超音Hedgehog信号通路通过促进突触和神经元健康在缺血性损伤中的神经保护作用

摘要

脑缺血是一种常见的脑血管疾病，常引起神经元凋亡，导致脑损伤。有报道称，音猬因子(Shh)信号通路参与了缺血性中风的发生，但其潜在机制尚未完全阐明。在本研究中，我们证实了神经元中Shh、Ptch和gli1的表达在氧糖剥夺(OGD)损伤后24小时显著下调在体外，这些影响与凋亡细胞数量的增加和活性氧的产生有关。此外，在OGD后8小时，突触蛋白(neuroligin和neurexin)的表达显著下调，也与伴随的神经元凋亡有关。使用Shh激动剂purmorphamine治疗，可增加神经元核中的gli1，并保护OGD损伤，而Shh抑制剂环巴胺则产生相反的效果。Shh信号的激活促进CREB和Akt磷酸化;上调BDNF、neuroligin、neurexin的表达;和减少NF -κ..OGD后的B磷酸化。值得注意的是，Shh信号的激活伴随着神经行为反应的改善，大鼠缺血后48小时水肿和细胞凋亡的减弱。综上所述，这些结果表明，Shh信号通路的激活通过促进突触和神经元的健康，在对缺血暴露的反应中发挥了神经保护作用。

1.介绍

缺血抚摸是人类持久残疾的主要原因之一[1］.细胞死亡迅速导致神经元饥饿的氧气和营养，以及随后的兴奋毒性，氧化应激，神经引发和凋亡产生脑的结构和功能完整性的丧失[2］.因此，迫切需要新的治疗策略，以恢复中枢神经系统的完整性，促进脑缺血患者的功能恢复。

超音hedgehog (Shh)信号通路在中枢神经系统发育过程中的神经发生和神经模式中发挥重要作用[3.］.当SHH与其受体结合时，浸没（PTCH）时，它迫使G蛋白偶联受体平滑（SMO），导致胶质瘤相关的癌基因同源物1（GLI-1）的激活。活化的Gli-1思考许多靶基因的表达，其调节细胞生长，存活率和细胞的分化，包括神经元[4.］.据报道，SHH信号通路涉及缺血性脑卒中[5.]因为在缺血/缺氧期间发现SHH表达在神经元中上调[6.］.此外，抑制SHH途径在大鼠中加剧了缺血性损伤，与GLI1和PTCH表达中的下调相关的效果[7.］.purmorphamine（pur），Shh团簇的小分子激动剂，Smo，中脑动脉闭塞（MCAO）模型的施加保护作用[8.］.PUR也被证明能促进血脑屏障的形成，在中枢神经系统内内源性抗炎系统的激活中起着关键作用[9.]而最近的发现表明，Pur保护皮质神经元并在大鼠缺血性卒中后恢复神经缺陷[10.］.我们已经报道了PUR施加神经保护针对成年大鼠蛛网膜下腔出血诱导的损伤[11.和新生儿小鼠缺氧缺血[12.］.

尽管对SHH的信息进行了相对实质性的调查，但关于SHH信号传导在缺血性卒中中的作用的细节尚未完全阐明。一试，在本报告中试图纠正这种赤字，我们专注于氧气 - 葡萄糖剥夺（OGD）损伤后SHH信号通路的表达水平和效果。以这种方式，可以检查缺血性损伤中SHH信号通路的一些底层神经保护机制。

2.材料和方法

2.1。试剂和抗体

用于Western Blot的抗体包括抗P-AKT（9271S，Cell Signaling Technology，USA），抗AKT（9272S，Cell Signaling Technology，USA），抗SHH（20697-1-AP，美国Proteintech Group，USA），防格里-1（AB151796，ABCAM，USA），防贴（AB53715，ABCAM，USA），反NF-κ..B（10745-1-AP，Proteintech Group，USA），抗P-NF-κ..B (3033S, Cell Signaling Technology, USA)， anti-p- creb (9198S, Cell Signaling Technology, USA)， anti- creb (9197S, Cell Signaling Technology, USA)， anti- bdnf (17465-1-AP, Proteintech Group, USA)， anti-neuroligin (ab186279, Abcam, USA)， anti-neurexin (ab222806, Abcam, USA)， and antiβ-Actin（TA-09，中山金桥生物技术，中国）。用于免疫荧光的抗体是抗GLI-1（AB151796，ABCAM，USA）。Pur和Cyclopamine（Cyc，Smoothed抑制剂）购自Selleck Chemicals（休斯顿，TX，USA）。螺纹栓塞是从广州市嘉陵生物科技有限公司（中国广州L3800）购买。Annexin V-FITC / PI双标签凋亡检测试剂盒购自Bestbio Science（中国上海）。末端脱氧核苷酸转移酶介导的DUTP-BIOTIN缺口末端标签（TUNEL）试剂盒购自Keygen Biotech（KGA7073，Beyotime，中国上海）。

２.２.细胞培养、治疗和氧葡萄糖剥夺(OGD)

2.2.1。主要神经元

小鼠原代皮层神经元按前述方法培养[13.］.简而言之，PND1小鼠用于收获皮质神经元，然后用2％B27和1％青霉素 - 链霉素在无血清神经缺卵培养基中培养。将细胞培养在聚-D-赖氨酸涂覆的12个孔板中7天，然后用pur处理（20 μ.M)有/没有Cycμ.m）。

模仿缺血性的条件在体外，对细胞进行OGD。简而言之，将细胞在37℃下培养95％氮和5％CO₂在无葡萄糖DMEM中进行6小时（125mM NaCl，2.8mm KCl，1.5mm MgCl₂，0.05 mm mgso_4.，2 mm cacl₂，0.83毫米₂宝_4.，24毫米Nahco_3.，和2毫米HEPES)。OGD后，将原代神经元置于带有PUR (20μ.M)有/没有Cycμ.M)，并在常氧条件下按所指示的时间返回培养箱。对照组细胞维持在没有OGD的正常条件下。采用TUNEL染色法检测细胞凋亡情况。

2.2.2。PC12细胞

PC12细胞在含5%胎牛血清和1%青霉素/链霉素的DMEM中培养。为了进行MSC-exosome处理，PC12细胞在12孔板中接种无fbs的培养基，并使用外泌体(100μ.G / ml）在指示的时间转染和未转染的MSCs。

模仿缺血性条件在体外， PC12细胞暴露于OGD 6 h。PC12细胞置于有或无PUR (20μ.m）和/没有cyc（10 μ.M)，并在常氧条件下按所指示的时间返回培养箱。

２.３.流式细胞仪测定细胞凋亡

使用附睾V-FITC / PI双标记凋亡检测试剂盒评估PC12细胞的凋亡，如前所述。通过使用FACS流动细胞仪C6（BD Biosciences，CA，USA）分析了超过10,000个获得的事件的膜蛋白V阳性细胞的百分比。所有测定均一式三份进行，每次实验重复三次。

2.4。Tunel染色

根据与DAPI提供的指令使用TUNEL染色测定细胞死亡。如上所述，在每组的病变区域内的六个随机选择的微观场测量TUNEL阳性细胞的数量。（如上所述）（ 小鼠/小组）。

2．5．她分析

为测定原代神经元中ROS的产生，用10μ.m dhe 30分钟。在冲洗和安装后，使用荧光显微镜（BX51; Olympus，日本）捕获图像。DHE-染色结果是通过使用图像Pro加上图像分析系统的像素化和量化。

2.6。Western Blot.

将组织与含有PMSF和蛋白酶/磷酸酶抑制剂的RIPa均质化，然后在4℃下以13,800×g离心10分钟。然后，向蛋白质上清液中加入5×加载缓冲液，并使用BCA测定套件CWBIO（江苏，中国海门）定量总蛋白质。通过SDS-PAGE分离等量的蛋白质，然后转移至PVDF膜。在2小时内封闭5％非牛奶后，使用以下初级抗体探测印迹：Shh，Gli-1，贴片，P-Creb，Creb，BDNF，P-Akt，Akt，NF-κ..B, p-NF -κ..乐队β-actin在4°C过夜。二抗37℃与膜共孵育60分钟。化学发光信号是用ECL试剂盒试剂(MILLIPORE，美国)开发的，然后用Tanon成像系统(Tanon-4600)检测。使用ImageJ(美国国立卫生研究院，Bethesda, MD, USA)对蛋白条带密度进行半定量。

2.7。实时荧光定量PCR (qRT-PCR)

采用TRIzol试剂CWBIO(中国江苏海门)，按照厂家说明书进行组织总RNA分离。ev和H总RNA₂使用ExoQuick-TC™(System Biosciences, USA)分离EV后，使用Sera Mir EV RNA提取试剂盒(System Biosciences, USA)提取s -EV。利用ReverTra Ace qPCR RT Kit (TOYOBO, Tokyo, Japan)的反转录系统合成互补DNA (cDNA)。采用SYBR green PCR master mix (TOYOBO, Tokyo, Japan)在Bio-Rad IQ5 real-time PCR System (Bio-Rad, USA)上进行实时定量PCR。BDNF特异性引物购自中国广州RiboBio有限公司:forward, 5 -Agc tga GCG TGT GTG aca gt-3 ;反向，5 -ACC CAT GGG ATC ACA CTT GG-3 。结果以U6/actin归一化方法。

2.8。免疫荧光染色

对于免疫荧光染色，将细胞与初生（Gli-1,1：100）温育在4℃下，并在第二天在37℃下在37℃下用二抗孵育30分钟。用DAPI染色核10分钟。用荧光显微镜（Olympus-BX51，Olympus Corporation，Japan）获得图像，并使用Image-Pro加上6.0软件（Media Cyber​​ Intics，MD，USA）进行这些图像的分析。

2.9。动物模型和治疗

动物实验是根据医疗科学理事会（CIOM）理事会提供的动物研究的国际指导原则进行，所有程序都由山东大学的动物道德和福利委员会批准。与动物模型合作的参与者根据机构动物护理和使用委员会指南（IACUC）内的程序培训。执行所有程序，以最小化这些方案中动物所经历的疼痛。

中间脑动脉闭塞（MCAO）程序用于产生缺血性损伤。成年男性Sprague-Dawley（SD）大鼠（280-320g）随机分为四组（ /组）：（1）假，（2）MCAO，（3）MCAO + PUR，和（4）MCAO + PUR + CYC。将大鼠用盐水，pur（5mg / kg）或Cyc（1mg / kg）处理，并在MCAO后每天一次接受一次腹膜内注射2天。在PUR之前在30分钟内用Cyc（1mg / kg）预处理Maco + pur + Cyc组。

MCAO是基于如上所述的改进的Longa方法[14.］.简单地说，对于MACO模型，用异氟醚麻醉大鼠。分别分离右侧颈总动脉(CCA)、颈外动脉(ECA)和颈内动脉(ICA)，并用微动脉夹夹闭。ECA近端使用5-0聚酯缝合，在离CCA分叉3.0 mm处切断。然后将ICA完全分离，使用显微外科剪刀在ECA近端动脉分叉处的动脉壁上切开一个小开口。将一个线栓与ICA平行插入ECA，然后取出ICA上的钳。在达到微阻力后，停止栓子的推进，然后用5-0聚酯缝合收紧ECA。假手术组的动物进行了类似的手术，但没有应用遮挡。

在损伤后2天使用2,3,5，-TTC）染色的使用2,3,5 - 噻吩基氯化铵（TTC）染色评估脑梗塞。在损伤后2天评估神经功能和脑含水量。

2.10。脑组织水分含量测定

脑组织被迅速取出，并在分析天平上称重，准确度为0.01 mg(湿重)。然后将半球置于105℃烘箱中烘干24 h，获得干重含量[15.］.脑含水量的公式是 。

2.11。神经兽医试验

使用修改的Longa方法以单盲的方式评估行为，并从0-4的等级评定[14.]：0，无神经学赤字;1，无法延长对侧前肢，未伸直肢体;2，对侧前肢屈曲和行走圈;3，略微向对侧侧面倾斜，朝向对侧行走;4，沿着对侧圈行走。选择具有1,2或3点的分数的动物进行实验。

2.12。TUNEL分析

如上所述确定大脑部分的TUNEL分析。然后，使用视图致盲的调查员对实验组分配蒙蔽的图像专业加上6.0软件进行大脑部分。选择含有梗塞病变（距-1.60和-2.00mm的区域的脑切片以进行Turnel染色。每个独立实验中使用的每个组的所有切片都有类似的解剖位置。阳性细胞在随机选择的PERI-IMARCT区域内进行计数，限制在300内 μ.M到梗死灶。

2.13。统计分析

结果表示为 。neuroigin /neurexin表达与TUNEL计数的相关性分析在体外用Pearson相关试验进行。除非另有说明，否则使用单向ANOVA分析其他数据，然后使用Tukey的测试或Dunnett使用Prism软件进行Hoc比较的测试。一种结果需要在统计学意义中所需的价值<0.05。

3.结果

3.1。OGD曝光会影响SHH信号通路

Western blot结果显示，与对照组相比，OGD暴露4h时Shh表达增加([ 那 ]，后HOC ）和8小时（后HOC ）1小时的表达减少（后HOC ）和24小时（后HOC ）（数字1（a））.此外，OGD曝光下调了GLI-1的表达（[ 那 ]，后HOC ）和Ptch ([ 那 ]，后HOC ）在24小时。免疫荧光染色发现PUR治疗促进gli1核易位([ 那 ]，后HOC ）（数字1（b））.通过Cyc预处理阻断OGD暴露后SHH途径对SHH途径的这些影响（图1）.

3.2。用OGD诱导的PUR衰减凋亡激活SHH信号

接下来，我们检查了使用TUNEL染色的PUR是否受到原发性神经元中的OGD诱导的细胞凋亡。OGD显着增加了凋亡/总细胞的百分比（ ％）与对照组相比（ ％）[ 那 ]，后HOC )，治疗时用20μ.M纯度显着降低了TUNEL阳性细胞的比例（ ％）与OGD组相比（后HOC ）.用Cyc阻断了PUR对动脉阳性细胞数量的这种效果（ %;事后 ）（数字2（a））.

FACS结果显示，OGD暴露增加PC12细胞/总凋亡( %)，而对照组( ％）[ 那 ]，后HOC ）.用20治疗 μ.M纯度显着降低了TUNEL阳性细胞的比例（ ）与OGD组相比(事后) ）.用Cyc阻断了PUR对动脉阳性细胞数量的这种效果（ %;事后 ）（数字2 (b)）.

3.3。SHH信号的激活减少了OGD诱导的ROS生成

与对照组相比，OGD显着增加了OGD后24小时确定的ROS水平（[ 那 ]，后HOC )，虽然Pure治疗显着减弱了这种OGD诱导的ROS水平增加（HOC ）.这种PUR对ROS生成的影响被Cyc (post - hoc)阻断 ）（数字3.）.

3.4。用PUR衰减ogd诱导的神经罗素和Neurexin的SHH信号的激活

由于突触蛋白(neuroligin和neurexin)在刺激突触形成和重建中起着至关重要的作用[16.[我们接下来检查了OGD对神经源素和新生素表达的影响。Western印迹测定结果表明，暴露于OGD的神经元显示出8小时的神经源素表达显着降低（[ 那 ]，后HOC ）在24小时（后HOC ）后OGD。Neurexin表达在8小时内也降低（[ 那 ]，后HOC ）在24小时（后HOC ）OGD曝光后(图4(一)）.PUR治疗上调了ogd诱导的神经素减少([ 那 ]，后HOC ）和neurexin（[ 那 ]，后HOC ）OGD后8小时（图4 (b)）.PUR对神经蛋白和神经蛋白表达的影响被Cyc (neuroigin, post - hoc)阻断 ;neurexin,事后 ）.

此外，发现神经源素和新生素的增加表达与Pur治疗后的凋亡水平负相关（神经罗素，Pearson 那 ;Neurexin，Pearson 那 ）（数字4 (c)）.

3.5。SHH信号的激活增加了OGD后的CREB和BDNF表达式

与对照组相比，OGD在4 h显著降低p-CREB表达([ 那 ]，后HOC ）和24小时的BDNF表达（[ 那 ]，后HOC ）遵循OGD曝光。但是，响应于Pure治疗，P-Creb都（后Hoc ）和BDNF (post - hoc ）表达显着增加（图5（a））.这些PUR对p-CREB和BDNF的影响被Cyc (p-CREB, post - hoc)阻断 ;BDNF，后HOC ）.

OGD暴露4 h后BDNF mRNA也显著降低([ 那 ]，后HOC )，虽然用pur增加这种bdnf mRNA表达（后HOC ）（数字5（b））.

3.6。PUR激活Shh信号可促进p-Akt，降低p-NF-κ..B.

与对照组相比，OGD暴露组显示出显着降低的p-akt表达（[ 那 ]，后HOC ）显着增加了p-nf-的表达κ..b（[ 那 ]，后HOC ）在4小时后OGD。pur治疗增加了p-akt（后HOC ）和p-nf-κ..B(事后 ）表达式(图6.）.这些对p-akt和p-nf-的效果κ..B被Cyc (p-Akt, post - hoc)阻断 ;p-NF -κ..B，后HOC ）（数字6.）.

3.7。Pur治疗减轻了缺血性损伤后神经系统缺陷，水肿和细胞凋亡

MCAO组48 h神经功能缺损评分明显低于假手术组([ 那 ]，后HOC )，而PUR在MCAO组治疗后24小时和48小时改善了这些缺陷(事后) ）（数字7（a））.缺血性损伤显著增加了同侧大脑的含水量([ 那 ]，后HOC )，与在宏组中观察到的相比，PUR治疗明显降低了这种缺血诱导的脑水肿（后HOC ）（数字7（b））.

此外，这种缺血性侮辱显着增加了同侧内凋亡细胞的数量（[ 那 ]，后HOC )，响应于pur治疗的效果显着降低（后HOC ）（数字7.（C））。PUR对神经缺陷分数，水肿和凋亡的这些影响全部被CYC阻塞（后HOC 那对于每个）（图7.）.

4。讨论

在本研究中，我们证明SHH信号的激活有利于大鼠MCAO后神经恢复。此外，我们表明，SHH信号响应缺血暴露的这些有益效果与增强的神经元活力，增加神经源性素和Neurexin表达以及活化的akt，降低κ..B信令。

总体而言，SHH信号传导的改变已被证明与CNS的不同区域内创伤后的许多再生响应和Postinjury病理物质有关[17.］.例如，Shh通路在对脑损伤的反应中在72小时被最大限度地激活，然后在14天恢复到基线水平[18.皮质刺伤后1至5天，皮质SHH蛋白水平增加[19.］.有一份报告显示，大鼠MACO损伤后6小时，皮质神经元中Shh、gli1和Ptch1蛋白表达均上调[10.]，而其他研究报道Gli1和Ptch1在缺血损伤后6、12、24和48 h表达上调[20.］.然而，在实验性蛛网膜下腔出血后的早期阶段也报道了在皮质内的SHH表达的下调[11.那21.和新生儿小鼠缺氧缺血[12.］.在本研究中，我们发现在OGD损伤的早期阶段的SHH和GLI-1的神经元表达，而SHH，GLI-1和PTCH的表达在OGD之后的稍后时间点降低。已经显示SHH信号通路的激活来增加Bcl-2，同时抑制Bax表达[22.］.此外，外源性Shh治疗降低了梗死体积，促进了MACO损伤后血管生成和神经元存活[23.］.我们目前的结果表明，在缺血暴露后恢复SHH信号通路的表达对PUR对神经毒性的保护作用。这种神经保护作用涉及PUR诱导的SHH信号传导途径的激活，从通过Cyc处理获得的结果证实，这扭转了PUR在缺血暴露上的这些有益效果。因此，我们得出结论，SHH信号传导的上调用于抵抗早期阶段的缺血性损伤，从而施加其在脑缺血性卒中中的有益治疗效果，而在损伤引起的加重导致后的阶段则在后期下降。

前一项研究的结果表明，PUR表现出对啮齿动物模型中的卒中损伤的有益效果，PUR不会改变卒中诱导的SHH信号水平[10.］.Pur在早期在早期靶向神经元在早期发挥抗炎作用，通过靶向星形胶质细胞，在晚期炎症中起着抗炎作用[10.］.此外，我们发现PUR可以逆转OGD暴露后神经元中Shh信号的表达在体外。这种差异的一个解释可能来自CNS在缺血性损伤之后CNS中的不同细胞靶标。

中枢神经系统在损伤后表现出很大程度的可塑性，通过神经发生、血管生成、轴突发芽、突触形成和重塑等过程使其从功能缺陷中恢复过来。海马神经元树突中Shh受体的激活已被证明能加速缺血性中风后轴突延伸和突触可塑性[24.］.SHH途径可以通过纤溶酶原激活剂介导脑塑性和功能性回收，部分解释用骨髓基质细胞治疗中风后观察到的功能恢复[25.］.此外，外源性SHH治疗增加了BDNF水平，并在海绵窦神经损伤后促进神经再生[26.］.符合这些发现，我们的目前的结果表明，响应于OGD暴露，伴有突触蛋白，神经胶素和新生素中的上调相关的效果，SHH信号传导和BDNF表达的激活。突触前Neurexin和突触后神经源素是突触细胞 - 粘附分子，其在突触处连接神经元并调节突触传输[27.］.据报道，缺血损伤增加了Neurexin-neuroligin1-PSD-95相互作用，其可以代表治疗剂指导脑缺血的治疗剂的重要靶标[28.］.在本研究中，用pure恢复SHH信号传导的表达上调神经源素和Neurexin的表达，以及促进细胞存活和CREB ​​/ BDNF途径的调节。这些数据表明，SHH信号能够通过对神经营养反应和突触可塑性的影响减轻缺血性损伤。

Akt磷酸化与多种细胞功能密切相关，如细胞存活、凋亡和代谢。gli1的hedgehog信号通路组分可以激活PI3K-Akt通路[29.］.符合此发现，我们证明了在神经元中OGD暴露之后的Pur活化的AKT。nf-κ..B通过Shh信号通路诱导星形胶质细胞中炎症因子的表达[30.］.骨髓微环境中的SHH配体涉及促进NF-κ..多骨瘤细胞中的B活性[31.］.我们发现PUR减少OGD诱导的磷酸化NF-κ..b，与抗浸润效应相关。我们推测了AKT和NF-κ..B途径负责Pur的神经保护活动，需要进一步研究。

总的来说，我们的数据表明，Shh信号通路通过促进突触和神经元的健康，对缺血性损伤起着重要的神经保护作用。

缩写

CNS：	中枢神经系统
CCA：	右常见的颈动脉
赛:	Cyclopamine.
ECA:	外部颈动脉
GLI-1：	胶质瘤相关癌基因同源物1
ICA：	内部颈动脉
MCAO：	中脑动脉闭塞
OGD：	Oxygen-glucose剥夺
PUR：	Purmorphamine
Ptch:	修补了
QRT-PCR：	逆转录酶实时荧光定量PCR
Smo:	平滑
嘘：	Sonic Hedgehog.
TUNEL:	末端脱氧核苷酸转移酶介导的DUTP-BIOTIN切口末端标记。

数据可用性

再现这些发现所需的原始/处理数据目前不能共享，因为这些数据也是正在进行的研究的一部分。

利益冲突

提交人声明他们没有利益冲突。

作者的贡献

ZW为稿件的最终版本的研究设计，数据解释，写作和修改有贡献;XGL有助于稿件的初始和最终修订;SY和XMB促成了实验室工作和编辑手稿;DQX和TTL进行流式细胞术分析;MH和HFK实现了宏模型;和SY，XLC和WQC修订了稿件。Sen Yin和Xuemei Bai贡献了这项工作。

致谢

这项工作的研究资金支持来自中国国家自然科学基金（第81873768和81671213至Zhen Wang博士）。中国慢性非传染病疾病国家重点项目（2016YFC1300403至文强议员，中国国家自然科学基金（Wenqiang Chen博士的第81770436号）。

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