NP 神经可塑性 1687 - 5443 2090 - 5904 Hindawi出版公司 10.1155 / 2016/9409846 9409846 研究文章 腺病毒载体目标几种哺乳动物内耳细胞亚型 在活的有机体内 http://orcid.org/0000 - 0001 - 5668 - 5107 蜀 Yilai 1、2、3 2 3 http://orcid.org/0000 - 0002 - 3346 - 6937 道 勇 1 李 闻堰 1、2、3 2 3 沈 小君 4、5 5 http://orcid.org/0000 - 0002 - 5141 - 9851 王 Zhengmin 2、3 3 http://orcid.org/0000 - 0002 - 1452 - 4193 陈 Zheng-Yi 1 李 Genglin 1 耳鼻咽喉部 哈佛医学院和Eaton-Peabody实验室 马萨诸塞州的眼睛和耳朵医务室 波士顿 马02114 美国 masseyeandear.org 2 头颈外科 眼耳鼻喉医院 上海医科大学 复旦大学 上海 中国 fudan.edu.cn 3 听力医学重点实验室 国家卫生和计划生育委员会 上海 中国 nhfpc.gov.cn 4 病理学系 布莱根妇女医院 哈佛医学院 波士顿 马02115 美国 harvard.edu 5 分子医学实验室 合作伙伴个性化医疗 剑桥 马02139 美国 partners.org 2016年 28 12 2016年 2016年 09年 09年 2016年 08年 11 2016年 2016年 版权©2016 Yilai蜀et al。 这是一个开放的文章在知识共享归属许可下发布的,它允许无限制的使用,分布和繁殖在任何媒介,提供最初的工作是正确的引用。

哺乳动物内耳港口不同的细胞类型,对于听力和平衡至关重要。腺病毒是一个主要的向量传递到内耳基因功能研究和头发细胞再生。确定腺病毒载体这一目标特定的细胞亚型在内耳,我们研究三个腺病毒载体,携带报告基因编码绿色荧光蛋白 (GFP)从两个供应商和一个基因组编辑Cre重组酶的基因 (Cre)通过注入产后天0 (P0)和4 (P4)小鼠耳蜗cochleostomy通过scala媒体 在活的有机体内。我们发现三腺病毒载体转导老鼠内耳细胞与不同的特异性和表达水平,取决于运载体的类型和老鼠的年龄。最常见的有针对性的区域是耳蜗感觉上皮,包括听觉毛细胞和支持细胞。腺病毒与 绿色荧光蛋白转导支持细胞囊状的。这项研究表明,腺病毒载体能有效地和转换不同细胞类型的哺乳动物内耳,并提供有用的工具来研究内耳基因功能和基因疗法治疗听力损失评估和前庭功能障碍。

 美国国立卫生研究院的 R01 DC006908 弗雷德里克和Ines Yeatts毛细胞再生 中国国家自然科学基金 NSFC81300824 上海市科学技术委员会 15 pj1401000 1。介绍

不可逆转的毛细胞损失是永久性的感音神经性听力损失的主要原因,没有有效的治疗方法。致病性变异在数百个基因是负责许多形式的遗传性听力损失。毛细胞再生的发展策略和基因传递已经成为一个主要的焦点在寻找潜在的治疗方法恢复听力( 1- - - - - - 3]。

降低脊椎动物包括鸟类和鱼类的毛细胞可以再生毛细胞后整个生命损失由两个机制。首先,内耳支持细胞和剩余的头发细胞进入细胞周期分化成新的毛细胞。第二,周围细胞位于下失去了头发也可以直接transdifferentiate到新的毛细胞( 4- - - - - - 6]。然而,哺乳动物内耳毛细胞已经失去了能力再生自发。一个策略再生毛细胞恢复听力的哺乳动物中诱导周围细胞尤其是支持细胞直接transdifferentiate成毛细胞。另一种方法是诱发剩余毛细胞和支持细胞进入细胞周期中毛细胞和支持细胞进一步分化( 1, 7]。要么方法需要有效的交付所必需的基因诱导这些过程成哺乳动物内耳细胞。

内耳是一个特别有吸引力的器官靶向基因治疗,因为向量可以本地交付给封闭结构,大大降低了系统的副作用。实现毛细胞再生的一个主要障碍或基因修正基因疗法是缺乏有效的和特定的车辆提供基因导入哺乳动物内耳细胞。腺病毒(广告)和腺相关病毒(AAV)是最常见的向量用于内耳基因传递。都被用来成功功能基因转移到哺乳动物内耳基因治疗[ 8- - - - - - 23]。广告媒介是一个很好的选择因为它在不同组织和细胞,转染效率高与高水平的表达感染后不久。此外,广告载体低免疫原性和毒性 15- - - - - - 23]。比较AAV载体,广告载体有能力容纳更大的插入。例如,最常用的病毒载体,E1 / E3缺失突变体,允许插入10 kb的外源DNA病毒载体基因,而AAV只能携带4.7 kb的外源DNA ( 13, 24]。

先前的研究已经证明了广告载体的转导能力耳蜗毛细胞和支持细胞( 5- - - - - - 13]。在哺乳动物内耳,广告载体转导的器官(耳蜗和前庭),细胞类型(内毛细胞(包含ihc),外毛细胞(ohc),和支持细胞(SCs))、地区(基地,中间,和顶端),和年龄依赖。广告载体的转导模式内耳有所不同。为了使用广告向量有效地交付内耳基因导入特定的细胞亚型,重要的是要描述病毒载体的转导模式亚型在各种实验条件下,包括动物年龄、接种途径,病毒制剂,体积,和病毒颗粒的数量。

确定商用广告载体的内耳交付模式,我们分析了广告载体携带绿色荧光蛋白从贝勒医学院(Ad-GFP-Baylor)和矢量生物学实验室(Ad-GFP-VB)和一个广告向量携带绿色荧光蛋白基因与基因组编辑Cre重组酶(Cre)从贝勒医学院(Ad-Cre-GFP-Baylor) 在活的有机体内为他们的潜力P0内耳基因传递和P4 cochleae老鼠。

 2。材料和方法 2.1。广告媒介

我们得到三个商用广告向量:Ad-GFP-Baylor(美国贝勒医学院,休斯顿,德克萨斯州),Ad-GFP-VB(美国宾夕法尼亚州向量生物学实验室,莫尔文),和Ad-Cre-GFP-Baylor(美国贝勒医学院,休斯顿,德克萨斯州)。Ad-GFP-Baylor的滴度,Ad-GFP-VB Ad-Cre-GFP-Baylor 2。5 × 10 10 - - - - - - 5 × 10 11 点状单元(pfu) /毫升, 1 × 10 10 空斑形成单位/毫升, 1.7 × 10 11 分别空斑形成单位/毫升。我们认为Ad-GFP-Baylor的效价 10 × 10 10 空斑形成单位/毫升稀释。我们稀释所有广告 1 × 10 10 空斑形成单位/毫升与存储缓冲区根据显微镜下注射的向量指令从两个供应商。

 2.2。广告向量的显微镜下注射到老鼠内耳

P0和P4 CD1小鼠(查尔斯河实验室,威尔明顿,美国)是用于Ad-Cre-GFP-Baylor Ad-GFP-Baylor和Ad-GFP-VB注入,根据协议通过麻省眼和耳医院IACUC委员会。小鼠麻醉通过降低温度对冰。Cochleostomies进行通过一个切口在右耳后面暴露耳蜗。美国佛罗里达州萨拉索塔,玻璃微量吸液管(WPI)所持有的一只显微镜下注射系统(美国佛罗里达州萨拉索塔,WPI)被用来提供广告到中道,它允许访问内耳细胞。~ 0.2的总量 µL是注入/右侧耳蜗和释放是由显微操纵器控制3问/秒的速度。左边的耳蜗保住了自己作为内部控制。

 2.3。免疫荧光和量化

注射四天后,老鼠牺牲和cochleae收获标准协议( 1, 17]。包埋免疫荧光,初级抗体HC (MYO7A # 25 - 6790,变形杆菌生物科学)和SC (SOX2 # SC - 17320年,圣克鲁斯生物技术)标记,使二次抗体(英杰公司)使用先前描述的协议后( 1]。量化的GFP阳性细胞比例广告注射后,我们清点的数量GFP阳性包含ihc, ohc, SCs,然后除以总数量的包含ihc, ohc, SCs,分别在一个地区跨越200年 µm的顶端,中间或基底的耳蜗。

 3所示。结果

我们广告载体注入新生鼠内耳P0或通过cochleostomy P4,因为之前的研究表明,注射AAV到新生小鼠耳蜗cochleostomy导致有效转导 在活的有机体内没有不良影响听力( 8]。四天之后注射的三个广告向量为P0或P4鼠标内耳,耳蜗结构保持完整和毛细胞和支持细胞存活,表明注射和广告转导没有损害内耳细胞(数据 1- - - - - - 7)。

Ad-Cre-GFP-Baylor能传感支持细胞注入小鼠耳蜗P0时。代表共焦图像包埋的耳蜗注射荧光immunolabeling P0说明基底(a)、(b),和顶端(c),而侧uninjected中间的耳蜗毛细胞(d)。Myo7a标签,支持细胞和Sox2标签。Ad-Cre-GFP-Baylor主要能传感支持细胞在基底和中间。规模的酒吧:10 μm。

Ad-GFP-Baylor能传感多样化的耳蜗细胞注入P0时。代表共焦图像包埋的耳蜗注射荧光immunolabeling P0说明基底(a)、(b),和顶端(c)。Ad-GFP-Baylor能传感支持细胞(SCs)和内毛细胞(包含IHC)基底(a), SCs在中间(b),和外毛细胞(OHC)顶(c)。包含IHC:内毛细胞,OHC:外毛细胞和SC:支持细胞。规模的酒吧:10 μm。

Ad-GFP-VB能传感不同类型的细胞在小鼠耳蜗P0注入。代表共焦图像包埋耳蜗注射腺病毒的荧光immunolabeling P0说明基底(a)、(b),和顶端(c)。Ad-GFP-VB能传感SCs和OHC基底(a), OHC,包含IHC,中产(b)和SCs, OHC和包含IHC在顶端(c)。包含IHC:内毛细胞,OHC:外毛细胞和SC:支持细胞。规模的酒吧:10 μm。

Ad-Cre-GFP-Baylor能传感支持细胞在小鼠耳蜗注入在P4。代表共焦图像整体荧光immunolabeling小鼠耳蜗说明基底(a)、(b),和顶端(c)。Ad-Cre-GFP-Baylor能传感SCs基底和中间结果有效。它能传感SCs的顶端。规模的酒吧:10 μm。

Ad-GFP-Baylor能传感小鼠耳蜗P4注射时。代表共焦图像整体荧光immunolabeling P0耳蜗说明基底(a)、(b),和顶端(c, d)。Ad-GFP-Baylor能传感SCs基底(a), SCs和包含IHC中产(b),和SCs ohc在顶端(c)。外毛细胞在顶端转导(d)。包含IHC:内毛细胞;OHC:外毛细胞。

Ad-GFP-VB能传感支持细胞和ohc在小鼠耳蜗在P4注入。代表共焦图像整体的荧光immunolabeling耳蜗说明基底(a)、(b),和顶端(c)。Ad-GFP-VB能传感SCs在中间基底(a)和(b)和偶尔的在顶端上凸轮轴(箭头(c))。规模的酒吧:10 μm。

Ad-GFP-Baylor (a)和Ad-GFP-VB (b)转换支持细胞和老鼠小囊中的毛细胞P0注射时。代表共焦图像整体的荧光immunolabeling小囊。规模的酒吧:10 μm。

我们评估了病毒载体的转导效率计算GFP阳性细胞的比例,因为这三个广告向量进行 绿色荧光蛋白基因。包埋免疫荧光标记HC和SC标记Myo7a Sox2确定毛细胞和支持细胞,分别。我们发现Ad-Cre-GFP-Baylor转导是局限于注射,没有观察GFP表达uninjected内耳(图 1 (d))。Ad-GFP-Baylor也是如此,Ad-GFP-VB(数据没有显示)。我们的研究结果证实,交付广告通过cochleostomy向量是局限在注射内耳。

我们的研究结果表明,三种不同的广告载体注入两种不同年龄段转导细胞类型在不同的耳蜗不同区域有不同的效率(表 1)。Ad-Cre-GFP-Baylor, P0,注射时有效转导超过70%的SCs但不是高碳钢在基底和中间结果(数据 1(一)和 1 (b))。它转导顶端的一些细胞(图 1 (c))。比较在P0注射,注射在P4, Ad-Cre-GFP-Baylor转导SCs基底和中间结果较少,但更SCs的顶端(图 4)。

的比较 在活的有机体内转导效率在不同的细胞类型和耳蜗地区四天后注入三运载体为P0或P4 cochleae老鼠。 N = 4 每一个条件。顶端:顶端的耳蜗基底:基底的耳蜗,包含ihc:内毛细胞,中间:中间的耳蜗,ohc:外毛细胞,P0:注射在产后一天0,P4:注射在产后第四天,和SCs:支持细胞。

转导效率(%) 包含ihc ohc SCs
基底 中间 顶端 基底 中间 顶端 基底 中间 顶端
Ad-Cre-GFP-Baylor P0 74.5±8.6 70.6±7.8
P4 54.4±6.8 52.4±6.9 3.8±1.2
Ad-GFP-Baylor P0 9.1±1.2 80.0±12.0 90.8±9.2 84.7±10.6
P4 13.6±2.9 17.4±4.2 79.1±10.6 74.3±11.2 42.3±6.1
Ad-GFP-VB P0 9.1±1.5 15.0±4.8 9.8±1.8 29.0±4.9 27.8±4.1 41.5±8.1 7.7±2.9
P4 2.9±0.9 51.1±6.2 33.1±4.2

类似的趋势观察SCs的转导效率Ad-GFP-Baylor(表 1)。它比Ad-Cre-GFP-Baylor转导内耳细胞更有效地注入时P0(图 2)或P4(图 5)。此外,它还转导多数ohc的顶端,一些包含ihc基底P0注入时,中间包含ihc转身ohc的顶端在P4当注入转。

相比之下,Ad-GFP-VB转导SCs少于Ad-GFP-Baylor向量的一个相反的时间趋势:更有效地注入时P4比P0(表 1,数据 3和 6)。进一步,它更加一致并包含ihc中间和顶端转身ohc整个耳蜗线圈P0注射时(表 1)。

Ad-GFP-Baylor Ad-GFP-VB转导前庭高碳钢和SCs相似P0或注射时P4(图 7),而Ad-Cre-GFP-Baylor转导没有囊状的高碳钢或SCs。

总之,我们比较三个广告载体的转导模式注入在两个不同的年龄。所有三个广告向量始终转导SCs, Ad-GFP-Baylor展示整个耳蜗转导率最高。Ad-Cre-GFP-Baylor转导只有SCs的基底和中间。Ad-GFP-Baylor也Ad-GFP-VB转导一些高碳钢包括包含ihc和ohc(表 1)。整体Ad-GFP-Baylor转导效率是降低向量P4注射时比在SCs P0但Ad-GFP-VB更高。此外,Ad-GFP-VB广泛传导模式注入时P0沿着整个耳蜗转导ohc和包含ihc中产和顶点,但是它只转导几ohc的顶端在P4当注入转。

 4所示。讨论

本研究确定了商业腺病毒病毒载体这一目标鼠标内耳细胞亚型基因传递。三腺病毒载体转导P0和P4内耳,与不同的特异性和表达水平依赖于运载体的类型和老鼠的年龄。耳蜗感觉上皮,港口听觉毛细胞和支持细胞,并具有较高的效率。GFP的腺病毒转导细胞囊状的支持。受感染的细胞存活的研究(注射后4天)。研究表明,广告向量能够有效转导哺乳动物内耳,并提供有用的工具来评估基因治疗和研究内耳基因功能。

毛细胞再生的有两种方法:(1)周围细胞尤其是支持细胞直接分化转移改变细胞命运成为毛细胞和(2)诱导细胞周期等细胞重新支持细胞,然后进一步分化来取代受损的头发细胞( 1, 25, 26]。因此,支持细胞毛细胞再生的理想候选人直接分化转移或重新与后续分化转移扩散。此外,剩下的头发细胞可以分裂产生新的毛细胞。很多情况下的感音神经性听力损失和前庭功能障碍是由于感觉上皮的主要病理学( 17, 18]。因此,重要的是表达的转基因感觉上皮细胞等细胞特别支持。三个广告载体转导SCs有效,这表明他们可能是有用的潜在毛细胞再生的研究。Ad-Cre-GFP-Baylor转导SCs只在中间和基础P0注射时。缺乏转导的顶端SCs可能是因为有限的扩散的病毒颗粒。Ad-Cre-GFP-Baylor仅能传感SCs,而Ad-GFP-Baylor转导80% ohc顶点在P0,一些包含ihc基地转。Ad-GFP-VB能传感SCs和上凸轮轴。每个广告向量因此可以选择只提供基因SCs,高碳钢,或两者兼而有之。

向量接种的体积和效价影响细胞转导的细胞类型和位置的病毒。比较三种病毒感染的区别,我们使用相同的效价的三个广告。有趣的是,Ad-GFP-Baylor和Ad-Cre-GFP-Baylor有不同的特异性转导。然而,根据指令的Ad-GFP-Baylor贝勒医学院病毒粒子(vp)点状单元(pfu)比率是在一系列1:10 - 1:200和效价 2。5 × 10 10 - - - - - - 5 × 10 11 空斑形成单位/毫升。我们使用的效价 10 × 10 10 空斑形成单位/毫升稀释,这可能是低估了实际的效价,转导效率最高。

注入小鼠耳蜗通过中道cochleostomy最大化效率,因为它允许病毒获得许多耳蜗细胞类型。先前的研究表明,细胞生存的更好的结果,应该使用比P5年轻老鼠,因为ohc通常会死在老鼠比P5由于手术,尤其是在成年期( 8, 9, 13]。未来研究需要关注的识别路线的注入可以执行在成人不会导致细胞死亡或听力损失。

结合治疗转基因与报告基因将细胞类型的信息,以方便识别目标。人类内耳规模更大,便于更准确的交付,这可能帮助病人基因治疗的发展。

 5。结论

本研究探讨商业广告三个向量到鼠标内耳 在活的有机体内。结果显示基因转移到鼠标内耳的可行性通过广告向量与不同的特异性和效率。内耳基因传递的未来应用程序可能包括毛细胞再生的感应和治疗遗传性耳聋和前庭功能障碍。的能力cochleostomy交付记者转基因成各种类型的细胞在内耳,包括感觉上皮,使这种方法吸引目标内耳细胞亚型。持续改进的高效的识别向量针对内耳细胞亚型会推进他们的最终用于治疗人类的听力损失。

 相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

 作者的贡献

Yilai蜀、勇道了同样的工作。

 确认

陈Zheng-Yi支持由美国国家卫生研究院(R01 DC006908)。Yilai蜀永道,闻堰,李被弗雷德里克和支持Ines Yeatts毛细胞再生格兰特和Yilai蜀由中国国家自然科学基金(NSFC81300824)和上海市科学技术委员会(15 pj1401000)。

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