文摘

c-Jun n端激酶(物)是一个压力信号通路的一部分由NMDA-stimulation强烈激活,参与突触可塑性。许多研究都集中在突触后机制物行动,和更少的了解物突触前定位及其生理作用在这个网站。我们检查是否物存在突触前现场及其活动后突触前NMDA受体刺激。通过使用N-SIM结构化超分辨率显微镜以及生化方法,我们表明,突触前分数包含大量的物蛋白质和其活性形式。通过造型设计,我们发现物,通过JBD领域,充当T-SNARE蛋白质生理效应;然后利用生化方法我们演示了Syntaxin-1-JNK之间的交互,Syntaxin-2-JNK, Snap25-JNK。此外,采取的具体物抑制剂肽,D-JNKI1,我们网罗物行动定义复杂的形成。最后,电生理记录确认物的作用在突触前囊泡释放的调制。这些数据表明,JNK-dependent T-SNARE蛋白质的磷酸化在突触可塑性可能有重要的功能作用。

1。介绍

北半球c-Jun2终端蛋白激酶(物)的增殖蛋白激酶(MAPK)家庭1,2)在哺乳动物的代表,是三个基因编码三个亚型:JNK1 JNK2, JNK3。JNK1和JNK2表达本质上是无处不在的,而JNK3存在仅限于脑和睾丸3]。物激活是由几种类型的细胞外应力刺激,如热休克、紫外线照射,炎性细胞因子, oligomers-induced毒性,会引起,主要是导致细胞死亡。

物磷酸化众多重要的底物,包括转录因子AP-1, c-Jun和安全系数,从而导致激活核响应(3- - - - - -5]。此外,物调节胞内信号通路磷酸化的许多胞质和细胞膜的目标。许多数据指出,物激活大脑中比在其他哺乳动物组织(6- - - - - -8),这表明激酶可能发挥重要作用在中枢神经系统(CNS),调节大脑生理和病理过程。

物激活,引起神经元死亡在各种病理条件下,如NMDA-induced会,缺血性中风(9- - - - - -11),和创伤性脑损伤12];物激活一直也关联到许多神经退行性疾病如阿尔茨海默(13- - - - - -18],亨廷顿氏[19),和帕金森病(20.,21),而且精神障碍和智障涉及突触结构异常(22]。另一方面,物也扮演一个重要的角色在调节生理过程如神经前体迁移,轴突的萌芽和极化,树突分支伸长,树突棘的稳定,因此成人大脑神经元可塑性和再生。

所有这些证据指出物通路在中枢神经系统非常复杂,因为它不仅受到不同类型的刺激,调节物的反应,但它也取决于其定位,扮演不同的角色在各种物池不同的功能细胞区。因为神经元异常分化的细胞,它是合理的物活化,可能有不同的角色和功能在不同亚细胞的本地化,从核胞质隔间以及轴突、树突,树突棘。这种影响不仅是由于划分,但也由于巨大的各种物的目标。物选择性的目标,例如c-Jun本地化在细胞核和调节基因表达,而微管相关蛋白(地图)是在细胞质中23- - - - - -26)和控制轴突伸长和树突分支(22]。最近,物也被突触处(27- - - - - -29日];然而它的角色在该地区,以及尚未完全清晰的激活水平。

不同的作品表明,物是优先位于突触后区域,它与关键突触脚手架蛋白(psd - 95和psd - 93)以及GluR2 AMPAR亚基(GluR2L) [30.]。我们证明,物有一个重要的作用在调节谷氨酸受体表达后突触后密度水平 全身毒性在海马神经元17,31日]。此外,许多证据表明NMDA受体的重要性(NMDARs)物催化剂在突触后车厢9,32),这表明物可能有至关重要的作用在突触可塑性以及会引起。NMDA-induced会事实上,主要是通过介导的突触后NMDARs,有力地激活物,物特定抑制防止NMDAR-mediated皮质神经元(神经死亡9,10,25)以及在organotypic海马切片文化(9]。然而,所知甚少的生物作用突触前NMDARs (pre-NMDARs)及其下游通路。pre-NMDARs已经广泛的特点在过去年新在开发过程中关键球员和记忆的巩固阶段。主要参与突触强度调制,通过机制从自发的神经递质释放便利LTP /有限公司[33- - - - - -39]。pre-NMDARs大量表达在发育中的神经系统(40- - - - - -42]虽然在成人表达减少,坚持只在大多数塑料脑区(如大脑皮层、小脑、海马)(43]。重要的是,他们的异常激活也相关病理事件(44,45]。虽然物存在于突触后室的特点,缺乏数据的存在和生理作用在突触前的网站。在这里,我们调查在突触前室物定位和作用。物识别在突触前现场及其NMDARs刺激后激活可能是重要的不仅澄清这个问题,而且对新目标的识别导致突触可塑性。此外,物下游通路的定义可以代表一个新的治疗工具,以防止突触功能障碍在神经退行性疾病。

2。材料和方法

2.1。纯化突触体提取

提取纯化从小鼠皮层突触体如Dunkley [38]。轻轻短暂,组织匀浆glass-Teflon磨床在圣缓冲区(蔗糖320毫米,三10毫米;pH值7.4)补充蛋白酶和磷酸酶抑制剂。匀浆离心机(1.000 5分钟4°C)和上层清液再次收集和离心机(13.000 rpm, 20分钟,4°C)。颗粒在圣resuspended缓冲和分层20 - 10 - 6 - 2% Percoll(通用电气医疗集团)梯度在圣缓冲区,在离心器管。样本然后离心器,33500年8分钟 4°C和10%和20%之间的接口层,包含纯化突触体,是向往。10.000纯化突触体然后沉淀20分钟 6:1 4°C /卷卷消息灵通的缓冲区(氯化钠140毫米,氯化钾3毫米,MgSO41.2毫米,CaCl21.2毫米,不2阿宝41毫米,NaHCO33.5毫米,葡萄糖10毫米,消息灵通的5毫米;pH值7.4σ)。颗粒细胞溶解或resuspended适当的缓冲。

2.2。原油突触体提取

原油突触体被用于钙电流的评估。她大脑匀浆glass-Teflon磨床的缓冲区(玫瑰4毫米pH值7.3,蔗糖320毫米,EGTA 1毫米,σ)蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂。后第一次离心机(10.000 10分钟4°C),上层清液再次收集和离心机(12.500 ,20分钟4°C)。颗粒在她resuspended缓冲区和第三离心机(12.500 20分钟4°C)为了获得原油synaptosomal分数小球,在KRH resuspended缓冲区(氯化钠125毫米,氯化钾5毫米,MgSO41.2毫米,KH2阿宝41.2毫米,消息灵通的氢氧化钠pH值7.4 25毫米,葡萄糖6毫米,CaCl22毫米,σ)和保持在37°C公司5%245分钟,功能重新激活。原油激活突触体然后resuspended 1 mg - 500的最终浓度μ在KRH g / ml。再悬浮后,突触体被保持在37°C公司5%225分钟为一个习惯化的步骤。

2.3。钙电流评价

原油突触体钙电流测量。短暂,活化步骤后,突触体是颗粒状如之前所述,resuspended在300年μl 1: 1混合使用KRH和钙敏感cell-permeating荧光团Fluo-4 (Fluo-4直接™钙测定,生活技术)。样品被放置在整个黑色96 -(康宁合演®96 -黑色聚苯乙烯板)25分钟37°C公司5%2允许Fluo-4渗透细胞膜。习惯化后荧光测量与Tecan F500分光光度计180周期(对应于大约7分钟)37°C。门冬氨酸(100μ与甘氨酸coagonist M, 1μ米决赛)或氯化钾浓度注入100(50毫米最终浓度)μl /秒周期20(45秒)。荧光是由一个最高记录阅读优化模式Z-安置。

2.4。突触体刺激

25分钟前刺激D-JNKI1肽(Xigen)添加到媒介的最终浓度2μ门冬氨酸100 m .突触体治疗μM (Abcam)与甘氨酸coagonist 1μM(σ)或氯化钾50毫米(σ)2′,5′,7′,或者10′37°C公司5%2。为门冬氨酸刺激MgSO4从缓冲区中被省略了。结束的时候刺激突触体resuspended裂解缓冲。免疫印迹分析波尼裂解缓冲使用(25)而对于陷阱网罗缓冲区使用复杂的评价(37]。

2.5。免疫沉淀反应

免疫沉淀反应进行了纯化皮质突触体如前所述[39]。免疫沉淀反应的抗体,用于1:100年,被anti-JNK(# 06 - 748,北部),anti-Syntaxin-1 (# A1238,分析生物技术),anti-Syntaxin-2(# 110 022年,突触系统),和anti-Snap25 (# 331, Chemicon)。在降水过程0.5 - 1 g蛋白sds - page。

2.6。sds - page

20 克脑匀浆,TIF (Triton-Insoluble分数),提取的(40原油/纯化synaptosomal蛋白质,是由SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(Bio-Rad) (ProtoGel、国家诊断)。对于网罗复杂的检测,样品(称为未煮开的)保持在RT在装货前7分钟。抗体是anti-p-JNK and-JNK(# 9251和# 9252细胞信号,1:1000),anti-Syntaxin-1 (# 78539, Abcam) anti-Syntaxin-2 (# S0664σ1:5000),Snap25 (Stressgen, 1: 5000), anti-Syntaxin-1 (Abcam, 1: 5000), anti-Vamp(# 104 211年,突触系统),anti-Synaptophysin (# S5768,σ),anti-PSD95(# 10011435,开曼群岛的化学物质,1:1000),和anti-Actin(1501,微孔,1:5000)。墨迹是使用ECL化学发光系统(ECL免疫印迹基质,Promega)和量化微使用ImageJ软件。

2.7。免疫荧光

后提取、纯化突触体处理如Sokolow [41]。主要抗体使用anti-Synaptophysin 1: 500 (# S5768,σ)和anti-p-JNK 1: 100 (# 6254, Santa Cruz)当fluoresceinated二级抗体Alexa萤石488 anti-Mouse和Alexa萤石594 anti-Rabbit抗体。获得的图像超分辨率显微镜(N-SIM, Nikon-Structured照明显微镜)。分析了蛋白质colocalization使用皮尔逊的colocalization系数与伊万里瓷器软件。

2.8。急性切片制备

实验进行水平切片准备从cd -老鼠的躯体感觉皮质性,2-3-month-old。每只动物与异氟烷麻醉,USP(雅培,伊利诺斯州,美国),和斩首。整个大脑细胞外摘除和快速浸在冰冷的生理盐水(毫米):包含Tris-Hcl 72,不Tris-Base 18日2阿宝41.2,NaHCO330,氯化钾2.5,葡萄糖25日MgSO玫瑰20日410,Na-PIR 3、抗坏血酸5、CaCl20.5,蔗糖,pH值7.4。水平的躯体感觉片(200µ米厚度)获得使用vibratome (Vibroslice 752年,登仪器、拉夫堡、英国)。片被安置在一个解决方案包含(毫米):125氯化钠,氯化钾的2.5,2 CaCl21 MgCl21.25不2阿宝426 NaHCO 20葡萄糖,pH值维持在7.4 25/30分钟32°C,然后保持在室温下。

2.9。电生理学

后的恢复期至少1 h,单个片被转移到与细胞外记录灌注室,不断解决方案在室温下(22/25°C)。全细胞电压钳记录是由皮质神经元使用EPC-8膜片钳放大器(HEKA Elektronik Lambrecht /法尔兹,德国)。硼硅玻璃的吸量管,小费2.0和3 MΩ之间的电阻,用于膜片箝记录(42]。细胞内的解决方案有以下组成(毫米):117年K-gluconate MgCl氯化钾13日2 6小时20 2,CaCl玫瑰10日21、EGTA 11 Na2ATP 2, Na3三磷酸鸟苷0.5,pH值7.3。电压钳记录被接受只有不到10 MΩ串联电阻。数据过滤3千赫和数字化10 kHz使用滤波器和放大器的模拟/数字转换器。数字化数据是存储在计算机磁盘使用脉冲软件(HEKA Elektronik)。

2.10。统计分析

至少为每个实验已经进行了三次独立的复制。统计分析是使用图垫棱镜6程序完成的。使用学生的数据进行分析t以及一个或双向方差分析,其次是Dunnet /图基的事后测试。所有数据都显示为均值±SEM与统计学意义在 。

2.11。计算分析

Syntaxin-1之间的两两对齐(Uniprot ID Q16623)和Syntaxin-2 (Uniprot ID P32856)进行使用针软件可用在欧洲分子生物学开放软件套装(浮雕)(PMID: 10827456)。

对接的Syntaxin-1结构模拟与JNK1提取Syntaxin-1-Munc18A复杂(10.1038 / emboj.2008.37)。JNK1包裹着一个小肽的结构似属于吉格脚手架蛋白(43)被选为对接模拟。Snap25结构提取从20年代supercomplex44)在相同的JNK1结构选择与Syntaxin-1对接也使用。对接仿真执行使用黑线鳕2.2 (45)程序,是一种最合适的软件正确预测蛋白质复合物。使用软件的图像取得了加州大学旧金山分校嵌合体v.1.10.1。

3所示。结果

3.1。物位于突触前室

调查物定位在突触前室,我们使用N-SIM结构化超分辨率显微术在孤立的皮质突触体(图1(一))。突触体双染色Synaptophysin,本构和特定的突触前蛋白(红色标记)和物活性形式p-JNK(用绿色标注,图1(一))。如图1(一)(合并面板),物活性形式p-JNK位于突触前室和Synaptophysin与。这个证据也证实了皮尔森系数的值,对应0.54±0.08。

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图1
物在突触前室本地化。(一)免疫荧光小鼠皮层纯化突触体染色为p-JNK(绿色)和Syntaxin-2(红色)colocalization可视化为黄色信号合并图像,与皮尔森系数0.54±0.08。获得图像超分辨率显微镜;比例尺1μm。(b)免疫印迹分析物和p-JNK在20活性形式存在μ克总皮质溶解产物,突触后密度区域(由PSD95突触后特定蛋白质TIF分数)和突触前室(由Synaptophysin突触前特定蛋白纯化突触体)。物是本地化在突触后和突触前地区及其磷酸化状态具有可比性。肌动蛋白作为加载控制。

物突触前定位进一步调查比较突触前和突触后分数和总脑匀浆。物和激活表单p-JNK被西方墨点法评估总皮质匀浆,皮质synaptosomal溶解产物(突触前室),和TIF分馏(突触后室;图1 (b))。P-JNK激活形式,以及物总形式,突触前室(图中检测到1 (b)(图)确认超分辨率显微镜数据1(一))。气管无名动脉瘘管的突触后分馏,被PSD95脚手架蛋白物出现。证实了突触体的纯度低存在突触前psd - 95的分数,所述的埃文斯(46)是负责非功能性PSD的结构绑定到活跃的区域。气管无名动脉瘘管的另外一部分由低纯度证明存在Synaptophysin突触后分数。

3.2。物迅速激活后Pre-NMDARs刺激在年轻和成年老鼠

调查pre-NMDAR-mediated物激活,我们评估p-JNK /物比西方墨点法在皮质突触体纯化后从年轻的成年老鼠(好)和2′,5′,10′与NMDA(100分钟的治疗 和甘氨酸(1米) 米)。

在年轻的老鼠突触体(图2(一)),物明显激活NMDA 2分钟后刺激(激活增加75%, )和持续5分钟后(70%活化增加, ;图2(a))。没有显著改变突触前水平的蛋白质免疫印迹检测(数字2(b) -2(e)),这表明,在考虑跨度为(2′,5′,10′分钟),物激活不确定激活的蛋白质降解过程。


图2
物被激活后pre-NMDARs刺激年轻老鼠和成人。(安妮)免疫印迹和相对量化的物激活(a),测量p-JNK /物比率,与门冬氨酸100好老鼠原油突触体刺激μM和甘氨酸1 米2、5、10分钟。物激活显著增加治疗后2分钟( )和持续5分钟( )。蛋白质免疫印迹和相对量化的突触前Syntaxin-1 (b), Syntaxin-2 (c), Snap25 (d),和鞋面(e)提取原油突触体刺激NMDA 100好老鼠μM和甘氨酸1μ米2、5、10分钟。蛋白质含量在考虑跨度为治疗后维持不变。肌动蛋白作为加载控制(20μg蛋白加载; )。单向方差分析,Dunnet的因果检验。数据显示,意味着±S.E.M. (f)钙电流,测量与明智的钙荧光团Fluo4,于100年原油突触体门冬氨酸处理μM和甘氨酸1 M或氯化钾50毫米。荧光光谱光度测量的方法记录7分钟,门冬氨酸+ g或注射氯化钾在45秒。注射后都有一个显著增加钙含量从45秒后刺激(每个实验小组 )。单向方差分析,Dunnet的事后测试。数据显示为均值±S.E.M. (g-k)免疫印迹物激活(g)和相对量化指标,衡量p-JNK /物比成年老鼠原油突触体刺激与NMDA 100μM和甘氨酸1μ米2、5、10分钟。物激活增加治疗后2分钟( )和持续5分钟( 在10分钟)和( )。蛋白质免疫印迹和相对量化的突触前Syntaxin-1 (h), Syntaxin-2(我),Snap25 (j),和鞋面(k)从成年老鼠提取原油突触体刺激与NMDA 100 M和甘氨酸1 米2、5、10分钟。蛋白质含量三个跨度为治疗后保持不变。肌动蛋白作为加载控制(20 g蛋白加载; )。单向方差分析,Dunnet的事后测试。数据显示为均值±S.E.M.

如前所述,pre-NMDARs表达减少神经发育期间(43):验证如果pre-NMDAR-mediated物激活在成年老鼠守恒,突触体提取从老老鼠。测试如果残余pre-NMDARs表达式就足以引发去极化,在突触体钙电流测量通过pre-ncubation Fluo4 cell-permeant钙敏感的染料。突触体与NMDA(100刺激 和甘氨酸(1米) 米)或氯化钾50毫米积极控制(图2(f))。与分光光度计记录的钙流入了7分钟,对应180 fluorescence-reading循环,刺激注入在45秒(周期20日图2(f)黑色箭头)。这个时间点被选择作为妥协,避免异常的荧光测量由于体内平衡缺乏有限公司造成的损失2分光光度计室和湿度控制。如预期注射氯化钾导致快速和显著增加intrasynaptosomal钙水平的持续时间。同样,NMDA政府导致了相当显著增加荧光如果控制注入车辆相比,45秒开始注射后(20周期),随着时间的推移保持稳定。车辆意外我们观察到荧光下降水平注入突触体(CTR);然而,与以前的数据,门冬氨酸+ g刺激导致快速物激活2分钟(增加50% 在5分钟),增加(增加60%, ),持续10分钟(增加50%, ;图2(g))。这些数据表明,在成年生活pre-NMDAR-JNK轴是守恒的。事实上,pre-NMDARs保留引发兴奋性反应的能力。门冬氨酸(100的刺激 和甘氨酸(1米) 米)诱导物激活在年轻的(好)和成人突触体,和随之而来的p-JNK /物比例相当。至于年轻的突触体,也在这种情况下,没有明显的蛋白质降解事件观察:没有显著改变突触前蛋白质水平(Syntaxin-1和Syntaxin-2 Snap25,和鞋面)在考虑跨度为(2′5′和10′)被发现(图2(h) -2(k))。

3.3。物的调查可能的目标

来获得更多的洞察物调制的囊泡释放,物绑定域(JBD)搜索在突触前机械蛋白质的胺基酸序列。近年来,jbd的广泛的描述在几个物基质(5)允许识别JNK-substrate规范化氨基酸模式的交互。这个规范模式由两个带正电和两个疏水残基隔开两个间隔区域具有不同长度:(KR) - x(0,2)——(KR) - x(0,4)-(李)- x[李][47]。关键步骤中神经递质释放我们决定考虑泡对接和启动步骤,因为此前公布数据显示,特定抑制物是不相关的任何修改后钙流入NMDAR刺激(25]。因此不太可能物可以作用于突触前室调节这一过程。报道在图3(一个),有两种可能的jbd在Syntaxin-2 Syntaxin-1和三个,分别。三分之二的可能jbd Syntaxin-1和Syntaxin-2(图之间是守恒的3(一个))。特别是,JBD中残留148 - 155两个亚型(图之间的完全是守恒的3(一个))使这个地区一个很好的候选人参与与物的交互。分析Snap25的序列,一个独特的假定的JBD被发现(图3 (b))。假定的jbd的存在模式在三个突触前机械蛋白质强烈信号与物可能的物理相互作用的蛋白质。

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图3
JBD是陷阱与物互动的关键。(一)序列比对Syntaxin-1和Syntaxin-2之间。jbd被用红色下划线。(b)序列的Snap25 JBD用红色下划线。上面板(a)和(b)规范化JBD模式也报道。(c)最好JNK-Syntaxin复杂造成对接预测。物所示浅蓝色和突触融合蛋白。残基的侧链属于JBD红色所示。(d)最好的复杂JNK-Snap25对接的结果。也在这种情况下物被描述在浅蓝色Snap25浅棕色所示。 The lateral chains of the residues of the JBD in Snap25 are reported in red.
3.4。物与陷阱的蛋白质

jbd序列的存在三个成员(Syntaxin-1、Syntaxin-2 Snap25) SNARE蛋白家族的允许我们预测可能的三维(3 d)组织JNK-SNARE蛋白复合物使用计算方法,蛋白质对接(数据3 (c)- - - - - -3 (d))。JBD序列,完全守恒两种亚型的突触融合蛋白(残留148 - 155)被映射的结构Syntaxin-1 [48),我们选择作为Syntaxin-2也代表结构,因为它们共享一个序列的身份64.4%和80%的序列相似(图3 (c))。独特的JBD序列位于Snap25残留30到35之间也映射在三维结构(图3 (d))。

JBD出现在网罗蛋白质和似JNK1联系的地区吉格肽被用来驱动对接仿真执行与黑线鳕2.2软件(49]。最好的Syntaxin-1-JNK和Snap25-JNK复合物是在数据报告3 (c)和3 (d)属于jbd强调的残留。复合物都有利的黑线鳕分数不同的能量贡献之和(即条件。、静电能量,范德瓦耳斯能源、反溶剂能量,限制违反能量)。详细,最好Syntaxin-1-JNK复杂报告黑线鳕−24.9的分数 6.2虽然Snap25-JNK1报告一个黑线鳕−115.3的分数 0.8,强调第二个复杂地层会更加青睐。在这两种复合物jbd参与致密的疏水性和静电相互作用网络物对复合物的稳定性是至关重要的。

为了证明这些交互,网罗蛋白质与西方墨点法进行评估,Syntaxin-1免疫沉淀反应后,Syntaxin-2, Snap25纯化皮质synaptosomal溶解产物。物被发现在共沉淀;尤其是物蛋白质乐队更可检测Syntaxin-2和Syntaxin-1程度可见Snap25(数字4(一),4 (b),4 (c))。确认与Syntaxin-1物之间的相互作用,Syntaxin-2, Snap25,逆转免疫沉淀反应在纯化皮质synaptosomal溶解产物。此前数据显示发现大多Syntaxin-2和Syntaxin-1起源于物的共沉淀(图4 (d))。然而,一个精确的量化是不可能由于不同的抗体使用的效率。

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图4
物优先与Syntaxin-1、Syntaxin-2 Snap25。(a - c)免疫印迹免疫沉淀反应后Syntaxin-1 (a), Syntaxin-2 (b),和Snap25 (c)纯化突触体溶解产物从成年小鼠皮层。物中检测到Syntaxin-1和Syntaxin-2沉淀,而免疫反应性的信号弱Snap25沉淀。(d) Syntaxin-1和Syntaxin-2 Snap25,被检测物沉淀。500年 克总溶解产物已经受到免疫沉淀反应,而20 g是加载控制。 。
3.5。网罗JNK2和JNK3蛋白质相互作用

调查如果特定物同种型与SNARE蛋白参与了互动复杂,单一物同种型降水进行皮质synaptosomal溶解产物。沉淀后JNK3 [7,50),一个同种型NMDA刺激更加敏感,JNK2,一个同种型被认为是重要的神经可塑性,网罗蛋白表达是由西方墨点法评估共沉淀。存在Syntaxin-2和Snap25跟踪JNK2共沉淀(图5左面板);同样的陷阱都是出现在JNK3共沉淀(图5右面板)。这些结果表明,两种物亚型,JNK3 JNK2,与突触融合蛋白和Snap25交互,没有优惠与一个特定的同种型。


图5
JNK2和JNK3 Syntaxin-2和Snap25交互。免疫印迹免疫沉淀反应后JNK2(左)和JNK3(右)在纯化突触体溶解产物从成年小鼠皮层。Syntaxin-2和Snap25检测在JNK2和JNK3沉淀。500年 克总溶解产物已经受到免疫沉淀反应,而20 g是加载控制(每个实验小组 )。
3.6。物抑制的频率而不是振幅降低mEPSCs皮质切片

确定物引起的突触修改的网站,小兴奋性突触后电流(mEPSCs)检查物抑制剂的存在,D-JNKI1。微型突触事件是由于自发释放谷氨酸囊泡,进而激活谷氨酸突触后受体。根据量子假说,振幅的变化mEPSCs反映突触后反应的变化,而突触前机制导致没有变化的振幅mEPSCs但可能导致的频率变化mEPSCs记录在突触后细胞(51,52]。因此,mEPSCs被记录在皮质切片,进行预处理与D-JNKI1 1小时(2µ米),在TTX (1µ米),以防止动作电位射击,荷包牡丹碱(20µ米)阻断gaba ergic电流。如图6(一)(样本mEPSCs的痕迹)和数字6 (b)- - - - - -6 (c)mEPSCs频率和振幅(量化),D-JNKI1诱导显著减少的频率mEPSCs如果比控制条件( , ),但没有显著影响mEPSCs振幅。这些结果支持假设物可以presynaptically调节发射器释放。

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图6
D-JNKI1治疗减少老鼠mEPSCs皮质片的频率。(一)代表的痕迹mEPSCs记录从皮质切片在控制条件下或与D-JNKI1n孵化后1小时。(c)条形图(意味着±SEM)显示mEPSC振幅频率(b)和(c)获得的第一个5分钟的录音控制( )和D-JNKI1-treated ( )大脑皮层神经元。CTR与D-JNKI1治疗: 学生的学习任务,n = 8。数据显示为意味着+ /−SEM。
3.7。物抑制减少网罗复杂NMDA刺激后形成

有了物与Syntaxin-1 / Syntaxin-2以及Snap25具体的抑制物,D-JNKI1,减少在体外自发释放片准备。我们这里学习D-JNKI1 JNK-SNARE复杂地层的影响在控制条件和门冬氨酸刺激。网罗复合物(突触融合蛋白+ Snap25 +鞋面)是可以可视化耐洗涤剂结构和免疫印迹在未煮开的样品53]。Anti-Syntaxin-1抗体被用来可视化网罗复杂约75 - 100 KDa和用于光密度量化。更高的MW信号,由于更加结构化的复合物,富含其他release-machinery因素,也被发现。突触体D-JNKI1处理(2 米)25分钟。抑制物并不影响网罗复杂装配控制条件。当突触体被NMDA(100刺激 M门冬氨酸+ 1μ甘氨酸),复杂的形成有显著增加50% ( )治疗7分钟后,由于增加了囊泡释放引发的pre-NMDARs激活(图7(一))。当突触体首先使用D-JNKI1 (2 米)25分钟,然后刺激NMDA,网罗复杂装配显著预防( )和复杂的水平恢复nonstimulated控制水平(见图7(一))。这些结果表明,物抑制防止圈套蛋白质络合,根据电生理数据。最后,网罗复杂蛋白质的水平进行评估在煮样本的条件下,控制突触体有无D-JNKI1以及突触体由NMDA有无D-JNKI1刺激。没有观察到在这些条件下蛋白质含量的变化(数据7 (b)- - - - - -7 (d))。但是我们不能发现任何减少并且Syntaxin-1在未煮开的门冬氨酸处理样品,即使显著减少可能是预期由于网罗Syntaxin-1组装复杂。这可能是由于巨大的浓缩的Syntaxin-1 synaptosomal分数,在蛋白水平的改变不能被西方墨点法最终评估。

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图7
物抑制减少网罗复杂的形成。(一)西方墨点法和相对量化网罗复杂的水平(anti-Syntaxin-1免疫反应性的乐队从大约75到100 KDa)在20 门冬氨酸100 g的原油突触体刺激 m和甘氨酸1 米7分钟D-JNKI1(2的存在与否 米),添加到突触体刺激前25分钟。门冬氨酸/ g之后暴露在网罗复合物形成有显著增加( ),这是完全预防D-JNKI1 preadministration ( )。网罗复合物规范化的肌动蛋白, 。数据显示为±SEM,双向方差分析,图基的事后测试。(罪犯)免疫印迹和相对量化Syntaxin-1, Syntaxin-2, Snap25 20 门冬氨酸100 g的原油突触体刺激 m和甘氨酸1 米7分钟D-JNKI1(2的存在与否 米),添加到突触体刺激前25分钟。门冬氨酸后没有明显变化的蛋白质水平/ g暴露后以及D-JNKI1政府单独或结合门冬氨酸/ g。蛋白质是规范化的肌动蛋白, 。双向方差分析,图基的事后测试。数据显示为±SEM。

4所示。讨论

物激酶扮演着一个重要的角色在中枢神经系统调节几个函数和突触可塑性的过程(54,55]。特别是,一个特定物池在突触后网站能够调节突触强度调节谷氨酸NMDA和AMPA受体定位在突触后密度地区(PSD)。这个功能部分是由于物与PSD脚手架蛋白PSD95 [56),也由其直接与NR2A / B (57,58]。重要的是,在病理条件下,如阿尔茨海默病(AD) synaptopathy物诱发大量的谷氨酸受体(NMDA和AMPA)从PSD地区,导致LTP障碍,增加(18,31日),和树突棘损失(17,31日]。物的作用的规定glutamatergic突触功能障碍和dysmorphogenesis是有趣的和不完全成立。物突触后功能是有目共睹。事实上,物后迅速激活谷氨酸受体刺激(59],此外中扮演着重要角色在NMDA-induced neuronal-death(会引起;参见[10,60,61年])。尽管大量的数据支持物功能门冬氨酸激活后,现在没有被物参与突触前NMDARs (pre-NMDARs)下游通路。pre-NMDARs存在在突触前网站更多的塑料在成人大脑区域,如皮质和海马体(62年),他们控制神经递质释放63年,64年]。物的激活信号门冬氨酸刺激后,突触前尚未证明,只有很少有研究提出了一个突触前作用物(65年]。许多研究文献表明,突触体准备是一个有效的工具价值突触前室及相关受体,如前所述。通过研究pre-NMDARs刺激突触体,我们首次展示物激活突触前的网站。由于微观和生化方法,事实上,我们发现物及其活性形式,p-JNK,皮质突触前终端。特别是在突触前的水平网站似乎与突触后的网站,以前描述的([17),见图1和2)。我们证明和检查pre-NMDA后物激活受体刺激直接pre-synaptic网站(突触体)在两个年轻人和成年人皮质制剂。有趣的是,物激活率比较年轻和成人准备,表明pre-NMDARs刺激诱导物激活突触前的网站在两个年龄段。此外,这个过程是守恒的神经发育后虽然pre-NMDARs表达普遍降低,坚持只在皮层和海马在成人(62年]。没有观察到突触前蛋白水平的改变突触体,表明物没有参与蛋白质降解,像发生在突触后室(17,18,30.]。

文献证据表明,突触前激酶调节神经递质释放,主要影响三个步骤:存储泡动员(66年由于钙流入),轴突结束去极化(67年),突触前囊泡融合(68年]。在这种背景下物的作用在调节突触前任务了解甚少,只有一些数据报告泡动员作为一个重要的步骤在自发释放69年),而物抑制已经被证明不改变细胞内钙水平(25)表明它不太可能,NMDA受体激酶可以调节钙通道或渗透率。因此感谢我们的造型设计发现,我们检查是否物作为网罗复杂的生理效应形成调节囊泡释放。生化数据证实了预测的计算分析,表明与Syntaxin-1物之间的相互作用,Syntaxin-2, Snap25以及陷阱复杂的形成。我们证明Syntaxin-1 Syntaxin-2份额约64%的序列的身份和只有一个JBD图案完全守恒在两种亚型,而我们发现只有一个完整的JBD主题Snap25序列。一旦我们得到了这些序列比对的数据,我们能够映射JBD Syntaxin-1 / Syntaxin-2和Snap25三维(3 d)结构为了执行交会对接仿真。对接模拟的结果可以显示的构象Syntaxin-1 / Syntaxin-2-JNK和Snap25-JNK复合物。然而,电生理和生化实验证明对接的理论假设。

来获得更多的洞察物突触前函数,我们检查的影响具体物抑制剂D-JNKI1 mEPSCs从皮质片记录。频率,通过防止物行动的振幅,但不是mEPSCs强烈降低(50%)从而确认调制的突触前释放物的可能性。这些结果结合物的生化研究表明互动Syntaxin-1 Syntaxin-2以及Snap25在突触前水平可以代表一个重要的调节囊泡释放的机制。

物是否绑定Snap25直接或由突触融合蛋白很难建立以来有很多T-SNARE蛋白质相互作用形成复杂的,包括突触融合蛋白和Snap25,在休息的情况下,部分聚集在影射结构(70年- - - - - -72年]。由于这个原因,我们评估NMDA-mediated网罗复杂装配特定D-JNKI1抑制剂的存在。正如所料,物抑制减少网罗络合,表示物的调制器泡docking-priming,可能通过突触融合蛋白/ Snap25直接交互和磷酸化。这样的效果可能会导致一个很好的监管物神经递质释放的信号通路。

然后我们试图澄清这物亚型更容易与Syntaxin-1 / Syntaxin-2和Snap25。大脑特定JNK3同种型,具相关NMDARs激活(7,50),是最有趣的形式,但不幸的是物之间的抗体不能区分好亚型。免疫沉淀反应试验表明功能重叠的两个亚型,JNK2 JNK3。还需要进一步的研究来阐明这个问题。这些发现一起揭开新的和重要作用物的突触前的网站。

5。结论

物的stress-signalling通路是表示作为一个关键的球员在发育和神经退行性疾病。其含义会和突触功能障碍/ dysmorphogenesis明确其重要性。物代表了对神经退行性的治疗目标的过程,但大部分信息缺失操纵其行动以减少不必要的副作用。在这个工作我们首次证明物导致神经递质释放便利化,由于与SNARE蛋白直接交互。因此物控制突触可塑性的一个重要的新角色出现从这项研究中,添加另一个故事的一部分,以更好地阐明物在突触调制函数。

相互竞争的利益

没有实际或潜在的利益冲突。

作者的贡献

西尔维亚Biggi和露西亚Buccarello做出同等的贡献。

确认

本研究由玛丽·居里Industry-Academia伙伴关系和通路(IAPP) CPADS(细胞渗透肽作为药物输送系统)和ADDF(阿尔茨海默氏症的药物发现基金会)美国资助。