改善认知功能在一个Bushen-Tiansui公式β_1-42Fibril-Infused阿尔茨海默病大鼠模型

文摘

Bushen-Tiansui公式(BTF)经验更新从一个名叫Kong-Sheng-Zhen-Zhong经典处方药丸。它是基于中医理论的大脑和肾脏之间的相互关系,旨在治疗神经退行性疾病。多年来这个配方已经用于治疗阿尔茨海默氏症患者——(广告)像在我们的临床症状。然而,药用成分和BTF的机制提高认知和记忆功能没有的特点。在这项研究中,我们使用UPLC-MS生成BTF的色谱指纹图谱,确定五个可能的活性成分,包括对称二苯代乙烯糖苷;epimedin A1, B和C;淫羊藿。浓度和我们还表明,口服的BTF逆转的认知缺陷β_1-42fibril-infused广告的大鼠模型,在CA1区突触超微结构的保护,和恢复脑源性神经营养因子的表达,synaptotagmin (Syt)和PSD95。这些影响可能发生通过BDNF-activated受体酪氨酸激酶B (TrkB) / Akt /分子信号通路。此外,BTF展出任何短期或在大鼠慢性毒性。在一起,这些结果提供了一个科学支持BTF的临床使用AD患者改善学习和记忆。

1。介绍

阿尔茨海默病(AD)是老年痴呆的主要原因,但是这种疾病的病因和发病机理尚未为特征。的积累β淀粉样肽(β)在大脑和hyperphosphorylation和乳沟microtubule-associated Tau蛋白是广告的标志(1]。然而,在过去的十年里,一系列新药设计神经原纤维缠结清楚未能改善或逆转的广告,这表明,神经原纤维缠结与患者的痴呆程度弱相关的广告(2]。相比之下,突触损失已经强烈与认知障碍相关,而且可能在广告认知变化的病理基础(3]。

神经营养因子是生长因子调节神经发展,分化和生存。脑源性神经营养因子(BDNF)是一个重要的生成,在中枢神经系统中广泛分布。脑源性神经营养因子与受体酪氨酸激酶B (TrkB)和触发器的激活下游TrkB / Akt和TrkB /分子信号通路,导致合成synaptotagmin (Syt)和PSD95突触。Synaptotagmin和PSD95授予保护通过调节突触的修复和重建神经回路与痴呆(改善动物的学习和记忆4- - - - - -6]。研究表明,BDNF的表达降低AD患者的大脑中突触的损失(7]。的策略使用BDNF作为神经系统疾病的治疗代理在此基础上进行临床前证据。不幸的是,一些临床试验的结果包括鞘内注入重组脑源性神经营养因子治疗肌萎缩性脊髓侧索硬化症患者由于短一直令人失望在活的有机体内半衰期和穷人的脑源性神经营养因子(8,9]。因此,小说直接刺激生产和BDNF的表达策略探索药物可能会导致更好的治疗结果。

面对广告的治疗复杂性,越来越多的报道表明,中国传统医学公式(TCMFs)和多目标效应可以导致认知功能的改善(10- - - - - -12]。Bushen-Tiansui公式(BTF)是来自经典的处方,Kong-Sheng-Zhen-Zhong丸(前进公式),并从这个经典经验修改处方通过调整成分和比例的草药。其公式是为了满足神经退行性疾病和体现了中医理论的大脑和肾脏之间的相互关系,核心语句的肾功能不足导致脑髓损失,和肾生脑大脑存储骨髓(13]。BTF已经使用多年来治疗患者广告在我们的临床症状。尽管如此,BTF的药理成分,而他们的机制提高认知和记忆功能,没有特点。我们之前,淫羊藿,浓度的研究报道,主要活性成分草淫羊藿brevicornum(Yin-Yang-Kuo)属于BTF的草药之一,突触可塑性的一个提高β_1-42大鼠模型的广告(14]。作为一个单一的化合物,然而,这将是一项长期的任务开发成一个创新的有前途的药物临床使用。

在本研究中,我们BTF的配方组成和生成的色谱指纹档案。我们也评估了BTF对认知和记忆功能的影响在老鼠模型的广告和评估BFT-induced BDNF的表达和激活TrkB / Akt /分子级联信号通路。我们的研究为临床应用提供科学支持患者的BTF改善学习和记忆的广告。

2。材料和方法

2.1。制备BTF提取

BTF由六个草药混合比例的总结在图1(一)。所有提到的植物名称可以检查数据库后http://www.theplantlist.org。草药的名字和中国名字是来自中国药典2015年版的。所有的草药BTF的中医药房购买的第二个湘雅医院,中南大学(CSU)湖南长沙。凭证标本(201605301 - 6)以及沉积的综合中西医在湘雅第二医院,基督教社会联盟。草药浸泡在ddH的10倍₂O ( )1 h,然后煮两次1 h。两个煮的解决方案相结合,集中在真空然后冻干收益率冻干粉(输出率为14.3% ( ))。BTF的冻干粉是储存在-20°C到使用。

2.2。BTF提取物的色谱指纹图谱分析

Ultrahigh-performance液体chromatography-tandem质谱仪(UPLC-MS)是用来分析BTF的主要组件。标准化合物包括对称二苯代乙烯糖苷(BWB50367) epimedin A1 (BWB50192) epimedin B (asb - 5159 - 010), epimedin C (asb - 5160 - 010),淫羊藿(GBW09541)浓度和从国家标准中心购买。CNW雅典娜C₁₈wp列( ,5μ米)被用作固相,保持在35°C,频谱分析。水的混合物(A)和CH₃CN (B)是作为流动相梯度洗脱率如下:清廉分钟20% - -30% B, B 10-22分钟30%,22 - 25分钟30 - 33% B, B . 25 - 30分钟33 - 80%监控波长为270 nm流量为0.5毫升/分钟。电喷雾电离(ESI)模式用于质谱分析毛细管电压为3500 V。

2.3。一个β_1-42预先形成原纤维制备

一个β_1-42美国(σ)溶解在hexafluoroisopropanol 1毫克/毫升(HFIP)在室温下然后在洗澡用超声发生器为5分钟。HFIP是使用温和的氮气流蒸发,然后九卷涡偶尔加入了冰冷的蒸馏水。保持30分钟的解决方案在冰上,一卷10 x fibril-forming缓冲区(0.2 M NaPi, 1.5 M氯化钠,0.2% NaN₃、pH值7.5)添加和涡重复。我们密封解决方案管和储存在37°C的一个星期,每天漩涡。原纤维形成使用Thioflavin T绑定验证了试验根据以前的报告(15]。的一个β纤维被储存在-80°C。

2.4。一个β_1-42Fibril-Infused鼠模型和BTF治疗

的一个β_1-42fibril-infused鼠模型建立了描述在我们之前的研究14]。总之,成年男性Sprague-Dawley (SD)大鼠(重量:200−220 g)与异氟烷麻醉,然后固定在一个立体定向仪。的一个β_1-42原纤维(3μL)是双边的侧心室率0.5μL / min(来自前囱、前后的(美联社)−1.0毫米,1.5毫米侧矢状缝,和硬脑膜下4.6毫米)。同等体积的无菌生理盐水注射是虚假的集团( )。输液3天之后,老鼠,收到了β_1-42注入被随机分配到两组( 为每个组)。根据临床使用剂量,口头测试组管理27 g / kg BTF,另一组是口服接种无菌生理盐水的体积相同。动物为28天每天服用一次。老鼠被分配到性别和年龄的治疗组使用一个随机区组设计。整个实验周期图中所示2(一个)和实验过程的审查委员会批准中南大学(长沙,中国)。

2.5。莫里斯水迷宫测试

莫里斯水迷宫试验后28天BTF的开始干预。老鼠在三组训练轮,油墨稀释水浴缸( )丰富的环境中额外的迷宫的线索。一个看不见的逃避平台( )是坐落在一个固定的空间位置1厘米低于水面独立利用额外的迷宫的线索来确定平台的位置。在每个试验的开始,老鼠被放置在水迷宫用它的爪子碰到墙从四个不同的起始位置(N, S、E和W)。老鼠受到四个试验连续5天每天intertrial间隔15分钟。最大试验长度是60年代,老鼠手动引导,如果他们没有在规定时间内到达平台。到达无形的逃生平台,老鼠离开上一个额外的10年代允许调查环境中的空间线索来指导未来的导航到这个平台上。水的温度每小时监控和维护22和25°C之间。收购后,5天的任务,提出了一种探测试验平台时,平台过境点的数量和时间的百分比的象限之前包含逃生平台任务收购期间被记录在90年代。整个审判过程和行为的分析参数记录通过ANY-maze视频跟踪系统(美国Stoelting有限公司)。

2.6。电子显微镜

突触超微结构检测是由电子显微镜如前所述16]。短暂,深麻醉后,老鼠灌注transcardially用4%多聚甲醛在PBS。海马切片后缀在寒冷的2.5%戊二醛,然后脱水,浸泡,通过分级丙酮和嵌入式系列。嵌入式部分是dual-stained与醋酸双氧铀及柠檬酸铅和可视化在100千伏透射电子显微镜(日立公司(Hitachi Ltd .)、东京、日本)。突触进行评估的存在突触囊泡和突触后密度,包括突触的数量,每个突触间隙的宽度,突触后密度的厚度和长度的突触活性区。

2.7。西方墨点法

西方墨点法进行了使用标准协议。大鼠海马组织用和细胞溶解里帕裂解缓冲,和不溶性颗粒被离心15000 g×15分钟在4°C。蛋白质浓度测定采用BCA法和溶菌产物被储存在-80°C到分析。等量的蛋白质(30 - 40μg)加载了印迹anti-p-TrkB / TrkB (1: 1000 # sc - 8058 / # sc - 7268,圣克鲁斯生物技术、钙、美国),anti-p-Akt / Akt (1: 1000 # 4060 / # 9272), anti-p-CREB /分子(1:500 # 9189 / # 9197),anti-Syt(1: 1000 # 14558),和反psd - 95(1: 1000 # 2507)(细胞信号技术,丹佛,妈,美国),和anti-BDNF (1: 500, # 108319, Abcam,剑桥,英国)。

2.8。免疫组织化学

免疫组织化学(包含IHC)进行可视化BDNF和p-Akt根据制造商的指示(表达载体)。简单地说,自由浮动的25μ米厚的串行海马部分处理0.3%过氧化氢10分钟,然后,部分被冲洗三次PBS和阻塞试剂1 10分钟紧随其后孵化与脑源性神经营养因子(1:300)或p-Akt(1: 500)抗体在一夜之间在4°C。PBS洗涤后,部分孵化与生物素化的第二抗体试剂1 b紧随其后的是共轭酶试剂2为每10分钟。最后,发色体原子能委员会单一的解决方案是利用开发的信号和捕获在一个显微镜(BX51TF,奥林巴斯、东京、日本)cellSens标准V3检测系统。

2.9。苏木精和伊红染色

收集多个器官,立即就被固定在4%的甲醛。浸泡后,器官被逐步浸泡在酒精脱水,二甲苯,嵌入在石蜡,然后切成5μ米厚的部分,与标准的苏木精和伊红染色(圆))染色协议(17]。下部分是可视化数字光学显微镜(奥林巴斯、东京、日本)。

2.10。统计分析

统计分析了棱镜7.0 (GraphPad软件)。所有数据都表示为 。从三个或更多独立的实验。组织学分析的数据单向方差分析。意义的阈值被设定为所有实验 ,和小值表示为 和^# 。

3所示。结果

3.1。BTF的色谱指纹图谱分析

中药的药理效应公式(TCMFs)来源于活性化合物的组合。探讨可能的BTF的主要药用成分,成分的定性评估初步UPLC-MS系统和色谱指纹特征如图成立1 (b)。大约14个色谱峰中可以定义BTF的特征。根据 比女士发现,五个峰(峰1 - 5)被确定为对称二苯代乙烯糖苷(峰值1, 405.1216 (mh)^{- - - - - -}),epimedin A1(峰2, 837.5901 (mh)^{- - - - - -}),epimedin B(峰值3, 807.2715 (mh)^{- - - - - -}),epimedin C(峰值4, 821.2855 (mh)^{- - - - - -}淫羊藿(浓度)和峰值5, 677.2433 [M + H]⁺)(图1 (b))。这些化合物的化学成分首乌说明附子和草Epimedii Brevicornus基于前面的植物化学研究[18,19]。此外,标准物质为购买这五个化合物及其混合溶液进行UPLC-MS分析相同的洗脱条件。色谱显示相似的紫外吸收光谱的比较,每个峰的保留时间。因此,这些数据表明,对称二苯代乙烯糖苷;epimedin A1, B和C;淫羊藿是浓度和特点在BTF组件。

3.2。口服的BTF救助认知缺陷β_1-42Fibril-Infused老鼠

评估广告的BTF对认知功能的影响模型,hippocampus-dependent空间记忆β_1-42莫里斯fibril-infused老鼠是评估使用水迷宫测试。平均逃避延迟隐藏的平台为每个5收购天计算和绘制(数字2 (b)和2 (c))。双向混合方差分析( )延迟了一个训练日的主要作用( )和集团( ),但是没有交互(图2 (b))。逃避的AUC延迟是saline-treated大大增强β_1-42fibril-infused老鼠的价格相比虚假的集团,这表明受损收购后空间学习intracerebroventricular注入的β_1-42原纤维。平台位置记忆被删除调查试验中接受了评估平台,让老鼠寻找90年代。与假组相比,saline-treatedβ_1-42fibril-infused老鼠的比例显著降低时间和更少的平台网站穿越的象限里隐藏的平台,这是表明严重的赤字在空间记忆。与假组大鼠相比,Aβ_1-42fibril-infused老鼠对待BTF显著更大比例的时间都花在目标象限和越过目标象限更频繁(数据2 (d)- - - - - -2 (f)),这证明了空间记忆的救援。

3.3。口服的BTF阻止突触丢失β_1-42Fibril-Infused老鼠

突触损失和减少海马突触可塑性的基础被认为是认知障碍的早期阶段的广告(20.]。我们直接量化的突触密度和evaluatedsynaptic超微结构参数在海马的CA1区使用电子显微镜(EM)。Saline-treated一β_1-42fibril-infused老鼠显示显著降低突触密度、穿孔突触,突触活性区长度、厚度和突触后密度和增加突触间隙宽度。BTF的口服显著逆转这些超微结构的变化,但没有改变突触界面(数据的曲率3 (c)- - - - - -3 (g))。来证实这些发现,我们进行免疫印迹的突触前标记synaptotagmin和突触后PSD95标志。Saline-treated一β_1-42fibril-infused老鼠显示大大降低了表达synaptotagmin PSD95,在这个广告表明突触退化模型。治疗BTF逆转β_1-42fibril-induced减少突触标记表达式(图3 (h))。这些结果表明口服BTF抑制突触的丧失和突触可塑性在改善β_1-42fibril-infused老鼠。

3.4。BTF促进BDNF表达和激活下游信号通路在老鼠大脑

探索BTF改善认知功能的可能机制β_1-42fibril-infused老鼠,我们调查了BDNF及其下游信号通路。行为测试之后,我们监控BDNF表达在老鼠的大脑通过免疫印迹分析使用一个anti-BDNF抗体。令人惊讶的是,定量分析显示脑源性神经营养因子在BTF-treated恢复到正常水平β_1-42fibril-infused老鼠。此外,磷酸化TrkB的表达,但不是总TrkB BTF治疗后明显升高(图4(一),1 - 3^th面板)。正如所料,主要蛋白质TrkB信号通路被磷酸化,更加突出β_1-42fibril-infused老鼠对待BTF比使用生理盐水治疗,是一种蛋白激酶的激活下游/分子信号级联(图4(一)),导致突触PSD95的合成。这些结果证实了免疫组织化学染色(包含IHC)大鼠海马使用anti-BDNF(图4 (b))和p-Akt S473(图4 (c))。因此,这些数据表明,促进脑源性神经营养因子表达的BTF治疗导致激活其下游TrkB-Akt /分子信号级联可能负责认知功能改善AD大鼠。

3.5。没有毒性大鼠口服BTF的礼物

药品安全是一个重要的考虑在临床调查。作为一个强制性的实验中,我们进行了为期12周的慢性BTF的毒性研究Sprague-Dawley (SD)大鼠(200 - 220 g)的每日剂量54克/公斤。连续每周体重记录和圆)染色的组织部分从多个器官(心、肝、脾、肺、肾、睾丸、卵巢)显示,老鼠之间没有明显差异实施的管理与生理盐水(BTF和数字5(一个)和5 (b))。此外,血液中的红细胞,HB,白细胞,ESR在正常范围的老鼠接受BTF(数据没有显示)。因此,本研究支持BTF的口服治疗广告是安全的和值得信赖的。

4所示。讨论

中国传统医学公式(TCMFs),开发了基于整体身体的理论在中国传统医学(中医),已经被历史证明是有效的治疗人类疾病的药物。Kidney-brain交流和互惠是中医最重要的理论之一。这一理论指出,肾脏是一个制片人的脑,大脑和骨髓的精神就足够了,如果肾脏是旺盛的13]。现代医学流行病学数据显示,个人在慢性肾脏疾病(CKD)的所有阶段的风险较高,发展认知障碍和痴呆(21]。研究已经证明,血管损伤,内皮功能障碍,直接神经毒性可能是潜在因素的病理生理的链接kidney-brain轴(22- - - - - -24]。“Kong-Sheng-Zhen-Zhong”药丸详细在古典医学书“浅近公式”孙思邈所写,一个著名的中国古代医学专家。这个公式是由许多营养的草药补充重要的本质实现治疗目标,温补肾阴,滋养骨髓(25]。Bushen-Tiansui公式是一个经验的改进版本Kong-Sheng-Zhen-Zhon药丸在我们部门开发的通过调整成分和比例的草药,和BTF在神经系统疾病中的应用的发展是基于理论kidney-brain轴。它已被证明能够有效地治疗神经退行性疾病,包括广告。具体来说,BTF临床部门在实践中已被证明有效改善患者的认知和记忆功能的广告。我们发现对BTF色谱指纹的发展通过现代分析技术和表征BTF的机制提高认知的扩展使用这个公式提供了科学依据。

UPLC UPLC-MS结合高效的分离能力和大国在女士的结构特征和提供了一个新的强大的方法来识别成分TCMFs迅速和准确26]。此外,二极管阵列检测(爸爸)是一种常用的检测技术进行高效液相色谱分析。爸爸和女士的结合使用可以提供优秀的特异性提供正交的信息为每个峰值。碎片可以使用数据库,用于识别化合物和新颖的化合物可以使用数据反褶积软件识别砂光谱匹配。在我们目前的研究中,五个组件被确定与两种草药在BTF(图1 (b))。根据植物化学研究[27,28),Gui-Ban和Long-Gu氨基酸的主要组件没有共轭债券和矿物质,分别不通常含有生色团,不能检测到紫外分析。此外,监控波长270 nm可能没有捕获细辛醚和皂苷的吸光度Shi-Chang-Pu袁志,分别。因此,紫外检测可能不足以描述BTF [29日,30.]。此外,缺乏商业标准分析和特征也可能是一个限制因素。的大脑我们被UPLC-MS可用性的分子,这些化合物属于多酚(PPs)。PP代谢物可以间接调节脑血管系统或直接充当神经递质穿过血脑屏障,而肠道微生物群在代谢中起着至关重要的作用被细胞吸收的膳食多酚为脂溶性代谢物(31日,32]。在我们的实验中,我们管理BTF通过口服填喂法和相信代谢物的PPs从肠道微生物群或者生活代谢可以通过血脑屏障(BBB)和大脑中积累。

广告的病理特征是大脑中的淀粉样蛋白斑块的存在,导致的观察β淀粉样蛋白(β)级联假说的广告33,34]。注意力已经集中在亚型及其生理功能,特别是一个β_1-42。最近的研究表明,广告可能会引起的β骨料,采用替代构象,导致prion-like堂吉诃德》(35- - - - - -37]。Intracerebroventricular注入的β_1-42纤维已被证明诱导hyperphosphorylationτ,混乱的形成,最终导致神经元死亡和痴呆,也被报告为种子诱导内源性β聚合然后触发神经毒性(33,38]。这些发现导致模型利用内生的发展β和其他plaque-associated因素而不需要过度可能混淆的淀粉样前体蛋白(APP)域,这自然成为经典和流行AD动物模型。尽管如此,进一步的调查转基因模型的广告才会安排充分评估BTF的潜在好处,排除任何副作用造成的损伤在一个由于机械损伤β_1-42fibril-infused老鼠用于我们的研究。

脑源性神经营养因子对其生物功能的神经元通过两个跨膜受体:TrkB和我生成受体(p75NTR) [39]。TrkB高亲和性催化是一种神经营养因子受体数和高纯度在海马体40]。磷酸化后TrkB刺激BDNF触发激活下游的PI3K / Akt信号分子,驾驶synaptotagmin和PSD95合成在内质网(ER)和贩卖整个神经元突触,导致快速和dendrite-wide敏化突触(41,42]。有趣的是,BDNF基因转录是由分子的转录因子家族,和PSD95与TrkB脑源性神经营养因子受体(43,44]。这两个循环途径促进脑源性神经营养因子的高表达和PSD95,以及稳定的应对BDNF TrkB受体刺激效应。结果,这些通路的激活导致了一个积极的反馈回路突触对BDNF做出更多的反应,从而导致增加运输PSD95突触。我们指出,随后BTF显著刺激BDNF的表达和诱导TrkB-Akt /分子级联信号通路的激活,导致下游synaptotagmin合成的增加和PSD95突触。这些结果确定的潜在机制BTF-induced显著稳定的突触可塑性β_1-42fibril-infused老鼠。

5。结论

总之,我们的研究产生的色谱指纹Bushen-Tiansui公式(BTF)已经在我们的诊所部门利用多年,进一步证实了BTF通过突触损失的预防改善认知功能,演示了在经典的广告模式β_1-42fibril-infused老鼠。此外,机制调查表明BTF刺激BDNF的表达和激活触发TrkB / Akt和TrkB /分子通路,导致synaptotagmin和PSD95表达的upregulation突触。简而言之,这项研究提供了一个令人信服的科学依据扩展应用程序的BTF的诊所,和BTF的正在进行的随机临床试验,反过来,将确认我们的报告的可靠性,它提供了一种可靠的广告途径治疗。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的结果包括在本文中。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

S.L.构思的项目,设计了实验,分析数据,并写了手稿。C。设计和执行大部分的实验。P.X.和X。L进行色谱指纹图谱分析。W。J和D.X.辅助数据分析和批判性阅读手稿。

确认

作者欣然承认金融支持收到湖南省中医研究项目(202080年,S.L)和健康委员会湖南省(20200901,S.L.)。

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