文摘

创伤性脑损伤(TBI)发生在打击头部会导致脑损伤。除了身体上的创伤,它会导致广泛的认知、行为和情感上的赤字,包括学习和记忆障碍。在神经层面上,创伤性脑损伤可能导致电路改造和兴奋和抑制性神经传递不平衡的影响。这种变化在大脑内稳态可能经常导致脑部疾病。神经连接的基本单位是微小的突起的树突棘形成网络中两个细胞之间的突触。刺是动态结构进行形态变换的一生中。其形状的开/关状态严格相关突触和突触传递的力量。矩阵metalloproteinase-9 (MMP-9)是一种extrasynaptically操作酶在脊柱重建过程中发挥作用,据报道被激活在创伤性脑损伤。本研究的目的是评估的影响MMP-9树突棘密度和形态控制皮质影响(CCI)创伤性脑损伤的动物模型。我们检查了脊柱密度和树突棘形成在大脑皮层和海马。 CCI caused a marked decrease in spine density as well as spine shrinkage in the cerebral cortex ipsilateral to the injury, when compared to sham animals and contralateral side both 1 day and 1 week after the insult. Decreased spine density was also observed in the dentate gyrus of the hippocampus; however, in contrast to the cerebral cortex, spines in the DG became more filopodia-like. In mice lacking MMP-9, no effects of TBI on spine density and morphology were observed.

1。介绍

创伤性脑损伤引起的外部机械力唤起各种大脑反应,包括焦extrasynaptic矩阵退化,在海马区神经元丢失,神经胶质激活,突触重塑和离子通道活动的变化(1,2]。谷氨酸神经传递水平,大量流出,增加了细胞外谷氨酸水平,hyperactivation NMDAR受体通道之后,他们的损失也观察到(3]。这些事件也严格与树突棘改造(4]。树突棘是小膜突起进行塑料形态两种生理变化(例如,开发或学习和记忆)和病理(如神经退化、精神疾病)条件(5- - - - - -7]。最近的一些报告所描述的树突棘密度和大小的变化在脑外伤(8- - - - - -16]。

MMP-9 pericellularly作用肽链内切酶,列为白明胶酶由于其分裂能力凝胶(17- - - - - -21]。通过参与细胞外基质重塑,调节许多细胞过程和生理功能(22- - - - - -26]。除了生理作用,MMP-9参加等中枢神经系统病理事件损伤、中风、或epileptogenesis以及神经精神疾病如精神分裂症或成瘾(27- - - - - -35]。重要的是,之前的报告还表明,MMP-9是至关重要的树突棘调制器(36- - - - - -41]及其水平改变posttrauma [28,40,42- - - - - -45]。在多大程度上对脑损伤MMP-9参与改变树突棘数量和形状是未知的。弥合这一差距,我们着手分析TBI-stimulated塑料MMP-9水平变动的影响树突棘的老鼠的大脑。为此,我们使用控制皮质影响(CCI)作为创伤性脑损伤的动物模型(46]。首先,我们描述CCI对密度和形态的影响大脑皮层和海马树突棘的24小时和7天的postbrain受伤。接下来,我们评估失踪MMP-9由于基因敲除的影响(KO)脊柱创伤性脑损伤后密度和形状。

2。材料和方法

2.1。动物

研究成人(12 - 14周)C57BL / 6 j雄性老鼠(动物屋,实验医学中心Białystok,波兰),MMP-9纯合子基因敲除小鼠(MMP-9 KO),兄弟姐妹和他们的WT (MMP-9 WT)对C57BL / 6 j背景(47]。所有的老鼠都保持在动物Nencki研究所。动物被安置在单独的笼子里控制环境(温度 ,湿度50 - 60%,免费获取食物和水和12 h光/暗周期)。所有程序都执行依照《动物保护法》在波兰,2010/63 /欧盟指令,经1日当地伦理委员会(权限号码:383/2012;609/2014)。

2.2。感应CCI的创伤性脑损伤

老鼠受到单方面皮层挫伤使用皮质影响控制协议(28,46,48与4%异氟烷麻醉后诱发(Aerrane;巴克斯特,英国)在100%的氧气交付率4 l / min。在手术期间,异氟烷的浓度维持在3%的水平在100%的氧气交付0.6 l / min(结合兽医麻醉系统;Rothacher;瑞士)。为更深层次的镇静,一度在受伤之前,老鼠皮下注射布托啡诺(10μ体重30 g / g)。头皮颅骨曝光后中线切口,颅骨切除术进行使用5毫米∅环钻(好科学工具置;德国)在λ之间的左parietotemporal皮层和前囱(图1(一))。骨块小心地删除而不扰乱硬脑膜。创伤性脑损伤的执行,我们使用徕卡影响设备配备一个电动金属活塞由线速度控制位移传感器(KAWA.SKA徕卡生物系统;波兰)。颅骨切除术后,可调CCI设备安装在左边立体定位臂20°角垂直。CCI是根据协议(28)使用以下参数:∅3毫米:平尖;从硬脑膜深度:0.5毫米;速度:5 m / s,居住时间:100 ms。受伤后,出血是严格控制的,一块无菌塑料被颅骨切除术区域,和切口与尼龙缝线缝合(Sigmed;波兰)。接下来,动物们回到加热笼的手术后的恢复。Sham-injured动物接受相同的麻醉和颅骨切除术手术,但没有受到CCI。以下的动物数量受到过程每个时间点:C57BL / 6 j ( CCI, 虚假的),MMP-9 WT ( CCI, 虚假的),MMP-9 KO ( CCI, 虚假的)。

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图1
减少脊椎后密度控制皮质(CCI)的影响。(一)受伤部位的示意图表示。Nissl-stained大脑部分从动物1和7天后CCI (CCI:动物控制后皮质的影响;骗局:动物没有皮质受到颅骨切除术损伤)。(b)脊柱密度(每1的刺μipsi树突长度),对侧的第二和第三C57Bl6 / J小鼠皮质层,1和7天后CCI和虚假的过程;右面板显示代表树突的照片。(c)脊柱密度ipsi——和对侧的齿状回C57Bl6 / J小鼠的1和7天后CCI和虚假的过程;右面板显示代表树突的照片。数据了 。统计分析进行了使用单向方差分析图基的事后测试紧随其后。星号显示统计学意义的CCI和虚假的组,分别。 ; ; 。
2.3。尼氏小染色

验证大脑皮层变性,我们执行尼氏小染色。24小时和7天在受伤后,小鼠麻醉和灌注0.37%硫化物溶液(5毫升/分钟、4°C) 5分钟后用4%多聚甲醛灌注0.1钠磷酸盐缓冲剂,pH值7.4(5毫升/分钟、4°C) 10分钟。大脑从头骨和后缀在缓冲4%多聚甲醛4 h在4°C,然后cryoprotected在溶液中含有30%的甘油0.02钾磷酸盐48 h。样本然后在干冰冷冻和储存在-80°C。冷冻的大脑在冠状平面分段(40μ米)滑动低温恒温器(KAWA.SKA徕卡生物系统;波兰)。部分是安装在显微镜gelatin-covered幻灯片,干,沾染了甲酚紫。Nissl-stained部分使用光学显微镜拍摄的照片尼康Eclipse倪配备PlanApo 2 x的目标。

2.4。树突棘的分析

树突棘是可视化使用亲脂性的染料迪勒(1,1 - - - - - -dioctadecyl-3 3 3 ,3 - - - - - -tetramethylindocarbocyanine高氯酸盐,# D282生活技术,华沙,波兰)。CCI 24小时和7天后,老鼠被牺牲了,他们的大脑被收集。接下来,他们削减到130年μvibratome m部分(徕卡1000年代VT,徕卡生物系统胡桃胡同GmbH是一家,位于德国)。片是迪勒染色加工。随机树突标签是使用1.6执行μm钨粒子(Bio-Rad、大力神、钙、美国)涂上了迪勒。染料是细胞利用基因枪(Bio-Rad)。染色后,切片和0.4%多聚甲醛固定在磷酸盐(PBS;一夜之间在4°C),放置在显微镜幻灯片。 - - - - - -成堆的树突perilesional第二和第三层的皮质和齿状回(DG)获得使用LSM780共焦系统配备40 x目标(计划高度消色透镜40 x / 1.4石油DIC)(蔡司、Poznań、波兰)。迪勒使用HeNe波长594纳米的激光发射很兴奋。对于每一个图像,以下参数被应用:70 nm像素大小,300海里 - - - - - -间隔,平均4。最大强度的预测 - - - - - -堆栈覆盖树突的长度进行了分析使用半自动SpineMagick !软件(49]。它允许手动标记树突棘头和基地。接下来,该软件是自动脊椎边缘,可以手动调整到充分反映脊柱形状(49]。对于每一个动物,5 - 7个树突从选定的大脑区域(每个图像一个每个神经元树突)进行了分析。首先,树突棘密度计算。在下一步中,树突棘检查按照下列形态学参数:脊柱区域,头部宽度,脊柱长度和无尺度参数——长度除以宽度(长度,宽度比(图)2(一个))。这个参数反映了脊柱的—比例越高,越filopodial脊柱。

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图2
时间变化在树突棘的形状控制皮质(CCI)的影响。(a)脊柱形状参数::脊柱区域;B:脊柱的长度;C:头部宽度;B / C:长/宽比。(b)脊柱区域计算ipsi——和对侧皮层和海马C57Bl6 / J小鼠的1和7天后CCI和虚假的过程。(c)头宽度计算ipsi——和对侧皮层和海马C57Bl6 / J小鼠的1和7天后CCI和虚假的过程。(d)脊柱长度计算ipsi——和对侧皮层和海马C57Bl6 / J小鼠的1和7天后CCI和虚假的过程。(e)长度/宽度比例计算ipsi——和对侧皮层和海马C57Bl6 / J小鼠的1和7天后CCI和sham-operated动物。数据了 。统计分析进行了使用单向方差分析图基的事后测试紧随其后。星号显示统计学意义的CCI和虚假的组,分别。 ; ; ; 。

确定组的大小,我们使用假设的基础上,样本容量确定和以下方程: 在哪里 是一组大小, 是一个常数依赖的价值 和权力选择(这里= 10.51,0.9和0.05显著性水平), 是一个估计的总体标准偏差变量,然后呢 是不同的大小。above-estimated值,集团规模是10。在我们的实验中,我们增加了集团规模和不同15至25根据实验(5 - 7 /动物照片,3 - 5个动物每组)。

2.5。统计分析

所有的结果都表示为 。适当的测试选择(见下文),考虑到数据是否正态分布等的变化。所有使用GraphPad棱镜进行了分析,7.02版本(GraphPad软件公司,拉霍亚,CA)。实验群体之间的差异被认为是重要的,如果1型误差小于5%。

3所示。结果

3.1。减少脊椎密度在大脑皮层和海马(CCI)诱发的皮层控制影响

诱导小鼠创伤性脑损伤,我们使用控制皮质影响(CCI)作为描述Bolkvadze和Pitkanen46]。描述形态变化诱发的损伤,大脑收集post-CCI 24小时和7天。控制动物(sham-operated)受到颅骨切除术只接受CCI和牺牲的动物。尼氏小染色显示时间大脑皮层受伤部位(图中退化1(一))。在sham-operated动物,几乎没有任何观察组织损伤。另一批动物被用来执行树突棘的分析。动物受到CCI或虚假的手术。24小时或7天后,他们的大脑收集执行分析树突棘ipsi -和侧方。为此,我们使用亲脂性的染料结合到细胞膜,标志着整个细胞轮廓。部分被使用共焦显微镜成像,在材料和方法描述。脊柱密度计算的数量每1突起μ米的树突长度。CCI 24小时和7天之后,脊柱的密度降低了第二和第三层侧大脑皮层,而侧半球(24 h ;7 d )和虚假的动物(24 h ;7 d ;图2 (b))。类似的效果观察的DG脊柱创伤性脑损伤后24小时和7天密度显著降低而侧方(24 h ;7 d ;图1 (c))和sham-operated动物(24小时 ;7 d ;图1 (c))。

3.2。树突棘变得更短和更广泛的在受伤的大脑皮层区域

接下来,我们旨在更详细分析创伤后的形态学变化。为此,我们使用了一个半自动的软件评估树突棘形状的基础上,以下参数:长度,宽度,长度和宽度比描述脊柱形状,增加反映filopodial形状(图2(一个))。参数测量两个时间点,1,CCI后7天。树突棘萎缩在创伤后的侧大脑皮层的区域较小的脑损伤后24小时和7天,而对侧皮层(24小时 ;7 d ;图1 (b))。观察侧半球之间的显著差异和sham-operated动物只有24小时后( ),在总干事时,没有观察到显著差异(图2 (b))。头宽度(脊柱)的宽度最宽点增加皮层和DG在受伤的半球,而侧半球(皮质:24小时 ;7 d ;DG: 7 d )和动物接受虚假的手术(皮质:24小时 ;7 d ;DG: 24小时 ;7 d )(图2 (c))。下一个参数,脊柱的长度,反映了脊椎底部到顶部的距离(图2 (d))。身体的同侧的皮层,脊柱长度相比降低侧半球在两个时间点(24 h ;7 d )和sham-operated动物(24 h ;7 d )。相比之下,在侧DG,刺比虚假的操作(24小时后在动物身上 ;7 d ),观察和对侧半球相比没有区别。减少脊椎的长度和宽度的比值相比侧大脑皮层中可观察到对侧的边(图2 (e)24小时: ;7 d )和虚假的动物(24小时: ;7 d )。在侧DG,相反的效果被注意到,长度/宽度比例增加对创伤性脑损伤侧相比DG (24 h ;7 d )以及比较虚假的动物(24 h ;7 d ;图2 (e))。

3.3。缺乏MMP-9损害脑损伤脊柱密度下降的影响

由于MMP-9树突棘的关键调节器之一形状及其在创伤性脑损伤的作用和随后epileptogenesis最近强调[28),我们着手评估缺乏MMP-9是否会影响观察形态学变化WT动物。为此,我们使用老鼠失踪MMP-9 (MMP-9 KO)及其野生型的同胞(WT MMP-9)。我们专注于7天post-CCI时间点。正如我们在以前的报告的报道,MMP-9活动是在脑损伤后第一周(最高的28]。在WT CCI和KO MMP-9动物后,我们分析了树突棘如上所述。脑损伤后1周,脊柱侧大脑皮层密度降低的WT动物比受伤的大脑(侧的一面 ;图3(一个))和sham-operated动物( ;图3(一个))。然而,这一现象并未观察到MMP-9 KO小鼠(数字3(一个)和3 (b))。

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图3
缺乏功能性MMP-9对脊柱的影响在动物密度控制皮质(CCI)的影响。(a)脊柱密度ipsi——和对侧的第二和第三的皮质层动物不同mmp-9基因表达水平CCI和虚假的手术后1周;上面板显示代表树突的照片。(b)脊柱密度ipsi,侧齿状回的动物不同mmp-9基因表达水平CCI和虚假的手术后1周;上面板显示代表树突的照片。数据了 。统计分析进行了使用单向方差分析图基的事后测试紧随其后。星号显示统计学意义的CCI和虚假的组,分别。 。
3.4。MMP-9需要脊柱形状重构时受伤

的影响进一步解开MMP-9树突棘的postinjury形态变化,分析脊柱基本参数(图2(一个))。我们专注于长度宽度比和棘头宽度为这些参数表明是否突出发生塑性变化。在WT动物,同侧大脑皮层区域,我们观察到头部宽度增加而对侧半球( ;图4(一))和sham-operated动物( ;图4(一))。同样,大脑皮层、海马WT MMP-9侧齿状回的老鼠,头宽度相比明显更大的侧海马( ;图5(一个))和sham-operated动物( ;图5(一个))。相反,在MMP-9 KO动物,CCI后,未发现树突棘形态学变化在两种结构(数据分析4(一)和5(一个))。受伤的大脑皮层,WT MMP-9老鼠长度/宽度比例减少,而在身体的同侧的齿状回增加(数据4 (b)和5 (b))。同侧皮层的变化是重要的比侧的大脑( ;图4 (b))和虚假的动物( ;图4 (b)),而在MMP-9 KO小鼠,观察(图没有差异4 (b))。DG,脊柱的长度和宽度同侧半球之间的比例明显高于相比只有虚假的动物( ;图5 (b))。同样,大脑皮层,CCI和虚假的团体之间的变化并不显著(图5 (b))。

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图4
MMP-9对脊柱的形状变化的影响动物的大脑皮质层1周post-CCI。(一)头宽度计算ipsi——和对侧皮层和海马C57Bl6 / J小鼠,7天后CCI和虚假的程序。(b)长度/宽度比例计算ipsi——和对侧皮层和海马C57Bl6 / J小鼠,CCI和sham-operated动物后7天。(c)树突的照片ipsi——和对侧皮层和虚假的动物。(d)代表树突的照片ipsi——和对侧皮层和虚假的动物。数据了 。统计分析进行了使用单向方差分析图基的事后测试紧随其后。星号显示统计学意义的CCI和虚假的组,分别。 ; 。
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图5
MMP-9对脊柱的形状变化的影响动物的齿状回post-CCI 1星期。(a)头宽度计算ipsi C57Bl6 / J小鼠侧海马,7天后CCI和虚假的过程。(b)长度/宽度比例计算ipsi C57Bl6 / J小鼠侧海马,CCI和sham-operated动物后7天。(c)树突的照片ipsi,侧齿状回和虚假的动物。(d)代表树突的照片ipsi,侧齿状回和虚假的动物。数据了 。统计分析进行了使用单向方差分析图基的事后测试紧随其后。星号显示统计学意义的CCI和虚假的组,分别。 ; 。

4所示。讨论

在这里,我们表明,创伤性脑损伤引起的大脑皮层控制影响诱发急性(1天内post-TBI)树突棘数量和形态的变化,以及长期在受伤后(7天)脊柱重建。脊柱密度减少脑外伤后同侧侧大脑皮层和海马齿状回。创伤后树突棘的同侧大脑皮层萎缩,变短、让他们的头宽,从而被转化成更多的蘑菇型的形状。另一方面,刺在DG侧变长了,薄,假设更filopodial的形式。缺乏MMP-9活动在大脑中废除的影响引起的创伤,都到脊柱动态(反映在密度的变化)和形态可塑性。

树突棘是包含大多数兴奋性突触的突起,因此选通输入收到的神经细胞(4,50]。树突棘的密度和形态是由突触活动,所以刺经历一生中动态的营业额。Filopodia-shaped刺更突出发展中大脑和被认为是“不成熟的”[51]。一些报告显示,这些都是脊椎前体在突触形成(52]。刺被认为是“成熟”蘑菇形的,允许稳定脊柱通过收集更多的神经递质受体的头(53]。等特性的形状是狭窄的脊椎脖子也划分突触传导发生所必需的钙(54]。当大脑受到损伤,刺回应相应的维护环境内稳态(7]。

首先,我们测量了树突棘密度。脊柱数量已被证明是与整体突触活动有关,例如,在海马树突棘密度的瞬态增强伴随着早期长期势差(LTP)在齿状回55]。先前的研究在树突棘塑性诱发的创伤性脑损伤动物模型显示减少脊柱在海马体和大脑皮层密度在不同时期脑损伤后35天(24小时)9,11,13,16]。此外,一项研究扩展这些观察到1.5年,显示变化,最后不仅脑损伤后不久,而且持续到慢性创伤性脑损伤的阶段。此外,他们在网站之外的广泛地区急性创伤(12]。

树突棘损失是伴随着树突变形和肿胀(15]。我们的研究结果基本上是符合上述数据;然而,他们延长这些观察通过描述详细的形状参数。在目前的研究中,我们表明,24小时postinjury树突棘密度减少身体的同侧的侧皮层和海马,这和以前的报告是一致的(8,11]。我们进一步证明,受伤后7天每长度树突棘的数量仍在减少大脑皮层和DG。树突棘损失一周posttrauma也显示在海马的CA1 [12]。因为我们的创伤性脑损伤的情况更严重,我们得出结论,即使轻微的损伤会导致大脑的变化。

此外,我们也显示详细的形态学分析树突棘的创伤性脑损伤后皮层和海马。在这里,我们表明,脑外伤后引起的CCI,树突棘在大脑皮层,身体的同侧的伤害方面,越来越短,头变得更广泛,相比sham-operated动物和侧一边的受伤的大脑皮层。总的来说,脊柱中观察到大脑皮层可塑性侧更深的伤害和DG显示类似的模式的脊柱形态改变,除了长度/宽度的比例。这个形态参数被认为反映脊柱成熟度(4,39,52]。这个值越大,脊柱更filopodial-shaped,即。,不成熟。这一发现值得特别的评论。filopodia-like刺可能倾向于支持启动突触可塑性的过程(4,36,50]。因此,这一结果可能表明DG接受突触可塑性可能使这个大脑结构支持epileptogenesis常可导致创伤性脑损伤的56,57]。

在目前的研究中,我们表明,TBI-driven动力学和形态学的可塑性MMP-9-dependent树突棘。增加MMP-9创伤性脑损伤后曾被报道在动物的大脑和人类的脑脊液,血浆和血清9,30.,44- - - - - -47,58,59]。MMP-9的可能作用在控制脊柱动态DG就得以证实,治疗后excitotoxic红藻氨酸,在MMP-9 KO小鼠发现对脊柱损失(60,61年]。同样,最近,长冈et al。62年)报道,MMP-9控制脊柱动态脆性X智力迟钝的大脑皮层蛋白KO小鼠。

此外,在我们的研究中,缺少MMP-9完全废除树突棘形态可塑性引起的创伤性脑损伤,在同侧的大脑皮层损伤和齿状回。这一发现顺利连同MMP-9的多个数据显示一个关键的角色在调节树突棘大小和形状(29日,63年,64年]。

最后,我们应当强调,以前的研究(28,40)表明,MMP-9 KO小鼠大脑CCI后显示有限的脑损伤。然而,这种保护脑损伤的扩展(MMP-9 KO仍然证明了几乎40%的皮质损伤面积比WT)似乎并没有解释整个废除MMP-9 KO的创伤性脑损伤对脊柱的影响大脑。

5。结论

在此,我们提供了一个详细的分析TBI-evoked密度和形态可塑性的树突棘。在受伤的结果,我们发现有一个减少脊柱密度非常接近(侧大脑皮层)和更多的远端(海马齿状回身体的同侧的一侧)伤害的轨迹。然而,棘神经元位于接近受伤承担更多的蘑菇型的形状,而在DG更加filopodia-like。失踪MMP-9之前显示施加控制脊柱的密度和形态完全废除上述的可塑性。考虑到之前报道的角色在创伤后MMP-9 epileptogenesis (PTE)可能是由突触可塑性异常,证据确凿的这种酶的作用,树突棘的可塑性,人们很容易认为MMP-9-dependent树突棘动力学和形态可塑性PTE。

数据可用性

之前报道(CCI后MMP-9活动;MMP-9在创伤后epileptogenesis)本研究数据被用来支持和可用doi:10.1007 / s12035 - 018 - 1061 - 5。这些先前的研究(和数据)援引文本中有关地方文献[28]。

的利益冲突

作者宣称没有利益相关的出版竞争。

确认

这项研究是由国家中心的资助研发(NCBiR)赠款:ERA-NET神经元格兰特(神经元/ 09/13)和(PBS / A8/36/2015)和波兰的基础科学BRAINCITY马伯/ 2018/10。BRAINCITY项目内进行国际波兰的基础科学的研究议程项目由欧盟共同投资在欧洲区域发展基金。