在认知功能脂联素转染的内皮祖细胞的保护作用d半乳糖致衰老大鼠

抽象

衰老是一个多因素过程，涉及炎症、氧化应激和线粒体动力学的累积效应，可对神经系统产生复杂的结构和生化改变，导致脑内微循环障碍、血脑屏障（BBB）和其他问题。长期注射D-半乳糖（D-gal）可引起慢性炎症和氧化应激，加速衰老。长期服用D-gal的加速衰老模型，由于慢性炎症的增加和对动物自然衰老相似性认识的下降，在抗衰老研究中得到了广泛的应用。然而，尽管在D-半乳糖致衰老大鼠中进行了广泛的研究，但对其微血管的研究仍然有限。内皮祖细胞（Endothelial progenitor cells，EPCs）是内皮细胞（Endothelial cells，ECs）的前体细胞，在内源性血管的修复和再生过程中发挥重要作用，脂联素（adiponectin，APN）是一种来源于脂肪细胞的蛋白质，具有多种保护血管内皮和抗炎作用。近年来，许多研究表明APN能促进认知功能的改善。在这种情况下，我们研究了APN转染EPC（APN-EPC）对D-gal给药后大鼠的神经保护作用，并探讨了可能的机制。与D-gal给药模型组相比，APN-EPC治疗组大鼠认知功能明显改善，微血管密度明显增加，提示APN-EPC治疗能改善老年大鼠认知功能障碍和微血管密度。促炎细胞因子IL-1的水平β， IL-6和TNF-α，活化的星形胶质细胞和凋亡率，与模型组，表明APN-内皮祖细胞缓解了神经炎症在衰老大鼠相比，APN-EPC组显著降低。此外，APN-EPC组抑制BBB-相关蛋白质的紧密连接蛋白5的下降，闭合蛋白，和ZO-1在衰老大鼠和显著衰减BBB功能障碍。我们的研究结果表明，在d-GAL诱导衰老大鼠APN-EPC治疗对改善认知和BBB功能障碍，增加血管生成，减少神经炎症和细胞凋亡率有积极的作用。该研究表明，通过基因修饰细胞治疗可以提供与年龄有关的神经退化疾病，治疗的安全和有效的方法。

1.简介

随着老龄化国家的增多和人口老龄化比例的提高，人们对老龄化的关注越来越大。衰老是一个正常的生理过程，是认知能力下降的主要原因，主要表现在学习、记忆、情感和感知功能上。其机制可能与慢性炎症、氧化应激、线粒体功能障碍等因素有关[1，2]。老化伴随有结构的变化的微循环的功能，导致血管内皮功能障碍和降低微血管[2-4]，因而，导致年龄相关的神经变性疾病，如血管认知功能障碍和阿尔茨海默氏病（AD）。

d半乳糖（d-GAL）是一种还原糖于许多食物如蜂蜜，酸奶，牛奶，和猕猴桃找到。过度长期d-gal的摄入可导致的高级糖基化终产物（AGEs）和反应性氧物质的过量产生（ROS）[五]，这可能有助于慢性炎症和氧化应激[6]. 许多研究表明，慢性炎症和氧化应激会导致线粒体、神经功能损害，甚至认知能力下降[7-12]。与d-GAL的长期注射加速老化的模型已被广泛用于抗衰老的研究，由于慢性炎症的增加，认知的下降，以及与动物自然老化[类似的生化指标五-13]。然而，对d -gal诱导衰老大鼠微血管系统的研究还很有限。

神经血管单元（NVU）中，由神经元，星形胶质细胞，小胶质细胞，血管内皮细胞，血管周细胞，基底膜和细胞外基质构成，在维持脑的结构和功能非常重要的作用[14，15]. 毛细血管内皮细胞之间的紧密连接（TJ）在星形胶质细胞末端脚和周细胞的协助下，灌注脑实质，有助于维持血脑屏障（BBB）的稳定性[15，16]. 因为活性氧的产生被认为是老化过程中的一个关键因素[17]，它可诱导神经血管炎症。下慢性炎症的刺激，NVU的结构会受伤，这可能导致在星形胶质细胞的活化，内皮细胞功能障碍，和细胞凋亡，这最终导致微血管密度，BBB的渗透性的增加的减少，和神经系统功能受损[16，18-20]。

EPCs是来源于骨髓的内皮细胞的前体细胞，在内源性血管修复和再生过程中发挥重要作用[21]。内皮祖细胞可以产生多种细胞因子的通过旁分泌促进慢性炎症，局部缺血和缺氧[条件下在血管损伤和内皮祖流通的部位修复损伤血管的内皮细胞增殖和分化（ECS）22-26]。近年来，EPC移植已在缺血性脑血管疾病的治疗中发挥了积极的作用[25-27]。在我们的实验室先前的研究还发现，中动脉闭塞（MCAO）治疗大鼠骨髓来源的内皮祖细胞能起到促进血管生成，改善行为功能，减少梗死面积有良好的作用和细胞凋亡率[27]。然而，内皮祖细胞的数目会随着年龄减少[28]，和内皮祖细胞的提取是困难的，以及。当单独移植，短短内皮祖细胞活了下来，这削弱过程[29]。

脂联素（APN），脂肪细胞通过合成的蛋白质，在葡萄糖和脂质代谢的调节具有重要作用。APN也已经提出了有这样的血管内皮保护，抗炎，antiatherosclerosis，和血管舒张特性的基本功能，其可影响中枢神经系统病症。APN的含量与内皮祖细胞的水平相关[三十，31]，而APN也可参与调节EPCs的功能和促进EPCs的作用[32-36]。近年来，越来越多的研究表明，APN可以促进认知功能改善[37，38]。

因此，我们通过基因工程技术使内皮祖细胞过表达APN转基因APN内皮祖细胞成慢病毒，然后将APN-内皮祖细胞都应该发挥内皮修复和抗发炎了较好的作用，使在D-认知功能产生积极的影响半乳糖诱导的衰老大鼠。

2。材料和方法

2.1。内皮祖细胞的制备

湖北省疾病控制中心提供的4周龄雄性SD大鼠，用3%戊巴比妥钠30 mg/kg麻醉后处死，无菌分离大鼠胫骨和股骨，用PBS缓冲液反复冲洗骨髓腔，收集新鲜骨髓。用Ficoll-Paque溶液密度梯度离心分离单个核细胞( ，Sigma，美国）。然后，将它们与内皮细胞的一个T25培养瓶中分别接种基础培养基-2（EBM-2，龙沙，瑞士），并放置在具有5％CO细胞培养箱中₂气氛中在37℃。观察到每天改变每72小时的培养基，使细胞的生长状态。在我们以前的实验[27]我们利用EPCs摄取乙酰化LDL（ac-LDL）和europaeus凝集素-1（UEA-1）的特性对这些细胞进行了鉴定，并将其鉴定为EPCs。

2.2条。基因转染

在培养9天后收集epc，并以100倍的转染倍数将编码人类APN基因的慢病毒载体（LV-APN/EGFP，上海基因化学公司，中国）转染。该基因的载体为无限制扩增的松弛穿梭质粒，其载体元件序列为Ubi-MCS-3FLAG-SV40-EGFP-IRES-puromycin。12h后，用PBS缓冲液洗涤细胞，用新鲜培养基培养。转染后72小时，将细胞置于倒置荧光显微镜下观察增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的表达并评价转染效果，转染率按以下公式计算： 。通过Western印迹分析检测的APN从APN-内皮祖细胞和内皮祖细胞中的表达[27]。

2.3。动物药品监督管理局

48male SD rats, weighing 200-220 g, provided by Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Company were used in our experiments. The animal study proposal was approved by the Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) of Wuhan University (Hubei, China) with the permit number IACUC 2019060. All the operations and handling of experimental animals are complied with the requirements of animal ethics strictly.

将大鼠随机分为四组：（1）对照组（ ),（2）模型组（ ),(3) EPC处理组( ),和（4）APN-EPC治疗组（ )。Rats in the model group and the treatment group were given intraperitoneal injection with 100 mg/kg D-gal daily for 6 weeks, while the control group was given intraperitoneal injection of normal saline at the same dose every day for 6 weeks.

2.4。细胞移植

将培养14天的EPCs和培养5天的APN-EPCs分别用PBS缓冲液重悬和收集。腹腔注射6周后，取0.5 ml消失模及含apn -消失模悬浮液 cells were injected into the EPC treatment group and APN-EPC treatment group, respectively, through the tail vein, while 0.5 ml PBS buffer was injected into the control group and model group.

2.5。莫里斯水迷宫实验

All the rats were given spatial memory assessment by using Morris water maze (MWM), which mainly includes a 1.5 m diameter pool filled with opaque water and a 10 cm round platform that placed 1 cm below the surface of the water at the center of one quadrant. The whole experiment lasted for 6 days. The first 5 days were the place navigation test, which was used to test the spatial learning and memory functions of rats. During the first 5 days, each rat was gently released into the water at four different locations on opposite sides of the platform for four swimming trials per day. Rats that failed to find the platform within 60 s were manually guided to the platform and allowed to stay for 15 s. The probe trial proceeded on the 6th day, which was tested for spatial memory. On the 6th day, the platform was removed, the contralateral side of the platform was selected as the entry point, and the rats were free to swim in the tank for 60 s. The swimming trace, latency to the platform, the time spent in each quadrant, and the platform crossing times were recorded by a computerized video imaging analysis system (AVTAS Animal Video Tracking Analysis System, Wuhan YiHong Sci. & Tech. Co., Ltd).

2.6。组织准备

行为测试后，大鼠用3％的戊巴比妥钠。只大鼠随机从每个组中选择的，并用4％多聚甲醛溶液经心脏灌注。将脑在4％多聚甲醛后固定过夜和充分脱水后石蜡包埋。然后大脑在4切 μm thick coronal sections from the anterior fontanelle -3.84 mm to -5.04 mm, and the sections were dewaxed before use. Brains of the remaining rats were taken after decollation, then, the bilateral hippocampal tissues of these brains were isolated on the ice rapidly and transferred to a refrigerator at -80°C for storage immediately.

2.7。西方墨点法

The rat hippocampal tissues were homogenized in lysis buffer with phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) and phosphatase inhibitor single-use cocktail (Beyotime, Shanghai, China), followed by 30 min on ice. The lysates were centrifuged at 12,000 rpm for 5 min at 4°C, and the supernatant solutions were collected. The total protein concentration of each sample was determined using a BCA protein assay kit (Beyotime, Shanghai, China). Then, the lysates were separated by the sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and transferred to nitrocellulose membranes. The membranes were incubated in 5% nonfat milk in PBS with 0.1% Tween-20 at room temperature (RT) for 1 h. Probing with primary antibodies to claudin-5 (Biorbyt, Wuhan, China), IL-6, IL-1β（的BIOS，北京，中国），3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH），闭合蛋白，ZO-1，TNF-α和α（Abcam公司，英国），然后温育与辣根过氧化物酶缀合的山羊抗兔IgG和检测使用化学发光底物。用于分析的AlphaEaseFC软件，并在每个实验组检测出的目标蛋白的光密度值标准化为GAPDH对照组的光密度值。

2.8。免疫组化分析

The brain sections were treated with 0.1% Triton X-100 for 10 min, then, washed with 0.1 M PBS. Endogenous peroxidase activity in the brain sections were blocked with 3% hydrogen peroxide, then blocking the nonspecific binding sites with 3% normal goat serum at RT for 30 min. After blocking, the sections were incubated overnight in rabbit anti-caspase-3 and anti-glial fibrillary acidic protein (GFAP) antibodies (Proteintech, Wuhan, China), then incubation with horseradish peroxidase-conjugated goat anti-rabbit IgG. The sections were washed with PBS and incubated in 3,3 0-Diaminobenzidine tetra hydrochloride (DAB), rinsing the sections with running water to stop color development, and brown or tan staining on the cell membrane or in the cytoplasm represented positive staining. The density of positive staining was the expression levels of caspase-3 and GFAP proteins, and the results were measured by the ImageJ software.

2.9条。免疫荧光分析

The brain sections were washed three times with 0.1 M PBS for 3 min after treating with 0.1% Triton X-100 for 10 min. Blocking the nonspecific binding sites with 3% normal goat serum at RT for 30 min, then the sections were incubated with the primary antibody (CD31, 1 : 100, Abcam) overnight at 4°C washing with PBS buffer, the sections were incubated with fluorescein isothiocyanate- (FITC-) labeled goat anti-rabbit IgG secondary antibodies (1 : 100, Boster, China) for 1 h. The ImageJ software was used to analyze immunohistological quantitative.

2.10。TUNEL染色

The brain sections were washed three times for 10 min in proteinase K solution (20 μ克/毫升），将其用PBS缓冲液稀释。Apoptotic cells in the sections were detected by a transferase-mediated dUTP-biotin nick end labeling (TUNEL) apoptosis detection kit (Yeasen, Shanghai, China), then incubating with DAPI in a dark environment for 5 min. The number of apoptotic cells was observed and counted under the fluorescence microscope, and the apoptosis rate was calculated according to the following formula: 。

2.11条。统计分析

用于统计分析的GraphPad Prism 8.0软件。数据被表示为 （SEM）。方差双向分析（ANOVA）来分析在MWM训练任务逃避潜伏期，而其他数据是由单因素方差分析。与价值 被认为是统计上显著。

3.结果

3.1。EPC形态和转染结果

我们用显微镜观察到新提取的单核细胞小而圆，悬浮在培养基中。培养14天后，细胞呈卵石状排列(图1)1)。转染72 h后，将细胞置于荧光显微镜下(×100)，观察到大量带有绿色荧光的EPCs，表明转染成功(图1)2). 用ImageJ软件进行细胞计数和分析，转染率为 。

3.2。APN-EPCs可以防止d - gal诱导的认知障碍

该研究的结果表明，APN-内皮祖细胞显著改善d-gal的诱导衰老大鼠的记忆缺陷（图3)。在定位航行试验，模型组的逃逸潜伏期显著增加，与对照组相比（ ),治疗组比模型组的显著缩短（ ),四组间有显著性差异( ， )。与EPC治疗组相比，APN-EPC治疗组的逃逸潜伏期明显缩短，在第4天和第5天差异有统计学意义( ，数字3（甲）). 在探针试验中，模型组大鼠在平台象限的时间明显短于对照组( ),epn -EPC处理组大鼠平台象限持续时间明显长于EPC处理组和模型组( ，数字3（b）). 与D-gal治疗组相比，APN-EPC和EPC治疗组的平台交叉时间增加（图3（c）， )。这些结果表明，APN-EPC治疗防止d-gal的诱导的认知功能障碍。

3.3。该APN-内皮祖细胞性弱化d-Gal的诱导神经炎症

西方印迹结果表明IL-1是显著增加蛋白质水平β， IL-6和TNF-α与对照组相比( ，数字4)。在免疫组化分析中，活化星形胶质细胞的特异性标志物GFAP在模型组中的表达较对照组显著增加( ，数字五)。的APN-EPC组防止炎性细胞因子和GFAP模型组的增加，其效果比EPC组更好（ )。这些结果表明，APN-EPC治疗防止d-gal的诱导的神经炎症。

3.4条。APN-EPCs减轻D-Gal诱导的BBB功能障碍

紧密连接蛋白5，闭合蛋白，和ZO-1是与在BBB紧密连接（TJ）蛋白质;他们一起玩在BBB的大小选择性放松的重要作用。我们观察到的蛋白质印迹结果的claudin-5的表达，闭合蛋白，和ZO-1在衰老大鼠海马显著时与对照组相比下降（ )。的APN-EPC组增加了模型组中的蛋白的表达，并且效果比EPC组更好（ ，数字6)。

3.5条。APN-EPCs可提高微血管密度

我们通过免疫荧光显微镜观察到，在与APN-内皮祖细胞处理的衰老大鼠海马微血管密度明显高于EPC治疗组和模型组（ ，数字7)。

3.6条。APN-EPCs抑制D-Gal诱导的细胞凋亡

在TUNEL结果染色显示模型组凋亡率与对照组相比显著增加（ ),而该APN-EPC治疗组时与EPC治疗组和模型组（比较降低 ，数字8)。

四。讨论

在这项研究中，我们诱导亚急性衰老d-GAL，导致认知功能障碍的过度和长期腹腔注射大鼠脑微血管密度降低，增加细胞凋亡率和促炎细胞因子的释放，星形胶质细胞的活化，降低BBB-相关蛋白。APN-内皮祖细胞通过尾静脉注射后，我们观察到，认知功能改善，脑微血管的密度增加时，BBB的功能得到改善，细胞凋亡率和促炎细胞因子的水平在下降衰老大鼠，效果比内皮祖细胞的更好。

在d-GAL-致衰老大鼠模型中，d-GAL的过度和长期注射可导致终产物和ROS的生产过剩，这可能导致强的氧化应激和慢性炎症加速大鼠老化[9-13]。慢性，无菌性和低度炎症被认为是老化过程的标志[2]。因此，我们集中在衰老大鼠炎症细胞因子。白细胞介素-1（IL-1）家族的细胞因子是炎性反应的关键介体，和肿瘤坏死因子-α（TNF-αα）是通常由大脑中的小胶质细胞和星形胶质细胞[产生的促炎性细胞因子6]。在我们的研究中，我们发现促炎细胞因子IL-1的增加β， IL-6和TNF-α以及d -gal诱导衰老大鼠星形胶质细胞的激活。研究结果与之前的研究结果基本一致[6，8，9]。

此外，ROS诱导的神经炎症反应可导致NUV的结构损伤，如星形胶质细胞的活化、内皮细胞功能的损伤、细胞凋亡等，从而导致BBB功能障碍[39，40]。内皮TJ密度蛋白质，例如紧密连接蛋白5，具有完整的膜蛋白和胞质蛋白，如occludin和ZO-1一起，参与维持BBB的渗透性。基质金属蛋白酶（MMP）的过量产生由于氧化应激和由年龄相关的血管变化引起的慢性炎症，它可以促进TJ蛋白的降解和基底膜[15]，因而，导致BBB通透性增加。BBB受损功能已与神经退行性疾病和认知能力下降有关[18，19]。我们的研究刚刚指出的认知功能障碍和BBB相关蛋白闭合蛋白-5，闭合蛋白，和ZO-1的亚急性衰老模型增加。

EPCs来源于骨髓，在内源性血管修复和再生过程中发挥重要作用。然而，EPCs的数量随着年龄的增长而减少[28]，和困难仍然存在，得到的EPCs。如已知的，APN是一种脂肪细胞因子的，具有保护血管内皮，抗发炎的功能，和antiatherosclerosis [41，42]。它也可以是参与调节功能，促进内皮祖细胞的作用。在拉沃伊等人的研究。[33， APN可以通过减少EPCs的凋亡，增强EPCs的功能，调节EPCs修复血管的能力。Wang等人[34和Dong等人[35]发现APN可以增强通过的mTOR-STAT3，AMPK / eNOS的，和其他信号转导途径的EPCs的功能。在这项研究中，我们转APN基因导入内皮祖细胞通过基因工程技术，发现APN-内皮祖细胞对减少促炎标记，改善认知功能，微血管密度和老年大鼠的结构性破坏作用，其效果是显著优于内皮祖细胞移植单独。

我们的研究表明，APN-内皮祖细胞的治疗抑制促炎基因表达和在衰老大鼠防止神经炎症，它可以涉及APN的抗炎作用。下APN的抗炎和血管内皮保护作用，BBB相关蛋白的含量逐渐恢复和内皮细胞的损伤减少。APN-内皮祖细胞在衰老大鼠也增加微血管密度，这可能是由于内源性血管修复和内皮祖细胞的再生。微血管密度和BBB相关蛋白的增长复苏，BBB完整性恢复，最终导致认知功能的改善。可能的机制是，慢性炎症和氧化应激的环境下衰老大鼠APN-内皮祖细胞作用于血管内皮受损地区通过各种旁分泌细胞因子参与血管修复和再生。此外，它在改善脑微循环，BBB功能，和神经结构损伤抗炎和抗细胞凋亡的作用。

5个。结论

我们的数据表明，APN-EPC治疗对神经结构损伤和认知功能障碍有积极的影响通过修复受损的血管和神经炎症减少。结果表明，基因修饰细胞治疗可以提供用于年龄相关的神经变性疾病的治疗安全且有效的方法。

数据可用性

用于支持该研究结果的数据包括在项目之内。

利益冲突

作者声称不存在利益冲突。

致谢

这项工作是由中国国家自然科学基金（编号81371273）的支持。

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