模型组,模型+ Rg1(10毫克/公斤)组,GPR30受体激动剂(G1) +模型组,和GPR30抑制剂(G15) +模型组。动物模型+ Rg1组腹腔内管理与Rg1注入每一天连续14天。在G1 +模型和G15 +模型组,G1的老鼠与一个注入管理(5μ克/公斤皮下注射(sc)和G15 (185)μ克/公斤,sc)建模后每天连续7天。G1的剂量和G15选择通过引用以前的出版物(29日]。

2.4。莫里斯水迷宫(微波加工)

微波加工进行手术后一周评估不同群体之间的行为表现(如前所述)(30.]。药物治疗后22天,老鼠开始日-微波加工测试5天培训组成的可见平台实验以及空间探测试验在第六天。动物被允许在90年代探索平台,在这个平台上10年代。如果鼠标没有在90年代达到平台的训练是终止动物用手轻轻地指向平台30年代。探针测试了6天。行为测试,动物被斩首后与异氟烷麻醉后(5%)和海马被收集。

2.5。实时定量PCR (qPCR)

30分钟、3 h, 6 h, bca 24 h后,老鼠与异氟烷麻醉(5%)和斩首。此后,海马是孤立的冰上。总RNA提取试剂盒试剂(豆类生物Inc .)和相对地转录成cDNA使用逆转录工具包(Beyotime生物技术研究所,中国)。循环参数如下:最初在95°C变性10分钟,其次是40的循环顺序孵化项目在95°C为15秒和60°C 1分钟。循环结束后,数据分析使用仪器的支持软件获取周期阈值(Ct值)。GPR30表达式是规范化glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase 2 (GADPH)和计算——∆∆CT方法如前所述[31日]。引物是列出如下:GPR30(向前5 - - - - - -TCATTTCTGCCATGCACCCA-3 和反向5 - - - - - -GTGGACA-GGGTGTCTGATGT-3 )和GAPDH (5 - - - - - -AACTTTGGCATTGTGGAAGG-3 和反向5 - - - - - -ACACATTGGGGGTAGGAACA-3 )。

2.6。西方墨点法

添加了海马组织蛋白裂解的解决方案(里帕: :1)和均质溶解检测伯灵顿的表达,bcl - 2, GPR30。蛋白质样本由十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶(12%)50分钟在120 V和转移到硝化纤维膜为2 h 200 mA。包含0.1%的膜被封锁与PBS Tween-20 (PBST)和5%无脂牛奶在室温下2小时。阻塞后,膜与初级孵化抗体伯灵顿(1:1000年,细胞信号技术(CST),丹弗斯,妈,美国),bcl - 2(1: 1000年,春秋国旅,丹弗斯,妈,美国),和GPR30(1: 1000年,春秋国旅,丹弗斯,妈,美国)在一夜之间在4°C。洗了三次后PBST ( ),膜是孵化与辣根peroxidase-conjugated山羊anti-rabbit免疫球蛋白g(1: 10000年,Zs-bio)在室温下2 h。最后,膜的开发与化学发光的解决方案(ECL,热费希尔技术,美国)。ImageJ软件被用来分析的光学密度。

2.7。免疫组织化学染色

老鼠的大脑在4%多聚甲醛固定24小时,cryoprotected在30%蔗糖24 h在4°C,并在冷冻切片机切片在20μ被封锁在0.1 m。部分磷酸盐(PBS)山羊血清含10%,0.4% tritonx - 100对1 h,然后孵化主要抗体NeuN(1: 400年,春秋国旅,丹弗斯,妈,美国)。作文的主要抗体稀释包括PBS含有0.3% Triton x - 100和1%牛血清白蛋白(BSA)。PBS的部分被洗3次(每15分钟),然后用山羊孵化anti-rabbit免疫球蛋白g h和l (Alexa萤石®488)(1:200年,生活技术,卡尔斯巴德,CA,美国)在室温下2小时。海马神经元的形态是在显微镜下观察(奥林巴斯、东京、日本)。ImageJ软件用于计算NeuN的数量+细胞。

2.8。TUNEL染色

老鼠的大脑在4%多聚甲醛固定24小时,cryoprotected在30%蔗糖24 h在4°C,并在冷冻切片机切片在20μm。TUNEL染色根据指令进行TUNEL细胞凋亡的检测设备(Beyotime生物技术研究所,中国)。染色后,图像被FV1000奥林巴斯共焦激光扫描显微镜(奥林巴斯、东京、日本)。ImageJ软件被用来分析图像并计算凋亡细胞的数量。

2.9。药物分子对接

验证人参皂苷的结合能Rg1目标蛋白质,我们监控分子之间的对接人参皂苷Rg1和GPR30 (PDB ID 4 * 13),伯灵顿(PDB ID 4 s0o),分别和bcl - 2 (PDB标识4 cim)。我们下载了3 d PDB GPR30的格式文件,伯灵顿,bcl - 2从PDB数据库和活性成分的2 d自卫队PubChem数据库和2 d结构导入到ChemBio3D14.0结构优化软件和显示3 d mol2结构。然后,我们进口药物分子和蛋白质进入加氢AutoDock工具,负责计算、原子之外,根对接。算法局部搜索参数,结合能越低表示,对接的结果就越好。我们使用Pymol软件分析对接的结果。

2.10。统计分析

这样的数据 (SEM)和分析GraphPad Prism 5.0软件(GraphPad Inc .)、圣地亚哥、钙、美国)。单向方差分析Bonferroni紧随其后的测试应用于比较差异。的值 被认为是显著的。

3所示。结果

3.1。bca对海马的GPR30 mRNA表达的影响

GPR30 mRNA的表达在30分钟,3 h, bca 6 h, 24小时后被发现。30分钟,3 h、6 h和24小时后bca, GPR30海马的表达式在mRNA水平高于假组(图2, ),后建议GPR30的表达增加bca的建模。


图2
bca建模促进海马GPR30的表达。GPR30 mRNA表达被提升30分钟、3 h, 6 h和24小时后的海马bca。 ,与虚假的( 在每组)。
3.2。人参皂苷的影响Rg1在海马体GPR30的表达

qPCR和免疫印迹结果表明GPR30在mRNA和蛋白水平的表达在海马体在模型组明显高于那些虚假的组(数字3(一个)和3 (b))。与模型组相比,无显著差异的表达GPR30在低剂量组小鼠的海马Rg1,虽然GPR30在信使rna和蛋白质的表达水平高、中剂量的人参皂苷的海马Rg1组调节显著(图3(一个)和3 (b), )。相比之下,在正常的动物,用人参皂苷治疗Rg1没有促进GPR30在海马体(图表达3 (c), )。

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图3
人参皂苷Rg1促进海马GPR30表达式bca模型动物,但没有影响正常的动物。(一)GPR30 mRNA表达;(b) GPR30蛋白表达小鼠的海马中接收bca和人参皂苷Rg1;(c) GPR30蛋白表达在正常小鼠的海马收到人参皂苷Rg1。 ,与虚假的;# ,与模型组( 在每组)。
3.3。人参皂苷Rg1 bca模型小鼠改善记忆

我们还测试了Rg1治疗后空间记忆。学习趋势组间并没有改变在训练(图4(一))。然而,记忆检索由平台象限的时间显著延长G1-treated Rg1-treated老鼠,老鼠在G15-treated显著降低(图4 (b),而模型中, )。这些结果表明,G1和Rg1 bca模型小鼠的记忆力提高。

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图4
人参皂苷Rg1 bca模型动物的改善记忆。(一)延迟发现平台在5天的培训。在目标象限(b)的时间。 ,与虚假的;# ,与模型组( 在每组)。
3.4。人参皂苷的影响Rg1在海马神经元损失由bca建模

GPR30的表达是最重要的增加在高剂量人参皂苷组,高剂量的人参皂苷被选中在后续实验。此外,GPR30受体激动剂(G1)和拮抗剂(G15)被选来验证GPR30的功能。免疫组织化学染色结果表明,bca建模刺激海马神经元的损失比虚假的集团(数字5(一个)- - - - - -5 (c)),而人参皂苷Rg1或G1治疗预防BCAS-induced神经元损失。相比之下,G15的损伤进一步加重bca(图5 (c)与模型, )。

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图5
人参皂苷Rg1抑制BCAS-induced海马神经元的损失。(一)观察区域;每组(b)代表的图像;酒吧规模:50μm;(c) NeuN+细胞计数。 ,与虚假的集团# ,与模型组( 在每组)。
3.5。人参皂苷的影响Rg1 Apoptosis-Related蛋白质的海马神经元细胞凋亡和表达bca小鼠模型

TUNEL染色显示,bca建模造成海马神经元细胞凋亡与虚假的集团相比,在人参皂苷Rg1和G1治疗改善bca建模(图引起的神经细胞凋亡6(一))。模型组的凋亡细胞计数显著增加而虚假的集团。与模型组相比,海马凋亡细胞计数的人参皂苷高剂量组和G1组显著降低(图6 (b),P< 0.05)。G15进一步加剧引起的细胞凋亡bca建模(图6 (b)与模型, )。

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图6
人参皂苷Rg1抑制海马神经元细胞凋亡诱导bca建模。(一)TUNEL染色;箭头表示凋亡细胞;酒吧规模:50μm。(b)凋亡细胞计数;(c) bcl - 2、Bax表达水平和bcl - 2、Bax代表乐队。 ,与虚假的集团# ,与模型组( 在每组)。

免疫印迹结果表明,海马bcl - 2 /伯灵顿的比例模型组小鼠与虚假的组相比显著降低。与模型组相比,海马的比率bcl - 2、Bax Rg1管理组和G1组显著增加(图6 (c), )。

3.6。分子对接模式和结果

如人参皂苷Rg1 GPR30的影响、伯灵顿和bcl - 2表达,我们进一步研究了与GPR30 Rg1的可能关系,伯灵顿,bcl - 2。分子对接结果表明Rg1与GPR30低结合能比伯灵顿和bcl - 2(图7)。结合能Rg1和GPR30之间、bcl - 2或伯灵顿为-4.69,-0.53,和-0.17千卡每摩尔。

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图7
分子对接模式和结果。(一)分子对接结果Rg1 GPR30;(b)的分子对接结果Rg1和伯灵顿;(c)的分子对接结果Rg1和bcl - 2。结合能Rg1和GPR30之间、bcl - 2或伯灵顿为-4.69,-0.53,和-0.17千卡每摩尔。

4所示。讨论

我们的研究结果表明,Rg1 bca模型小鼠的记忆力提高。值得注意的是,Rg1 GPR30水平增加和改善海马神经元损失和细胞凋亡。这些数据提供了重要的证据支持Rg1在VD的保护作用。

人参已经使用了数千年治疗衰老和记忆障碍(32]。人参提取变弱神经损伤和认知缺陷在VD大鼠(33]。皂苷含量,人参的主要活性成分,发挥重要作用在中枢神经系统(CNS)疾病和广泛作用于细胞膜受体(34]。几项研究已经表明,人参皂苷Rg1可以改善化疗所致认知障碍的认知功能,重复酒精exposure-induced认知缺陷,和阿尔茨海默病(12,35,36]。此外,人参皂苷Rg1有改善效果在不同的脑损伤,如局灶性脑缺血损伤,糖尿病复杂的脑梗塞,ischemic-reperfusion脑损伤(37- - - - - -39]。因此,它具有重要意义对Rg1对VD的影响进行调查。然而,很少有研究对VD的保护机制,及其机制尚不清楚,尽管可能的机制包括细胞凋亡、氧化应激和炎症13]。

在中枢神经系统,雌激素典型有益营养神经,抗氧化,抗炎,antiapoptosis [40]。一项研究表明,雌激素还可以增加prosurvival因素bcl - 2的表达在海马神经元41]。营养神经的功能充分雌激素可以保护神经生长因子,减少神经元的损伤42]。雌激素发挥其生物效应调节雌激素膜受体(43]。作为一种新型的雌激素膜受体GPR30的激活可能在生物过程有重要作用。激活GPR30在心肌缺血可以防止心肌细胞损伤起到保护作用,维持线粒体功能(44]。GPR30的upregulation调节bcl - 2表达的增加,从而防止mitochondrial-dependent细胞凋亡,这可能是通过激活PI3K / Akt通路(45,46]。GPR30的表达是血清雌激素水平的影响47),排除这个因素,雄性动物或切除卵巢的雌性动物(OVX)通常用于estrogen-related研究。GPR30表达增加缺血再灌注后OVX雌性老鼠(22]。在这里,我们选择雄性老鼠,结果表明,bca建模提升GPR30的表达在雄性老鼠的海马,这表明脑缺血引起的bca可能激活GPR30在某种程度上,发挥神经保护作用。

人参皂苷Rg1至于活动和可能产生雌激素的影响通过快速激活膜相关ER和GPR30 [48]。我们的研究表明,人参皂苷治疗促进GPR30的表达bca模型小鼠海马的但没有影响GPR30的表达在正常的动物。此外,分子对接结果表明Rg1与GPR30结合能较低。这进一步表明,人参皂苷Rg1可能激活GPR30通过雌激素的特性。我们对待动物GPR30受体激动剂和GPR30抑制剂,表明GPR30受体激动剂治疗改善BCAS-induced神经元损失和细胞凋亡,而GPR30抑制剂加剧BCAS-induced神经元损失和细胞凋亡。最近的研究发现,GPR30的表达不仅是由雌激素,但GPR30的规定由微rna也是一个重要信号通路(49]。因此,进一步研究GPR30的上游监管途径和具体机制之间的联系人参皂苷Rg1 GPR30是必要的。

海马体是一个重要的在与学习和记忆相关的大脑区域50- - - - - -53]。有人建议,海马体是最重要的地区的短暂脑缺血脑损伤,这是符合病人的病理特征与全球脑缺血引起的心脏骤停(54,55]。我们的研究表明,Rg1预处理可以抑制BCAS-induced海马神经元损失,表明Rg1可以改善脑缺血引起的海马神经元损害。神经损伤引起的脑缺血(包括细胞凋亡和坏死52]。在脑缺血的早期阶段,神经元死亡是细胞凋亡的主要模式(56]。有许多途径调节细胞凋亡,他们互相影响和规范在不同的水平。的bcl - 2基因家族在细胞凋亡过程中起着决定性的作用。它包括抗凋亡因子bcl - 2和伯灵顿proapoptotic因素。bcl - 2、Bax函数作为一个二聚体,和两者之间的比例决定了细胞凋亡57]。我们的研究结果表明,Rg1预处理可以抑制BCAS-induced海马神经元凋亡。我们选择bcl - 2、Bax调查apoptosis-related通路。数据表明,人参皂苷Rg1逆转率的降低引起的海马的bcl - 2、Bax bca建模,进一步证实Rg1在海马神经元凋亡的保护作用。在细胞死亡有多种方法,Rg1减轻细胞死亡通过影响其他死亡通路,如坏死和pyroptosis [58,59]。此外,存在由小胶质细胞M1极化和NLRP3 inflammasome途径激活也可能导致大脑损伤(30.,60,61年]。Rg1也可能减轻VD通过影响这些死亡通路,需要进一步调查。

总之,人参皂苷在bca Rg1提高海马神经元损伤模型小鼠,在血管性痴呆和GPR30扮演一个关键的角色。我们的研究将为应用程序提供重要含义Rg1或中药与人参皂苷Rg1治疗VD的主要组件。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的结果包括在本文中。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

凤鸣沈和胡安王同样贡献了他的工作。

确认

这项研究得到了国家自然科学基金(82004481),安徽省自然科学基金(1808085 j15),安徽省省级自然科学研究项目(KJ2019A0474),安徽大学优秀的高级人才培养的基础(gxgnfx2020089),安徽省和关键研究和发展计划(202104 j07020004)。