腺病毒载体靶向哺乳动物内耳的几种细胞亚型体内

抽象的

哺乳动物内部耳朵Harbors不同的细胞类型对于听力和平衡至关重要。腺病毒是将基因递送到内耳的主要载体之一，用于功能性研究和毛细胞再生。为了鉴定靶耳中特异性细胞亚型的腺病毒载体，我们研究了三种腺病毒载体，携带编码绿色荧光蛋白的报告基因（GFP）来自两个供应商或具有基因组编辑基因Cre重组酶(Cre)在出生后第0天（P0）和第4天（P4）小鼠耳蜗中通过scala媒介注射，通过耳蜗造口术在活的有机体内．我们发现三种腺病毒载体转导的小鼠内耳细胞具有不同的特异性和表达水平，这取决于腺病毒载体的类型和小鼠的年龄。最常见的靶点是耳蜗感觉上皮，包括听觉毛细胞和支持细胞。腺病毒与GFP.转导的提出的Utricular支持细胞。本研究表明，腺病毒载体能够有效，特别是在哺乳动物内耳中转换不同细胞类型，并提供有用的工具来研究内耳基因功能，并评估基因治疗以治疗听力损失和前庭功能障碍。

1.介绍

不可逆的毛细胞丢失是导致永久性感音神经性听力丧失的主要原因，目前尚无有效的治疗方法。数百种致病基因变异导致多种形式的遗传性听力损失。毛细胞再生和基因传递策略的发展已成为寻找恢复听力的潜在治疗方法的主要焦点[1- - - - - -3.]。

包括鸟类和鱼类在内的低等脊椎动物在毛细胞丢失后，可以通过两种机制在一生中再生毛细胞。第一，内耳支持细胞和剩余毛细胞可能重新进入细胞周期并分化为新的毛细胞。第二，位于丢失毛细胞下的周围细胞也可能在体内直接转分化新的毛细胞[4- - - - - -6]。然而，哺乳动物的内耳已经失去了自发再生毛细胞的能力。哺乳动物毛细胞再生以恢复听力的一种策略是诱导周围细胞特别是支持细胞直接转分化为毛细胞。另一种方法是诱导剩余毛细胞或支持细胞重新进入细胞周期，支持细胞进一步分化为毛细胞[1，7]。任何一种方法都需要有效地向哺乳动物内耳细胞诱导这些过程所需的基因。

内耳对于靶向基因治疗来说是一个特别有吸引力的器官，因为载体可以被局部传送到封闭的结构中，这大大减少了全身的副作用。通过基因治疗实现毛细胞再生或基因矫正的主要障碍之一是缺乏高效和特异的载体将基因导入哺乳动物内耳细胞。腺病毒(Adenovirus, Ad)和腺相关病毒(Adeno-associated virus, AAV)是最常用的内耳基因载体。这两种方法都成功地将功能性基因转移到哺乳动物的内耳中进行基因治疗[8- - - - - -23]Ad载体是一种很好的选择，因为它在多种组织和细胞类型中具有很高的转染效率，并且在感染后很快就有高水平的表达。此外，Ad载体具有较低的免疫原性和毒性[15- - - - - -23]。与AAV向量相比，广告矢量具有容纳更大的插入物。例如，最常用的腺病毒载体，即E1 / E3缺失突变体，允许将多达10kb的外来DNA插入病毒载体基因组中，而AAV只能携带4.7kb的外国DNA [13，24]。

以往的研究已经证明了Ad载体转导耳蜗毛细胞和支持细胞的能力[5- - - - - -13]。在哺乳动物内耳中，AD载体的转导是器官（耳蜗与前庭），细胞型（内毛细胞（IHC），外毛细胞（OHC）和支持细胞（SCS）），区域（碱，中间和顶端转弯）和年龄依赖。内耳中的广告载体的转导模式变化。为了使用AD载体将基因有效地递送到特异性内耳细胞亚型中，重要的是在各种实验条件下表征病毒载体亚型的转导模式，包括动物年龄，接种途径，病毒制剂，体积和数量病毒颗粒。

为了确定商用Ad载体的内耳传递模式，我们分析了携带贝勒医学院（Ad-GFP-Baylor）和载体生物实验室（Ad-GFP-VB）GFP的Ad载体，以及携带与贝勒医学院（Ad-Cre-GFP-Baylor）基因组编辑基因Cre重组酶（Cre）连接的GFP的Ad载体在活的有机体内为了它们在P0和P4小鼠耳蜗中内耳递送的潜力。

2.材料和方法

2.1.广告载体

我们获得了三个商用广告矢量：Ad-GFP-Baylor（贝勒医学院，休斯顿，TX，USA），AD-GFP-VB（Vector Biolabs，Malvern，Pa，USA）和Ad-Cre-GFP-Baylor（贝勒医学院，休斯顿，TX，USA）。Ad-GFP-Baylor，Ad-GFP-VB和Ad-Cre-GFP-Baylor的滴度菌斑形成单位（pfu）/ml， pfu/ml，以及 分别考虑了Ad－GFP Bayl的效价。空斑形成单位/毫升稀释。我们稀释了所有的广告pfu/ml与储存缓冲液根据载体指示从两个供应商的微注射。

2．2.小鼠内耳微注射Ad载体

P0和P4 CD1小鼠（美国马萨诸塞州威尔明顿查尔斯河实验室）根据马萨诸塞州眼耳医务室IACUC委员会批准的方案，用于Ad-Cre-GFP-Baylor、Ad-GFP-Baylor和Ad-GFP-VB注射。通过在冰上降温麻醉小鼠。通过在右耳后切开暴露耳蜗进行耳蜗造口。玻璃微量移液管（WPI，萨拉索塔，佛罗里达州，美国）由纳升微量注射系统（WPI，萨拉索塔，佛罗里达州，美国）持有，用于将Ad输送至scala培养基，该培养基允许进入内耳细胞。总体积约为0.2 µL在右侧的每个耳蜗注入L，并且释放以3 nL / sec的速度通过微操纵器控制。左侧耳蜗完整地作为内部控制。

2．3.免疫荧光和量化

注射后四天，处死小鼠，并通过标准方案收获耳蜗[1，17].对于全套免疫荧光，按照先前描述的方案使用抗HC（MYO7A，#25-6790，变形杆菌生物科学）和SC（SOX2，#SC-17320，Santa Cruz Biotech）标记物的一级抗体和荧光标记的二级抗体（Invitrogen）[1]。为了量化Ad注射后GFP阳性细胞的比例，我们统计了GFP阳性的ihc、OHCs和SCs的数量，然后将这些数量除以200个区域内的ihc、OHCs和SCs的总数µM位于耳蜗的顶端、中部或基部。

3.结果

我们通过科学矫形术将AD载体注入新生儿小鼠内耳，因为先前的研究表明，通过科学胃肠杆菌将AAV注入新生儿小鼠耳蜗中产生有效的转导在活的有机体内没有对听证的不利影响[8]。注射任何三个Ad载体中的任何三个Ad载体到P0或P4小鼠内耳后，耳蜗结构保持完整，头发细胞并存活支持细胞，表明注射和AD转导没有损伤内耳细胞（图1- - - - - -7)．

通过计算GFP阳性细胞的比例，我们评估了病毒载体的转导效率，因为所有三个广告载体都携带GFP.基因。HC和SC标记物的全坐式免疫荧光标记分别鉴定了毛细胞和支持细胞。我们发现，ad-cre-gfp-baylor转导限制为注射侧，在未注射的内耳中没有观察到GFP表达（图1（d）)．Ad-GFP-Baylor和Ad-GFP-VB也是如此(数据未显示)。我们的研究结果证实，通过耳蜗造口术的靶向投放Ad载体局限于被注射的内耳内。

我们的研究结果表明，两种不同年龄的三种不同的AD载体转导在不同效率的不同耳蜗区中的不同细胞类型（表1)．当在P0处注射ad - creg - gfp - baylor时，可以有效地转导70%以上的SCs，但在基底圈和中间圈不能转导hc(图)1(一)和1（b）)．它在顶端转导了少数细胞(图)1（c）)．与P0的注射相比，在P4注射，Ad-Cre-GFP-Baylor在基础和中转弯的较少的SC中转导，但是顶部转弯的SCS更多（图4)．

Ad-GFP-Baylor在SCs中也观察到类似的转导效率趋势(见表1)1)．它在P0注射时比Ad-Cre-GFP-贝勒更有效地转导内耳细胞（图2）或p4（图5)．此外，当在P4注射时，当在P4时，在顶部转弯时，它也会在顶部转弯中的大部分OHC和基础转弯时的一些IHC，当时旋转时，当在顶端转弯时，在端部的OHC中。

相比之下，Ad-GFP-VB比任何一种Ad-GFP-Baylor载体转导的SCs更少，且时间趋势相反:在P4处注射比在P0处更有效(表)1,数据3.和6)．此外，当在P0处注射时，它更一致地转导中部和顶端的ihc以及沿整个耳蜗线圈的OHCs(表)1)．

Ad-GFP-Baylor和Ad-GFP-VB在P0或P4处注射时，以相似的模式转导前庭造血干细胞和SCs(图)7)，而ad - creg - gfp - baylor不转导胞囊型hc或SCs。

总之，我们比较了在两个不同年龄段注射的三种Ad载体的转导模式。所有三种Ad载体均持续转导SCs，其中Ad-GFP-Baylor在整个耳蜗中的转导率最高。Ad-Cre-GFP-Baylor仅在基础和中间转期转导SCs。Ad-GFP-Baylor和Ad-GFP-VB也能转导SCsd一些HCs，包括IHC和OHCs（表1)．在P4处注射Ad-GFP-Baylor载体的总转导效率低于P0处，但在SCs中注射Ad-GFP-VB的转导效率较高。此外，在P0处注射Ad-GFP-VB具有更广泛的转导模式，因为它沿整个耳蜗传导OHCs，并在中耳蜗和耳尖转导ihc，而在P4处注射Ad-GFP-VB仅在耳尖转导少量OHCs。

4。讨论

这项研究确定了以小鼠内耳细胞亚型为目标的用于基因传递的商业腺病毒载体。三种腺病毒载体转导P0和P4内耳，其特异性和表达水平不同，这取决于腺病毒载体的类型和小鼠的年龄。耳蜗感觉上皮含有听觉毛细胞和支持细胞，具有较高的转导效率。单独含GFP的腺病毒转导囊性支持细胞。被感染的细胞在研究期间存活了下来(注射后4天)。研究表明Ad载体能够有效地转导哺乳动物内耳，为基因治疗评价和内耳基因功能研究提供了有用的工具。

有两种毛细胞再生方法：（1）围绕细胞的直接转染细胞，特别是支持细胞，以改变细胞命运以成为头发细胞和（2）诱导细胞循环在细胞中的细胞循环再入，然后进一步分化更换受损的毛细胞[1，25，26]。因此，支持细胞是毛细胞直接转分化或再生后转分化的理想候选细胞。此外，剩余的毛细胞可以分裂产生新的毛细胞。许多感觉神经性听力损失和前庭功能障碍的病例是由感觉上皮的初级病理引起的[17，18]。因此，重要的是在感觉上皮细胞中表达转基因，例如支持细胞。三个广告载体有效地转导SCS，这表明它们对潜在的毛发细胞再生研究有用。在P0注入时，AD-CRE-GFP-BAYLE仅在中间和底部转动的SCS。由于病毒颗粒的扩散有限，缺乏顶端SCs的转导。Ad-Cre-GFP-Baylor仅转换SCS，而Ad-GFP-Baylor在Apex转动时转导80％OHC，并且在P0的碱基转弯时的一些IHCs。AD-GFP-VB转换SCS和OHCS。因此可以选择每个广告载体以仅为SCS，HCS或两者提供基因。

载体接种量和滴度影响病毒转导细胞的类型和位置。为了比较三种病毒感染的差异，我们使用了相同滴度的三种Ad-GFP-Baylor，有趣的是Ad-GFP-Baylor和ad - cref - gfp - baylor具有不同的转导特异性。然而，根据贝勒医学院Ad-GFP-Baylor指令，病毒颗粒(vp)与斑块形成单位(pfu)的比例在1:10 ~ 1:200之间，效价为 pfu/ml。我们使用pfu/ml稀释，这可能低估了实际滴度，因为它有最高的转导效率。

通过人工耳蜗造口术，通过斯卡拉介质注射到小鼠耳蜗内，使病毒可以接触到多种类型的耳蜗细胞，从而最大限度地提高效率。以往的研究表明，细胞存活率更好的结果是，应使用比P5年龄小的小鼠，因为在比P5年龄大的小鼠中，OHCs通常会因手术死亡，特别是在成年期[8，9，13]。未来的学习需要专注于鉴定注射的途径，而不会引起细胞死亡或听力损失。

将治疗性转基因与报告基因相结合将有助于容易识别靶向细胞类型。人类内耳的尺寸要大得多，有助于更准确的传递，这可能有助于发展患者的基因治疗。

5.结论

本研究探索了商业三个广告载体进入鼠标内耳在活的有机体内结果表明，通过具有不同特异性和效率的Ad载体将基因转移到小鼠内耳是可行的。内耳基因传递的未来应用可能包括诱导毛细胞再生和治疗遗传性耳聋和前庭功能障碍。耳蜗造口术传递reporter转基因进入内耳的多种细胞类型，包括感觉上皮细胞，使这种方法对内耳细胞亚型具有吸引力。持续改进内耳细胞亚型高效载体的鉴定将促进其最终用于治疗人类听力损失。

相互竞争的利益

作者声明本文的发表不存在利益冲突。

作者的贡献

Yilai Shu和Yong Tao同样贡献了这项工作。

致谢

陈毅陈得到了美国国家卫生研究院（R01 DC006908）。Yilai Shu，Yong Tao和Wenyan Li由Frederick和Ines提供支持，由中国国家自然科学基金（NSFC81300824）和上海市科技委员会（15PJ1401000）的科技委员会（15PJ1401000）提供助理毛发细胞再生赠款和Yilai Shu。

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