电针通过mir -134介导的LIMK1功能调节缺血性脑卒中大鼠海马突触可塑性

摘要

mircorna (miRs)通过调节LIM结构域激酶(LIMK1)诱导突触-树突状可塑性与学习和记忆有关。该研究旨在研究miRNAs/LIMK1信号是否参与电针(EA-)介导的大脑中动脉闭塞性认知缺陷(MICD)模型大鼠突触-树突可塑性。Morris水迷宫试验中，DU20和DU24穴位EA较未处理和非EA处理可缩短逃跑潜伏期，增加跨台频率。t2加权成像显示MICD老鼠大脑病变位于皮质,海马、纹状体、丘脑区域和EA后成交量减少受伤。此外,我们发现树突棘的密度和突触在海马CA1锥体细胞的数量明显减少MICD后14天。此外，突触-树突可塑性与海马CA1区总LIMK1和磷酸化LIMK1水平的增加有关，其中EA降低miR-134的表达，负调控LIMK1以增强突触-树突可塑性。因此，mir -134介导的LIMK1参与ea诱导的海马突触可塑性，在缺血性卒中恢复期提高学习记忆能力。

1.导言

缺血性卒中导致了很高的死亡率和全世界残疾率增加[1]．大约64%的中风患者通常伴有认知障碍，33%的患者在减热期间会发展为持续数月的痴呆[2].缺血性中风后，认知缺陷经常出现，导致分析、集中、组织、解释困难，以及其他认知功能减弱，导致生活质量低下[3.那4.]学习记忆障碍是脑卒中后认知功能障碍的主要症状，也是后遗症持续存在的主要原因[5.]．最近的一项研究表明，在3岁后，24.4％的人诊断出在24.4％的人中诊断出的发生率。每年平均增长率约为8％[6.]．除了常规的认知训练，电（EA）是针刺的拉伸治疗方法，该方法是传统的针刺掺入与现代电疗。EA的脑卒中后认知功能障碍的临床疗效已被广泛证实[7.那8.]．然而，EA的功能机制还远未被完全阐明。

海马是大脑的关键结构；该区域在陈述性记忆和空间记忆的获得、巩固和识别过程中起着重要作用[9.那10]．卒中后海马突触和神经元的缺失导致认知缺陷，包括空间参考学习和记忆障碍[11那12]．在空间参考记忆的形成与树突状棘的可塑性和形态变化如扩张和收缩密切相关[13]．树突棘改变它们的形状，以使信息传播更容易，并影响突触效能（即，长时程增强和长期抑郁症）[14那15]，它已被广泛认为是用于学习和记忆[蜂窝机构16]．LIM结构域激酶（LIMK1）富集在海马锥体神经元的轴突二者和树突生长锥大鼠[17]．LIMK1编码一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，通过磷酸化和灭活肌动蛋白解聚因子(ADF)/cofilin调控肌动蛋白细胞骨架[18]．此外，Limk1也被称为在Synapse和树突脊柱功能中具有重要作用。据报道，缺乏利润率的敲除小鼠在树突脊柱形态和海马长期增强中受到严重受损[19那20.]．有证据表明，LIMK1通过与激活循环AMP反应元件结合蛋白(CREB)相互作用调节长期记忆(LTM)和长期突触可塑性[21]．

此外，鉴于大脑特异性miRNA有助于突触发育、成熟和/或可塑性的证据，microRNA（miRNA或miR）在突触功能中的潜在作用尤其令人感兴趣[22]．miRNA是介导基因表达的转录后调控主要通过结合到信使RNA（mRNA）的3'-非翻译区的内源性，非编码RNA [23]．许多mirna已经从神经系统中分离出来，最近的一项研究表明，它在动态调节突触可塑性方面起着至关重要的作用[24那25]．此外，MIRNA涉及在海马依赖的功能中，其具有学习和记忆形成的显着潜力，调节利率诱导突触树突塑性的LIMK1表达[22]树突状mRNA编码海马锥体神经元的多种功能，在突触可塑性以及学习和记忆中发挥重要作用[26]．

因此，miRNA-LIMK1可被视为认知功能障碍的靶点。我们先前的研究表明，电针百会穴（DU20）和神亭穴（DU24）可通过Rho GTPases增强缺血性卒中大鼠树突状细胞的可塑性来改善认知功能障碍[27]有趣的是，有人认为Rho GTPases信号的激活对于通过苏氨酸508磷酸化激活LIMK1至关重要，苏氨酸508被广泛认为是肌动蛋白动力学的主要调节器[28那29]．因此，本研究旨在阐明DU20和DU24穴位EA是否可以通过mirna - limk1介导的突触可塑性改善缺血性脑卒中大鼠的认知缺陷，增强空间参考学习和记忆。

2。材料和方法

2.1.动物伦理声明

96只雄性Sprague-Dawley大鼠（体重250±20 g） 从上海斯拉克实验动物有限公司（中国上海，SCXK2013-0005）获得，在无病原体条件下饲养，带有12个 h光/暗循环。这项研究得到了福建中医学院委员会（议定书第五届-201500年）的批准，并按照国家实验室动物护理和使用指南进行。对于安乐死，3%戊巴比妥钠（40 使用mg/kg体重，i.p.）。大脑中动脉阻塞（MCAO）手术是在全身麻醉下进行的（1.5%异氟醚，68.5%N）₂o和30％o₂）.所有的努力都是为了减少痛苦。

2．2.实验程序

如前所述，建立了mcao诱发的认知缺陷(MICD)模型[5.那30]．大鼠按随机数表随机分为四组（各组大鼠）如下：（1）假手术组，（2）MICD组，（3）MICD+EA组，（4）MICD+非EA组。左侧大脑中动脉被4-0尼龙单丝（0.23）阻塞 直径mm，嘉陵生物，中国）。采用经颅多普勒颞叶激光（BIOPAC Systems，Goleta，CA，USA）监测局灶性脑缺血，并记录闭塞后血流减少80%。90后 在闭塞的第分钟，通过拔出灯丝恢复血流实现再灌注。假手术组的假手术大鼠接受相同的程序，但未进行动脉闭塞。

24小时MCAO手术后，假手术组和MICD组大鼠不做任何处理。Rats of the MICD+EA group were given EA treatment for 30 min per day for 14 consecutive days. The EA needles (diameter, 0.3 mm, needle purchased from Hualun acupuncture of Suzhou Co., Ltd., Suzhou China) were inserted at a depth of 2-3 mm into the Baihui (DU20, located in the median of frontalis) and Shenting (DU24, located in the median of the parietal bone) acupoints [31]．Stimulation was then generated using the EA apparatus [Model G6805, Shanghai Huayi (Group) Company, Ltd., Shanghai, China] and the stimulation parameters were set as follows: dilatational waves of 1~20 Hz (adjusted to the muscle twitch threshold), peak voltage of 6 V, and 0.2 mA intensity [31].MICD+非EA组的大鼠在双侧非穴位（位于肋部和10处）给予EA治疗 髂骨嵴远侧30 mm）30 连续14天每天最小值[32]．电针及双侧非穴位刺激参数与电针治疗一致。操作人员经验丰富，对大鼠组视而不见。

2.3。行为评估

行为测试由谁被蒙蔽老鼠的研究小组进行。在EA后10天，所有的大鼠进行Morris水迷宫测试（上海Xinruan信息技术有限公司，上海，中国），以评估空间参考学习和记忆（图1).莫里斯水迷宫由一个圆形水池（直径150 身高60厘米 cm）充满水（深度为30 厘米，温度为25±2°C）。圆形逃生平台（直径12 身高29厘米 cm）被淹没2 厘米以下的水面，在中间的第三象限池和参考对象周围的游泳池被放置。莫里斯水迷宫任务主要包括定向导航和空间探索试验。在第一组试验中，将每只大鼠置于离平台四个等距位置的水中。当老鼠在90分钟内到达站台时 秒的时间限制，并保持3秒 秒，他们被视为已找到站台，并根据所用时间/路线长度进行评分。当老鼠在90秒内找不到平台时 秒，他们被放置在平台上10分钟 秒，时间分数是90 秒。计算机记录了每只老鼠找到安全平台的时间和路线长度。每天评估每只大鼠在四个象限的平均时间和路线长度。第一组试验的持续时间在电针后10至13天进行。实验的第二部分在第14天进行，以检查大鼠在90天内找到平台位置的时间 秒时间限制，测试他们记住平台位置的能力。所有试验结束后，用吹风机将大鼠彻底吹干，并将其放回笼子（中国广州瑞宝生物科技有限公司）。Morris水迷宫实验重复三次。

２.４.脑损伤测量

Animal MRI scans were performed on a 7.0 T MRI scanner (70/20 USR BioSpec, Bruker Biospin Gmbls, Germany) using a 38 mm birdcage rat brain quadrature resonator for radiofrequency transmission and reception. Animals were anesthetized with isoflurane/O₂(3%诱导5分钟，1.2-1.5%维持，以使大鼠处于深度麻醉状态)，并以回路保温。麻醉结束后，将大鼠置于特制支架上，俯卧位尽量减少头部运动，设定头部位置，实时监测呼吸频率，维持在40次/min。在保持呼吸的同时，保持大鼠的体温在33±2℃，尽量减少头部运动。

首先获取三个平面的T2加权成像（T2WI）和快速自旋回波（FSE）脉冲序列，以控制大鼠头部定位。使用具有松弛增强（罕见）脉冲序列的快速获取进行T2WI扫描，参数如下：视野=32 毫米×32 毫米，矩阵大小=256×256，重复时间（TR）=4200 毫秒，回波时间（TE）=35 ms，切片厚度=1.0 毫米，切片间隙=0 嗯。

T2W图像采用图像J分析处理系统，脑损伤百分比=脑损伤体积/全脑体积×100%。

2．5．高尔基染色法

使用FD快速golgistainkit按照制造商说明(FD Neurotechnologies, Inc.， Columbia, MD, USA)对大脑进行高尔基染色。取下的大鼠脑置于试剂盒中a、B两种溶液的混合物中孵育，室温黑暗保存，然后转入试剂盒中C溶液中，4℃保存7天。最后，将大脑冷冻并进行冠状切片(150μm） 使用低温恒温器（徕卡CM3050S，徕卡微系统K.K.，日本东京）制造。切片在试剂盒的D和E混合溶液中孵育，然后在酒精（50%、70%、90%和100%）中脱水5分钟 每分钟），在二甲苯中清除，并盖上盖子。最后在显微镜下观察图像（莱卡DM6000 B，莱卡微系统公司，德国韦茨拉尔）。这些幻灯片由两到三名对该研究视而不见的病理学家审查。

2.6。透射电子显微镜

每组4只大鼠麻醉，左心室灌流200毫升 mL生理盐水，然后400 mL 4%多聚甲醛（pH7.4）。从左侧缺血海马中取出组织，切成1块 嗯^3.尺寸立方体，固定在1%多聚甲醛和1%硝酸镧示踪剂中24小时 h，然后用3%戊二醛固定24小时 h、 样品在1%四氧化锇中固定2小时 h，在分级乙醇1%硝酸镧示踪剂（LNT）溶液中脱水并包埋在araldite中。获得超薄海马CA1切片（90） 然后用醋酸铀酰和柠檬酸铅染色，在透射电镜下观察（H-7650；日本东京日立有限公司）。这些照片是在hp数字CCD相机（Sis400万体素）上获得的。在每种条件下，从随机选择的10到15个场池中以数字方式获取图像。

2.7。Western Blotting.

分离左侧海马组织100例 μL放射免疫沉淀分析（RIPA）缓冲液（Beyotime，江苏海门，中国）加蛋白酶抑制剂。总蛋白（50 μG）将电泳加载到10％SDS-PAGE凝胶中，然后在TRIS-甘氨酸转移缓冲液中渗透到聚偏二氟化葡聚糖膜（Immobilon-P; Millipore，Billerica，MA）上。在通过振动的室温下在PBST中封闭1小时后，将膜与抗体一起在4℃下孵育过夜：抗利率（稀释，1：1000; AB81046，ABCAM）和抗 -LiM激酶1抗体（磷酸-THR508）（稀释，1：1000; AB131341，ABCAM）和β-Actin（稀释，1：1000; ab189073; abcam）。第二天，用抗山羊或抗小鼠IgG抗体（稀释，1：5000; PerkinElmer Life Sciences，Waltham，MA）在室温下，在室温下在室温下在室温下孵育膜。在每种抗体处理之间，在PBST中在PBST中至少洗涤膜（每次洗涤10分钟）。使用增强的化学发光可视化检测的条带，使用生物图像系统（Bio-rad Laboratories，Inc.，Hercules，USA）捕获图像。蛋白质印迹重复三次。

2.8.实时定量RT-PCR

miRNA的表达通过实时定量逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）来确定。总RNA从使用TRIzol试剂（Life Technologies公司（AB＆Invitrogen公司），卡尔斯巴德，USA）同侧病变组织的海马区萃取。然后提取总RNA逆转录根据还原AidTM第一链cDNA合成试剂盒（赛默飞世尔科技，北京，中国）的制造商的说明，以产生cDNA。逆转录反应是使用Bio-Rad公司CFX96检测系统（Bio-Rad公司，赫拉克勒斯，CA，USA）用该叩诊锤™一步法的qRT-PCR系统（Promega，麦迪逊，WI，USA）进行扩增。对于miRNA的扩增，使用下列引物：RNO-的miR-134（RmiRQP0168，多种载体，广州，中国）。使用被确定在相对mRNA和miRNA表达的倍数变化方法如前所述[33]和U6 snRNA启动（RQP047936，多种载体）作为分别的mRNA和miRNA的内部控制。

2.9。统计分析

是用SPSS软件包for Windows统计分析软件（版本18.0，SPSS公司，芝加哥，IL，USA）统计分析。从各组数据采用方差（ANOVA）的单向分析和学生的决定-tests。使用最低差异方法和使用游戏-Howell方法的缺失的差异分析方差的均匀性。在不同时间点对脑病变体积的依法血液损伤体积的比较进行配对样本进行-tests。所有的数据都以平均值±标准差，和意义被视为至少.所有最终结果均以盲法进行分析。

结果

3.1.电针改善MICD大鼠的认知障碍

为了评估EA的上空间参考学习和记忆障碍在MICD大鼠作用，进行Morris水迷宫（MWM）测试。学会找到平台的大鼠的所有组，并等待时间到达平台的四个训练日减少。然而，学习能力MICD大鼠显著降低与假手术组相比（,图2（a）);与MICD组和MICD+非EA组相比，EA组MICD大鼠寻找平台的时间明显缩短(或,图2（a））.与会者一致认为，各组间的路径长度没有显著差异（,图图2（b））.如图所示图2（c）和图2（d），来自MWM测试的追踪图像显示，在移除平台的空间探索测试中，MICD大鼠通过平台原始位置的次数少于Sham组(,图图2（d）)，而MICD+EA组大鼠穿过平台位置的次数明显高于MICD组和MICD+非EA组(那,图图2（d））.如图所示2（e）和2（f），在探针试验期间，在目标象限花费的时间百分比用于统计分析。数据显示，与其他象限相比，大鼠在目标象限花费的时间更多(；数字2（e））.与其他组相比，MICD组在目标象限花费的时间更少(；数字2（e）).与MICD组和MICD+非EA组相比，MICD+EA组在目标象限的时间更长(那,图2（f）)因此，这些结果表明，电针治疗改善了MICD大鼠空间参考学习和记忆的获得或保持。

３．２．EA减弱MICD大鼠左皮质、海马、纹状体和丘脑病变

T2WI检查脑组织病变(图)图3（a）和3（c）)电针治疗前后。电针治疗前，所有组的左皮质、海马、纹状体和丘脑区域的脑损伤体积均无显著差异(,数据图3（a）和3（b）).MICD组的脑损伤在14天内有轻微的自发恢复。MICD组的左皮质、海马、纹状体和丘脑损伤的体积约占整个大脑的23%，而MICD+EA组的脑损伤大小显著减少至15%(,数据3（c）和3 (d)）.EA后MICD + EA和MICD +非EA组之间脑部病变的差异表明在第14天显著变化（,数据3（c）和3 (d)）.

3.3.电针可增加MICD大鼠海马树突棘的密度

为了研究电刺激对突触可塑性的作用，我们在电刺激后14天通过高尔基染色锥体神经元的基底树突分析海马神经元的树突棘密度。高尔基-考克斯染色清晰地填充了树突轴和锥体神经元的棘突(图)4（a））.由此，代表海马表明，树突棘的密度在不同程度通过肉眼检查所述MICD组中减少，MICD + EA基，MICD +非EA基团，并且在海马CA1树突棘损失是明显在MICD组。因此，在图所示4 (b)和4 (c)，与假手术组相比，MICD组海马CA1区树突棘的密度显著降低();然而，MICD + EA组中海马CA1的树突刺的密度大于MICD组和MICD +非EA组（）.总之，EA治疗引发了海马CA1区树突的大规模重塑。

3.4. 电针增强MICD大鼠海马CA1突触数量

此外，我们还观察了电针对海马CA1区锥体神经元超微结构的影响，与假手术组相比，MICD组的突触密度明显降低(,数据5(一个)和5 (b))，而MICD+EA组与MICD组和MICD+非EA组相比，突触数量增加(或,数据5(一个)和5 (b)）.

综上所述，这些结果表明电针可以改善体内突触树突状细胞的可塑性。

3.5。在MICD大鼠EA促进LIMK1表达海马CA1区的磷酸化和

为了探索电针诱导突触树突可塑性的潜在分子机制，我们研究了海马CA1区总LIMK1和磷酸化LIMK1（P-LIMK1，Thr508）的水平。如图所示6(一)和6 (b)与假手术组相比，MICD组海马CA1区总LIMK1的表达显著降低(）.然而，MICD+EA组的总LIMK1水平高于MICD组和MICD+非EA组(,数据6(一)和6 (b))此外，各组中磷酸化LIMK1（Thr508）的变化与LIMK1的总表达相似。与MICD组和MICD+非EA组相比，MICD+EA组的P-LIMK1水平显著升高(,数据6(一)和6 (c)）.

3.6.电针调节MICD大鼠海马CA1区miR-134的表达

为了确定突触树突相关的miR-134在海马CA1中的作用，检测其水平。如图所示7.与假手术组相比，MICD组中miR-134的表达显著增加()然而，与MICD组和MICD+非EA组相比，重复EA治疗显著降低了miR-134的表达(）.

4.讨论

缺血性中风导致长期认知障碍的高发生率，这与海马神经元和突触的损失密切相关[34]。在查阅有关针灸和认知障碍相关术语的古代中国文献时，我们发现，DU20和DU24穴位是中国认知障碍相关康复最常选择的穴位。大量研究表明，电针可以提高学习记忆能力，刺激大脑意识[30那31那35]．这些结果表明，EA可能是中风后认知功能障碍的补充治疗。本研究发现，EA在DU20和DU24穴位缩短的时间找到平台和增加的交叉比较，在Morris水迷宫试验untreatment或nonacupoint EA（刺激对照）平台的位置的时间，这表明电针能改善空间参考学习和在MCAO诱导的认知缺陷（MICD）大鼠记忆能力。此外，值得一提的是，在四组Morris水迷宫的路径长度没有表现出显著差异，表明MICD大鼠的一次消费额，找对象不影响运动功能。然而，认知治疗所涉及的机制远未完全阐明。

首先，通过小动物MRI测定缺血性中风大鼠的认知缺陷相关脑区。T2加权成像显示，在电针前，MICD引起左皮质、海马、纹状体和丘脑区的损伤。人们注意到，脑损伤表现出轻微的自发恢复表现MICD大鼠。然而，通过电针治疗，占全脑体积约23%的病变区域减少到15%，这表明电针可以减轻MICD大鼠的皮质和海马、纹状体和丘脑区域病变。其中一些区域，如海马和皮质，对调节学习素至关重要g和记忆行为，包括空间探索[36]．研究证实，海马地区通过其特定结构和地点在一起，在学习和记忆中发挥着非常重要的作用和与其他大脑地区一起连接的位置[37]．另外，为了识别在认知缺陷海马功能，观察到海马形态学染色。

使用高尔基染色和电子显微镜，我们证明了树突脊柱的密度和海马CA1金字塔孔细胞的突触数明显减少了MICD。然而，EA可以拯救海马CA1区域中树突脊柱的丧失和突触。此外，EA促进了突触 - 树突脊柱再生。树突脊柱是具有多密集体和离子通道的微小突起，各种类型的神经元表面，它用作脑连接的细胞基板和大脑中的信息处理的主要部位[38那39]．越来越多的证据表明，突触-树突状可塑性使记忆编码成为可能[40]事实上，树突棘的数量、大小和形状的改变对突触的可塑性以及海马依赖性学习和记忆具有重要意义[41那42]．研究已经很好地描述了缺血周围区域的树突棘重塑可能有助于卒中后认知功能的恢复[43那44]．

越来越多的证据表明LIMK1蛋白在树突棘膜上被激活[45]．LIMK1阳性细胞位于海马CA1区，在体内调节脊柱形态和突触功能中起重要作用。长期的突触可塑性被认为是记忆形成的关键[26]．本研究中发现，总LIMK1和海马CA1磷酸LIMK1的表达在MICD大鼠显著下降;但是，EA可以提高总LIMK1和磷酸化LIMK1水平，促进海马CA1区突触可塑性的树突状。

此外，我们已经确定了树枝状本地化的miRNA调节突触LIMK1蛋白的表达，由此控制树突松大小。的miR-134是首次发现树突微RNA，在大鼠海马神经元的神经元树突富集，负调控树突棘的大小[46]．这种效果是由miR-134抑制Limk1 mRNA的翻译的介导的介导的介导[47]．本研究显示MICD大鼠中miR-134的表达明显升高。而反复EA处理可缓解海马CA1区miR-134的上调表达。

综上所述，本研究表明，电针DU20和DU24穴可通过调节海马CA1区突触树突状可塑性改善MICD大鼠的认知损害，并激活突触LIMK1蛋白的表达和磷酸化，以控制树突状棘的数量、大小和形状此外，电针治疗诱导LIMK1增加的机制可能与miR-134有关，miR-134定位于海马CA1区，通过负性调节LIMK1增强缺血性卒中恢复期的突触树突可塑性。

竞争利益

作者声明没有经济或商业利益冲突。

作者的贡献

维林刘，吴捷和贾乎盎同等贡献这项工作。

致谢

本研究得到了中国自然科学基金（81403450号）和福建省自然科学基金（2016J01382）的支持。

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