通过测量和量化惊吓反应评价斑马鱼幼体毛细胞再生

摘要

在过去的二十年里，斑马鱼已经成为听觉和平衡系统研究的一个既定模式生物。传统的检测毛细胞的方法是使用染料进行选择性染色，这显示了毛细胞的数量和形态，但不显示它们的功能。惊吓反应是一种与毛细胞听觉功能密切相关的行为;因此，它可以用来测量毛细胞的功能。在这项研究中，我们开发了一种设备来测量斑马鱼幼虫的惊吓反应。通过应用不同程度的刺激，系统可以分辨出10db的差异。斑马鱼的毛细胞在暴露于噪音或药物治疗后可以再生。用这个装置，我们测量了斑马鱼幼虫在药物治疗期间和之后的惊吓反应。结果与传统的毛细胞染色法相似。经药物治疗后，惊吓反应降低，停药后恢复。 Together it demonstrated the capability of this behavioral assay in evaluating the hair cell functions of fish larvae and its potential as a high-throughput screening tool for auditory-related gene and drug discovery.

1.介绍

由于斑马鱼体型小，繁殖能力强，且胚胎外部发育透明，因此斑马鱼在发育和遗传学研究以及毒理学和组学研究中处于领先地位[1- - - - - -6.］.尽管与其他模型相比，脊椎动物斑马鱼与人类的基因距离更远，但它有类似的器官和组织，如心脏、肾脏、胰腺、骨骼、软骨，甚至听觉器官[7.，8.］.事实上，斑马鱼如今已经成为听觉研究中基因和药物筛选的动物模型，并在过去20年成为听觉和平衡系统研究的流行模型生物[9- - - - - -12］.

斑马鱼作为听觉研究的模型具有许多有价值的特征。例如，在斑马鱼身上发现了几十种与听力相关的基因，其中许多基因同样影响着人类和其他脊椎动物的内耳[7.，8.］.此外，它们对各种耳毒素、耳保护剂和耳再生剂的敏感性与斑马鱼和人类相当[6.，10］.侧线系统中的毛细胞与人类内耳中的毛细胞是同源的，只是位于斑马鱼皮肤的表面，具有良好的各种染料和化学物质的渗透性[13］.研究斑马鱼毛细胞生物物理特性的最新进展为如何将斑马鱼毛细胞与哺乳动物毛细胞的研究结果联系起来提供了证据[14，15］.

感觉毛细胞的丧失是导致耳聋或听力缺陷的主要原因，这一过程在哺乳脊椎动物中是不可逆转的。在毛细胞损伤或死亡后，毛细胞的再生没有或非常有限。人类出生后毛细胞的死亡通常是由细菌感染、长时间暴露在噪音中造成的损伤，以及某些耳毒性药物(如氨基糖苷类抗生素或化疗药物)的治疗引起的。与哺乳动物不同的是，绝大多数非哺乳动物的毛细胞都能再生，包括斑马鱼[16，17]结合斑马鱼优越的技术特性，该动物模型将成为研究毛细胞再生和发育的独特研究工具[18］.目前正在进行的努力，以确定再生特定的基因和途径，在特定阶段的毛细胞再生。

斑马鱼的毛细胞再生通常通过对毛细胞染色和显微镜下计数来评估。简单地说，可以用一种特殊的耳毒素(如新霉素)检测药物剂量依赖性的毛细胞死亡，并可以用适当的药物剂量实现边缘毛细胞死亡来研究随后的延时细胞再生[17，19］.

与听性脑干反应或小鼠耳声发射的电生理测量相比，斑马鱼毛细胞的功能检查很困难，因为缺乏可靠的量化方法。斑马鱼的感觉器官在神经上引发了丰富的运动行为，无论是后者耳线系统还是听觉系统[20］.例如，惊吓反应有一些明确和稳定的特征，可以简单地由轻敲斑马鱼容器触发[21］.惊吓反应是强烈而迅速的，通常包括两个阶段。鱼的身体首先弯曲成一个典型的c形远离强烈的刺激在10毫秒。之后，身体呈现出一个小的反向曲线，然后快速游泳。从5 dpf到整个成年期的声音刺激都可以触发惊吓反应，其强度阈值和频率范围相似[22］.这些特征使我们能够利用惊吓反应作为一种行为工具来可靠地评估毛细胞损伤和相关的干预效果。与毛细胞计数方法相比，这种行为检测方法是非侵入性的，因此同一条鱼可以在不同的过程阶段被多次检测。该系统每次检测几十个鱼苗，可用于高通量药物或基因筛选试验。

与先前的惊响响应测量系统不同，为了提高精度，已经做出了显著的改进。使用该系统，我们成功地量化了斑马鱼(1)接触药物后立即的惊吓反应，(2)接触药物后一天的惊吓反应，(3)接触药物后三天的惊吓反应。侧线的毛细胞也在(1)和(3)阶段进行染色和计数，以验证损伤和再生。惊吓反应结果显示出了与毛细胞计数相似的趋势，但要少得多。结果表明，该系统能够促进斑马鱼的再生研究，提高和加快我们对毛细胞发育和再生途径及调控的认识。

2.材料和方法

2．1．动物

根据Kimmel等人描述的标准，在循环水产养殖系统中饲养和维护野生型TU鱼线[21]。斑马鱼幼虫在含有0.002%亚甲基蓝作为杀真菌剂的胚胎培养基中饲养。幼虫从5岁开始用干粮喂养（Zeigler Bros Inc.，PA，USA） dpf。

2．2.染色和成像

用新霉素诱导神经肥大毛细胞损伤。将其应用于7-dpf斑马鱼幼鱼培养液中，持续24小时。药物治疗结束后，8-dpf斑马鱼在8μM Yo-Pro-1染料（Y3603，分子探针，或，美国）在28.5°C下溶解于培养基中1小时。冲洗3次后，用0.01%三氯乙酸麻醉鱼，并用甲基纤维素固定在一个凹陷玻片中进行观察。使用13.5倍物镜，用体视显微镜（SMZ18，尼康）对侧干中染色的神经乳腺进行定量。对于共聚焦成像，用1.5%低熔点琼脂糖凝胶包埋fish。用徕卡共聚焦显微镜TCS SP8观察躯干区的侧线神经乳腺。

2．3.用于惊吓反应的仪器

研制了一套测量鱼幼体惊吓反应的仪器系统。系统原理图如图所示1(一)。这条鱼被放在一个有盖培养皿中，在一层薄薄的水里(2毫米)。这保证了每条鱼都在镜头的焦距范围内，而且放大率是相同的。盘子由一个导光板照明，提供均匀分布的照明，改进了以前的做法，从侧面光束照明[22]。这种照明提高了图像质量，从而提高了图像处理过程的准确性。将培养皿用透明胶粘在导光板上，并将导光板粘在一个微型振动器上，该振动器在电信号inpu的控制下产生频率和振幅不同的声振动t、 刺激振动通过导光板传导到培养皿上。板上还粘有基于MEMS的加速计。该加速计用于实时监测刺激。此外，在试验之前，使用激光多普勒测振仪测量各种刺激下的水面振动。该步骤证明因此，刺激参数在实际测量之前已经确定，刺激精度得到保证。

在显微镜框架上安装了数码摄像系统，从顶部监视培养皿和斑马鱼。在透光照射下，鱼幼虫的身体在每一帧图像中呈现为黑暗区域，利用MATLAB (MathWorks, MA, USA)开发的内部软件将鱼幼虫从背景中分割出来。利用分节的鱼体，可以定位鱼在培养皿中的位置。通过连接每一帧鱼幼虫的位置，可以从录制的视频中提取出每次实验中鱼幼虫的运动情况。根据[22时，幼体在短音突发刺激下的移动距离可作为其听觉惊吓反应的量度。数字1（b）显示刺激后的10条鱼幼虫的踪迹。鱼的平均距离可以从这条迹计算出来。一种可能更准确但不太敏感的测量方法是，在听到刺激后立即显示出c形运动的鱼幼虫的数量。c型运动是听觉惊吓反应所特有的，在受到刺激后持续时间不超过10毫秒[22].照相机的速度是500 fps，它可以捕捉盘子内每个鱼幼虫的快速C形运动。从视频的几个帧计算每次刺激后C形运动的鱼的数量。计算平均距离和C形弯曲运动的鱼的数量，并用于量化惊吓反应。在本报告中，我们仅显示了平均距离结果。图1（c）结果表明，三只幼鱼在一帧中表现出C形弯曲运动。

２.４.仪器系统验证

为了验证该仪器系统的有效性，对斑马鱼幼虫在不同强度的声音刺激下的惊吓反应进行了实验。为了测试惊吓反应与刺激水平之间的关系，在放大器上施加3个不同声级的400hz音脉冲来驱动振动器。视觉观察5只以上幼虫(不经药物治疗)有明显运动，选择刺激中等水平。高电平比中电平高约10db，低电平比中电平低约10db。对于每个刺激水平，重复10次以达到统计学意义。在每个刺激之间，用100秒的休息来避免适应，如[22].为了测试系统对耳毒性药物的敏感性，7-dpf斑马鱼幼虫用3种不同浓度的新霉素处理，浓度分别为0、0.16和1.6 μM、 24小时。更高浓度的8 μM新霉素致死亡率高;因此仅用于毛细胞存活和恢复的染色实验。以8 dpf的频率，在400hz的相同声级音脉冲刺激下，用该系统测量幼虫的惊吓反应。

2．5．斑马鱼幼体药物暴露的回收

利用早期引入的仪器系统，我们采用惊吓反应和传统的毛细胞计数技术来监测斑马鱼幼体听觉功能的恢复。在每次试验中，10只幼虫被放置在培养皿中。2个试验系统并行进行，每次试验共检测20只幼虫。刺激波形为160 ms的音调突发，起落时间为30 ms，如图所示2. 刺激频率为400次 刺激水平为39 mm/s作为水面的振动速度。由于浅水（~2℃），因此无法测量该刺激物的绝对声压级 嗯）。因此，使用激光多普勒干涉仪测量该声级下水面的振动，以确保一致性。

本研究使用了100条斑马鱼幼虫。在7 dpf时，将幼虫分为3组:对照组(0)和0.16组μM和1.6μM新霉素治疗。在添加药物之前，测试了20只幼虫的惊吓反应。幼虫在含新霉素的培养基中融合24小时，然后用干净的培养基冲洗3次。八点 dpf，冲洗后立即对每组20只幼虫进行惊吓反应测试。在9号和11号时再次进行相同的试验 dpf（24 小时和72 冲洗后4小时）以监测由于预期毛细胞再生导致的潜在恢复。

在惊吓反应试验的同时，通过观察和染色计数毛细胞证实了新霉素对毛细胞的损伤。和之前的测试一样，将幼虫分为三组，新霉素浓度分别为0、0.16和1.6μ药物治疗后8 dpf染色计数侧线毛细胞，观察损伤情况;72小时后11 dpf染色计数，观察再生情况。

3.结果

３．１．描述惊吓反应

我们量化了斑马鱼幼体在声音刺激下的移动距离对惊吓的反应。数字3(一个)在20 dB范围内，即10倍范围内，平均移动距离随着声级的升高而增加。数字3 (b)显示了对耳毒性药物浓度的惊吓反应。新霉素的浓度分别为0、0.16μ米,或1.6μM.声音刺激是400hz的音调爆发。

３.２．新霉素所致毛细胞损伤后神经肥大毛细胞的再生

以往的研究大多表明，新霉素暴露在侧线上以剂量依赖的方式消融毛细胞[10，16]在这项研究中，Yo-Pro-1被用来识别侧线后部神经乳腺的毛细胞。在24小时的新霉素治疗后，观察骨盆鳍背侧躯干区域的神经肥大，并计数毛细胞。图形4(一)说明高剂量的8μM新霉素导致大部分毛细胞脱落;Yo-Pro-1阳性残基是随机分散的，不像低剂量新霉素时观察到的簇状组织。与对照组相比，无论是0.16还是1.6，毛细胞数量都更少μM新霉素治疗（图4（b））.3天的恢复使毛细胞得以强劲再生(图)4（b）)，这与以往研究侧线毛细胞前体池维持的报告一致[23］.

３．３．同样程序的惊吓反应

在相同的实验条件下，我们还使用我们的内部仪器系统评估了惊吓反应。音调突发属性与前面描述的相同，音调频率为400hz。在药物治疗后24小时和72小时检查惊吓反应。对照组的平均移动距离作为每个检查点的参考。药物治疗组的反应与对照组的反应标准化，以消除不同天之间可能的惊吓反应差异。在8 dpf(图中0 h5.)，药物治疗组的反应明显小于对照组。经药物治疗后，24 h和72 h的惊吓反应相对于0 h的惊吓反应移动距离逐渐增加，功能恢复时间呈时滞性。

4.讨论

4．1.使用振动器的效果

在本研究中，使用一个微型振动筛作为驱动器，将声波振动传递到培养皿中，并对鱼苗产生声音刺激。虽然这不是直接产生声音，但却是传递声音刺激的有效方式。在空气中使用负载扬声器是不有效的，因为空气-水界面，95%的声能被反射回来。水生扬声器可以在水下使用，但在这种设置中不实用，因为水位只有皮氏培养皿内几毫米。微型振动筛以前用于[24在实验上是有效的。

4．2．鱼之间的干扰

在以前的一个系统中[24]，将鱼苗放在一个多孔培养皿中。这种设计使得在图像处理过程中更容易识别每一条鱼。但是，这种设置导致每一孔中的刺激声压级不均匀，导致数据收集不准确。在目前的设置中，所有鱼都放在同一个培养皿中。由于允许水位，声级均匀分布，因此对每条鱼的刺激是相同的。这种设置的一个问题是，在这种设置中，鱼苗可以感觉到彼此，而不会被单独的井壁隔离。理论上，一些鱼在看到其他鱼的快速运动后可能会移动。然而，我们怀疑视觉线索是否起作用在我们的设置中，鱼大部分距离较远（见图）1（c）)此外，如果C形弯曲运动是由其他鱼类的惊吓反应的视觉线索触发的，则该运动的潜伏期将延长，导致“惊吓反应”失同步然而，没有观察到这种不同步现象。在实验过程中，还可以通过使用红外照明进一步评估对动物间干扰的关注[25］.

4．3．基于惊吓反应的行为测试灵敏度

根据本研究的实验方案，测试灵敏度与图中的形态学毛细胞计数法具有可比性4.以及图中测试惊吓反应的行为方法5.. 这两种方法都能够检测到最低测试浓度（0.16）的耳毒性新霉素造成的损害 μM)。当新霉素浓度较高时，惊蛰刺激后，毛细胞损失延长，游泳距离进一步缩短。虽然行为测试产生了令人满意的结果，但我们相信，通过修改实验设计，测试的敏感性可能会进一步提高。例如，在一个惊吓反应测试系统中，预脉冲抑制显示灵敏度增加了约40 dB [26]，声压级需高于听力阈值60db，才能直接诱发惊吓反应。

5.结论

在这项研究中，我们开发了一种行为测试，通过测量斑马鱼幼体的惊吓反应来评估毛细胞的听觉功能。通过施加不同程度的刺激，结果表明，该系统可以识别10分贝的声级差。利用该系统，我们研究了斑马鱼幼体侧线神经母细胞的毛细胞损伤和再生。该系统的计算结果与传统的毛细胞计数方法具有相似的趋势。新霉素治疗后惊吓反应降低，毛细胞再生后恢复。这些结果证明了这种行为分析在评估斑马鱼幼体毛细胞功能方面的能力，以及它作为听觉相关基因和药物发现的高通量筛选工具的潜力。

相互竞争的利益

作者声明本论文的发表不存在利益冲突。

致谢

基金资助:国家自然科学基金资助项目(批准号:)。深圳市海外人才创新计划(批准号:81470701);批准号:KQCX20140522150857838);批准号:KQCX20140522150857838;W81XWH1410006)授予HL。

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