文摘

皮质抑制性神经元起着至关重要的作用在调节兴奋性突触网络和认知功能异常的发展这些细胞与神经发育障碍。分泌神经营养因子的neuregulin 1 (NRG1)及其受体ErbB4建立了监管机构的抑制性神经元连接,但发育信号这一过程的调节机制仍知之甚少。在这里,我们提供的证据表明,NRG1-ErbB4信号通过多功能脚手架蛋白功能,中断在精神分裂症1 (DISC1)、调节皮质抑制性中间神经元树突和突触的发展成长。我们发现NRG1增加抑制性神经元树突复杂性和glutamatergic突触形成抑制性神经元上,这种效应被表达的显性负DISC1突变,或DISC1击倒。我们还发现,NRG1治疗增加DISC1表达式及其本地化glutamatergic到皮质抑制性神经元突触。从力学上看,我们认为DISC1结合ErbB4皮质抑制性神经元内。总的来说,这些数据表明NRG1-ErbB4-DISC1信号通路调节大脑皮层抑制神经元树突和突触的发展成长。鉴于NRG1, ErbB4, DISC1 schizophrenia-linked基因,这些发现揭示了如何独立危险因素可能信号在一个共同的发展途径,有助于神经连接缺陷和疾病的发病机理。

1。介绍

正常运转的中枢神经系统兴奋和抑制性神经传递之间需要一个良好的平衡(1]。皮质抑制性神经元,分类的表达抑制性神经递质γ氨基丁酸(GABA),占10 - 25%的皮层神经元和抑制的主要来源是2]。皮质抑制性神经元在神经系统发育和扮演主要的角色是重要的微调glutamatergic突触的形成等过程和函数定义的时间经验依赖发展中大脑的神经可塑性的关键时期(3,4]。皮质抑制性神经元也监管机构的高频伽马振荡,这被认为是认知过程,如工作记忆和注意力(5- - - - - -7]。也有大量的证据显示,赤字皮质抑制性神经元的发育和功能上参与神经发育障碍,如癫痫、精神分裂症和自闭症谱系障碍(asd) [1,8- - - - - -13]。因此,了解分子通路调节抑制性神经元发展可能揭示其功能是如何在这些障碍中断。在这方面,皮质抑制性神经元的形态发展是由细胞外(如神经活动(14]和NRG1 [15- - - - - -17])和胞内信号分子(例如,distal-less同源框(Dlx)转录因子家族18]),调节树突的分支和突触的形成。然而,底层信号通路管理抑制性神经元的发展,因此,如何将这些过程可能影响神经发育障碍仍知之甚少。

多个研究涉及的关键作用neuregulin 1 - (NRG1) ErBb4信号通路在皮质抑制性神经元的发展。此外,一些链接和遗传关联研究已经确定了编码这些蛋白的基因作为精神分裂症的风险因素(19- - - - - -23]。NRG1是一种神经营养因子,结合并激活受体酪氨酸激酶的ErbB家族目标神经元(24,25]。在鼠标皮层,ErbB4主要是表达GABA-ergic抑制性神经元,兴奋性神经元中表达水平较低(17,26- - - - - -28]。生物功能的NRG1-ErbB4信号通路抑制神经元发展包括神经元迁移等过程,树突增长、突触形成和神经递质受体表达(15,16,29日- - - - - -31日]。例如,应用NRG1皮质神经元的文化导致增加兴奋突触发生到抑制性神经元树突增长和(15,16,抑制特异性神经元ErbB4基因敲除小鼠显示减少兴奋性突触发生在大脑皮层抑制性神经元(30.]。NRG1-ErbB4信号调节的机制之一,这些过程是通过激活Kalirin-7,以前一个基因与精神分裂症(15,32,33]。然而,很少有知道其他下游信号分子的NRG1-ErbB4上下文。1 (DISC1)精神分裂症精神分裂症是另一个假定的风险基因34- - - - - -41],许多证据表明它可能功能和/或身体与NRG1-ErbB4交互信号通路(15,17,30.,40- - - - - -47]。DISC1是首次发现之间的平衡易位染色体1和11 (1 q42.1;11 q14.8)在苏格兰血统盛行的精神分裂症和其他精神疾病(32,33]。功能性这种易位的结果是未知的。先前的研究表明,它可能作为一个占主导地位的消极的蛋白质(48- - - - - -50),而另一个研究表明疾病机制可能haploinsufficiency [51)与小说文本产生的可能性由于易位(52]。DISC1基因编码一个脚手架蛋白表达在发展中,成人的大脑与神经发育和分享了很多角色NRG1-ErbB4通路(15,46,48,50,53,54]。条件抑制特异性神经元ErbB4基因敲除小鼠和DISC1基因小鼠模型显示类似的形态赤字在大脑发育和行为表型等异常感觉运动控制,工作记忆,和社交能力17,30.,40- - - - - -43,50]。此外,ErbB4和DISC1共同绑定合伙人兴奋性突触的突触后密度(例如,突触后密度- 95 (PSD95)和Kalirin-7)表明他们可能身体上或功能上相互作用[15,44,45]。瑟哈德里和他的同事的研究表明,治疗主要鼠皮质神经元与NRG1 DISC1表达增加皮质神经元(神经突49]。然而,这种效应主要是由ErbB2/3,说明小说NRG1-ErbB2/3通路调节DISC1表达式在皮质兴奋性神经元49]。最近,Sawa实验室的一项研究表明,在成熟的小鼠皮层,NRG1之间的功能关系,ErbB4, DISC1在抑制性神经元突触可塑性的规定(55]。然而,这种关系是否建立在抑制性神经元发展和苏格兰DISC1变异如何影响这个过程没有实验审问。

在这里,我们表明,NRG1函数通过DISC1调节树突增长的发展和使用抑制特异性神经元兴奋性突触的形成到抑制性神经元表达的显性负DISC1突变,苏格兰突变模型。此外,我们提供的证据表明,治疗原发性鼠标皮质与NRG1增加DISC1文化水平和本地化glutamatergic在主要的抑制性神经元树突突触。最后,我们提供的证据表明,ErbB4 DISC1绑定,这表明,在发展中抑制性神经元,通过DISC1 NRG1-ErbB4信号。这些结果表明,两个候选人精神分裂症的风险通路功能交互调节大脑皮层抑制神经元形态学的发展。

2。材料和方法

2.1。抗体和构造

以下主要抗体被用于这项研究:山羊anti-DISC1 n端(N-16)(圣克鲁斯生物技术;如果解放军/ 1:100年,世行1:500),兔子anti-ErbB4糖基(C-18)(圣克鲁斯生物技术;计划1:100年,世行1:100),豚鼠anti-VGLUT1 (EMD微孔;如果1:1000年,世行1:3000),anti-GAD65&67(微孔;1:1000),鼠标anti-GFP(圣克鲁斯生物技术;IP 1: 1000),兔抗β肌动蛋白(细胞信号技术;IB 1: 1000), anti-mouse免疫球蛋白(IP 1: 1000),和鸡肉anti-GFP(鸟类实验室有限公司;如果1:1000)。所有二次抗体(抗体cy5 anti-guinea猪cy3,和anti-chicken 488;杰克逊ImmunoResearch;如果1:500年,anti-rabbit-HRP anti-mouse-HRP;通用电气生命科学;IB 1: 5000)生长在驴。

DLX5/6-GFP构造是一个礼物从德马科加西亚et al。14]。控制成分,DISC1成分和DISC1-GFP构造创建如前所述[56]。的从Di克里斯托gfp构造是一个礼物57,58]。的-DISC1FL和-DISC1DN构造是由GeneArt(技术)。完整的鼠标DISC1基因(DISC1FL) (RefSeq NC_000074.6)和c端截短突变体的c端257个氨基酸(DISC1DN)[删除50]从合成寡核苷酸组装和/或PCR产品。每个片段克隆分别进入gfp向量(kanR)使用奶嘴和PmeI克隆网站,导致构造包含启动子的上游GAD67 DISC1FL或DISC1DN编码序列。质粒DNA纯化从转化细菌。ErBb4质粒和ErBb4 KD质粒的礼物Yardena塞缪尔(pcDNA3.1-ErbB4: Addgene质粒# 29527,pcDNA3.1-ErbB4激酶死了:Addgene质粒# 29533)。

2.2。细胞培养、转染和治疗

初级皮层神经元培养如下。皮质被切割出CD1小鼠(Charles River)在E16天胚胎的大脑。离解辅助孵化在0.3毫克/毫升木瓜蛋白酶(卫氏生化)/ 400 U /毫升DNase我(表达载体)1 x汉克斯缓冲盐溶液(hbs) 20分钟37°C,紧随其后的是光磨碎。细胞被播种到0.1毫克/毫升Poly-D-Lysine (BD科学)/ 3.3μg / mL层粘连蛋白(σ)涂盖滑(Matsunami) 12-well板的密度0.8 ~ 1×10⁶包含Neurobasal细胞/镀在媒体中,10%胎牛血清,1%青霉素和链霉素,2毫米谷酰胺(表达载体)。1.5小时后,媒体无血清培养系统改为喂食含有Neurobasal介质,B27补充2%,1%青霉素、链霉素、谷酰胺和2毫米。在DIV2-4,文化被接受1μM胞嘧啶β-D-arabinofuranoside盐酸盐(Ara-C)(σ)抑制胶质细胞增殖。文化是维持在37°C, 5%的公司₂。所有媒体组件来自Gibco除非另有说明。转染进行DIV7使用Lipofectamine肝和+试剂(英杰公司)根据制造商的指示。

HEK 293英尺在杜尔贝科的修改鹰培养基培养细胞(费舍尔科学)补充10%的边后卫和1% Glutamax(费舍尔科学),通过每2 - 4天。HEK 293英尺细胞转染进行使用Lipofectamine 2000(英杰公司)根据制造商的指示。

神经元主要是处理人类NRG1 5 nM重组β1 / HRG1β1 EGF域(研发系统)溶解在磷酸盐(PBS) DIV19和20。同等体积的PBS被用作车辆控制。西方墨点法,初级皮层文化治疗5 nM NRG1 DIV3和4,和刮DIV5裂解缓冲。化验Duolink邻近结扎,细胞NRG1对待β1或PBS固定前5分钟。HEK 293英尺的细胞治疗人类NRG1 10纳米β1 / HRG1β1 EGF域5分钟37°C。治疗后,细胞被放置在冰,用冰冷的PBS洗净,刮到裂解缓冲。

2.3。Coimmunoprecipitation和免疫印迹

蛋白溶解产物是由细胞刮在裂解缓冲(150毫米氯化钠,特里同x - 100 1%, 50 mM Tris-Cl,并完成迷你蛋白酶抑制剂鸡尾酒(罗氏)。25μL蛋白G dynabeads(费舍尔科学)与5孵化μg主要抗体或免疫球蛋白控制抗体1 h在4°C。溶菌产物被孵化的bead-Ab共轭1 h在4°C。珠子被洗了三次与裂解缓冲然后在样品缓冲煮5分钟。西方墨点法,20μL Tris-Glycine凝胶8%的样本加载并运行在室温下,随后转移到PVDF膜(热科学)。膜被封锁在3%的牛奶1 x 1 h TBST和孵化主要抗体在一夜之间,然后用二次抗体(驴anti-mouse或anti-rabbit合,通用电气医疗集团)在室温下1 h在曝光之前使用ChemiDoc议员系统(BioRad)。

2.4。免疫细胞化学和量化

DIV21,细胞玻璃罩都固定在4%甲醛在室温下在PBS 20分钟。细胞被洗在PBS,其次是阻塞在阻塞/透化作用的解决方案组成的驴10%血清(Cedarlane)和0.3% Triton x - 100(费舍尔科学)PBS室温1小时。孵化在初级抗体进行在4°C隔夜温和的风潮。细胞被洗在PBS,其次是孵化与二次抗体在50%阻塞/透化作用的解决方案在室温下与温和搅拌1.5小时。细胞被洗在PBS和被安装在超视综艺体显微镜玻片(VWR)使用延长黄金不变色试剂(技术)。盖滑落在一夜之间被允许干前蔡司LSM700共焦显微镜的成像。puncta分析、图像使用ImageJ手动阈值,这样每个图像在一个实验是相同的值的阈值。ImageJ的“粒子分析”工具被用来计算个体的数量puncta从胞体和树突部分2 - 3(10-40每个细胞μ米²附近)的主树突细胞的身体。在ImageJ Sholl分析。直线工具用来画一条线200μ米的长度从soma的中心。Sholl分析插件(http://labs.biology.ucsd.edu/ghosh/software/ShollAnalysis.pdf)被用于制造同心圆增加半径为10μm和计算数量的十字路口。

2.5。Duolink接近结扎试验(PLA)

中国人民解放军是使用Duolink执行原位红色试剂(σ)。大脑皮层神经元被播种到poly-D-Lysine / Laminin-coated封面24-well板块(~ 3.5×10中滑倒了⁵细胞/)或12-well板块(~ 1×10⁶细胞/)。DIV21治疗后,大脑皮层神经元与4%甲醛固定在PBS室温20分钟。细胞在1 x PBS洗3次,8分钟,其次是阻塞在阻塞/透化作用的解决方案组成的驴10%血清(Cedarlane)和0.3% Triton x - 100(费舍尔科学)PBS室温1小时。孵化在初级抗体进行在4°C隔夜温和的风潮。主要抗体是省略了解放军控制条件。样品在1 x洗清洗缓冲(提供的工具包)在室温下2次,5分钟,其次是孵化与包含两个解放军探针的混合物稀释50%阻塞/透化作用解决方案在37°C调湿室1小时。1 x的细胞再次清洗清洗缓冲在室温下2次,5分钟。结扎反应了在37°C调湿室30分钟,其次是洗1 x缓冲洗2次,5分钟。细胞培养与amplification-polymerase解决方案100分钟在一个黑暗的调湿室37°C。B细胞被洗1 x缓冲区(工具包)提供的2倍,每10分钟,1分钟在室温下用0.01 x缓冲B。 Cover slips were then mounted onto VistaVision glass microscope slides (VWR) using mounting media with DAPI (supplied with the kit). Images were acquired on a Zeiss LSM700 confocal microscope using a 63x objective. The PLA signal density (identified as red dots) was quantified in the cell body and 3 primary dendrites per cell from manually thresholded maximum intensity projections of three to seven Z-stacks (1 μ使用ImageJ m步长)的形象。

2.6。统计分析

量化数据提出了均值±SEM和分析使用GraphPad棱镜6。统计两组之间的比较是用未配对的学生的测试。比较多个组之间用单向方差分析(方差分析),与图基事后测试来确定组间显著差异。概率()不到5%的值被认为是重要的。

3所示。结果

3.1。DISC1的shRNA击倒抑制NRG1-Mediated树突和皮质抑制性神经元的兴奋性突触生长

我们使用混合初级皮层神经元文化源自E16/17小鼠胚胎作为我们的模型系统,其中包含兴奋性和抑制性神经元。标签和识别大脑皮层抑制神经元,我们用质粒转染培养神经元表达绿色荧光蛋白(GFP)的增强器元素distal-less同源框(DLX) 5基因表达在大多数的前脑抑制性神经元(14]。然后我们cotransfected之前验证控制成分或DISC1 shRNA质粒一起DLX5/6-GFP到天在体外(DIV) 7个神经元56]。我们对待文化NRG1(或PBS控制)两天开始在DIV21 DIV19和分析细胞。我们发现推倒DISC1 puncta密度表达式没有造成变化的兴奋性突触前标记,水泡谷氨酸转运体1 (VGLUT1),主要在胞体和树突相比控制shRNA-treated神经元(补充图1 a - c在网上补充材料http://dx.doi.org/10.1155/2016/7694385)。此外,我们发现控制shRNA-expressing神经元接受NRG1显示增加VGLUT1 puncta密度主树突,符合一个以前的报告16)(图1(一)和1 (c))。来确定DISC1扮演了一个角色在这个过程中,我们在神经元接受NRG1撞倒了DISC1,发现NRG1-mediated增加VGLUT1 puncta密度完全废除(补充图1 a - c)。

接下来,我们决定如果NRG1通过DISC1调节皮质抑制性神经元的树突增长。使用相同的文化进行分析,我们拍摄完成个人GFP-labelled皮质抑制性神经元的树突形态。使用Sholl分析,我们决定推倒DISC1导致树突形态在接受pbs细胞减少(补充图1 d-f)。此外,我们认为NRG1治疗两天导致增加树突形态,这是废除DISC1表达式时减少使用成分(补充图1 d-f)。总的来说,这些结果表明,NRG1调节皮质抑制性神经元的树突和突触生长,需要DISC1表达式来调节这些影响。

3.2。NRG1调节DISC1表达式和本地化Glutamatergic皮质抑制性神经元的突触

补充图1中的结果表明NRG1调节大脑皮层抑制树突和突触生长;然而,这些实验是DISC1的警告是撞倒了是非的兴奋性和抑制性神经元由于我们使用的文化。因此,在后续的实验我们具体操纵DISC1水平在皮质抑制性神经元构造使用谷氨酸脱羧酶(GAD67)启动子驱动单独GFP的表达和DISC1 (gfp)。GAD67表示在所有前脑GABA-ergic神经元是病原反应酶谷氨酸GABA(转换的59]。此外,据报道,大多数DLX5-expressing皮质抑制性神经元也表达GAD67 [14]。疣状皮质文化的转染gfp证实GFP-positive神经元表达内源性GAD67(图1(一))。

鉴于潜在关系NRG1 DISC1我们发现了,我们想确定NRG1专门治疗调节DISC1皮质抑制性神经元中表达。之前它已经表明NRG1治疗皮质神经元的文化导致增加DISC1水平通过ErbB2/3-mediated机制,最有可能反映DISC1水平在兴奋性神经元占80 - 90%的皮质神经元文化(49]。因此,我们假设NRG1也调节DISC1专门抑制性神经元中表达水平和本地化。使用定量免疫荧光,我们第一次发现NRG1治疗两天(从DIV19)发展的文化导致DISC1水平显著增加主DIV21皮质抑制性神经元的树突和胞体相比,车辆治疗(PBS)(数据1 (b),1 (c),1 (f)),这表明增长NRG1对抑制性神经元的影响可能需要DISC1。鉴于这个结果,我们接下来问NRG1-induced增加DISC1表达式是本地化对抑制性神经元兴奋性突触为VGLUT1染色。VGLUT1的数量或double-positive DISC1 / VGLUT1 puncta的胞体和树突主要gfp阳性抑制性神经元被量化。我们发现NRG1治疗导致的数量显著增加VGLUT1-positive兴奋性突触主要在胞体和树突(数字1 (b),1 (d),1 (g))。此外,我们发现了一个显著增加double-positive DISC1 / VGLUT1 puncta在皮质抑制性神经元胞体和主树突(数字1 (b),1 (e),1 (h))。这些数据表明NRG1刺激就足以提高DISC1水平和定位其表达抑制性神经元兴奋性突触形成。此外,西方墨点法培养皮层神经元接受NRG1 DIV3和4显示,VGLUT1和DISC1水平略有增加车辆(PBS)对待文化相比,尽管这并不重要(图1(我))。

3.3。NRG1函数通过DISC1 Glutamatergic调节突触发生在大脑皮层抑制神经元

在老鼠大脑,NRG1受体ErbB4主要是局部GABA-ergic中间神经元的突触后密度接收glutamatergic输入,它调节兴奋性突触的形成和成熟17]。调查是否DISC1作品的下游NRG1-ErbB4调节兴奋性突触的形成到皮质抑制性神经元,我们检查了VGLUT1免疫荧光在初级皮层文化。皮质文化是转染gfp在DIV 7和对待NRG1或PBS两天,开始DIV 19。文化被固定在DIV21和分析。量化的离散puncta VGLUT1 DIV21皮质抑制性神经元表达的免疫反应性gfp透露,NRG1治疗导致puncta密度显著增加主要在胞体和树突(数字2 (b)- - - - - -2 (d))。Coexpression的绿色荧光蛋白的质粒表达完整的鼠标DISC1 GAD67启动子的控制(-DISC1FL)透露,在抑制性神经元表达DISC1FL基线条件(PBS)没有影响VGLUT1 puncta密度相比-GFP-only控件(数据2 (b)- - - - - -2 (d))。苏格兰DISC1突变研究中,我们使用一个c端截断鼠标DISC1突变(DISC1DN)(图2(一个))。终止密码子的突变发生在同源区域发现的易位断点在人类DISC1苏格兰血统(50]。当在老鼠,这种突变在占主导地位的消极的方式通过绑定和野生型(WT) DISC1的再分配,导致神经缺陷迁移,树突的形成,和皮质小清蛋白水平降低50,53,54]。我们cotransfected绿色荧光蛋白的质粒表达DISC1DN GAD67启动子的控制(-DISC1DN)相比,其表达在皮质DISC1FL抑制性神经元,并没有发现生产总值(gdp)表达水平的差异(图2 (c))。DISC1FL和DISC1DN质粒在后续实验,我们发现在抑制性神经元表达DISC1DN基线条件(PBS)显著降低VGLUT1 puncta主树突上,但不是在胞体(数字2 (d)和2 (e)),这表明DISC1苏格兰突变削弱兴奋性突触发生在大脑皮层抑制性神经元在基线条件。然后我们做了相同的实验在NRG1刺激2天(从DIV19)。我们发现的表达-DISC1DN完全封锁了NRG1-induced增加VGLUT1 puncta密度主树突轴和胞体(数字2 (d)和2 (e))。这些数据表明,抑制DISC1尤其是皮质抑制性神经元块NRG1-induced影响glutamatergic突触发生。综上所述,这些研究结果表明细胞自动角色NRG1-DISC1发展中皮质抑制性神经元的信号。然而,重要的是要注意,虽然截断DISC1模仿苏格兰突变患者中发现,我们的超表达范式不概括患者有一个完整的DISC1等位基因等位基因杂合性。

3.4。NRG1函数通过DISC1调节皮质抑制性神经元树突增长

鉴于我们之间发展关系的识别NRG1 DISC1在抑制性神经元兴奋性突触发生,我们检查这是否延伸到神经元形态。虽然NRG1和DISC1已经发现独立调节皮质神经元树突增长,目前还不清楚他们是否调节这一过程在一起(15,48]。因此,阐明功能之间的交互NRG1和DISC1皮质抑制性神经元树突增长,我们对表达的影响-DISC1FL或在基线(PBS)和NRG1 -DISC1DN治疗条件。皮质文化cotransfected了gfp,要么-DISC1FL或-DISC1DN DIV7。文化被接受NRG1或PBS DIV21 DIV19和固定和分析上。Sholl分析显示,在基线条件下,表达的-DISC1FL树突生长无显著影响,而-DISC1DN表达显著减少树突增长(数字3(一个)- - - - - -3 (c))。类似于先前的报道,我们发现刺激的文化NRG1抑制性神经元树突增长和复杂性(数字3(一个)- - - - - -3 (c))。我们接下来问这是否NRG1-dependent效果需要DISC1函数。Sholl分析显示表达的-DISC1FL或-DISC1DN封锁了NRG1-induced影响树突增长,导致树突增长相比明显降低控制NRG1治疗条件下(数字3(一个)- - - - - -3 (c))。这些数据表明,DISC1DN突变影响尤其是皮质抑制性神经元树突增长,暗示一个细胞自动DISC1的作用在调节树突生长在这个细胞类型。此外,观察到的超长篇DISC1或突变截断DISC1抑制NRG1-induced树突增长表明NRG1信号的复杂性。

3.5。ErbB4和皮质抑制性神经元DISC1互动

迄今为止我们的数据表明,NRG1需要DISC1抑制性神经元树突和突触glutamatergic增长的某些方面;然而,我们不知道是否DISC1函数直接下游ErbB4 NRG1的受体。DISC1和ErbB4分享很多约束力的合作伙伴在突触后密度(15,44,45];因此,我们假设DISC1可能身体与ErbB4交互。最近的一项研究表明,DISC1扮演了一个角色在调节ErbB4之间的交互和突触后蛋白质,PSD95尤其是成熟皮层(55]。然而,是否DISC1 ErbB4受体结合特别是发展中抑制性神经元,如果NRG1调节这一过程,仍然未知。我们首先采取了生物化学的方法来测试使用不同的细胞系统(HEK293英尺细胞)。我们表示ErbB4,激酶死ErbB4 (ErbB4 KD),或DISC1-GFP单独或DISC1-GFP + ErbB4或DISC1-GFP + ErbB4 KD在HEK293细胞,GFP immunoprecipated,使用一个ErbB4抗体确定DISC1绑定。我们发现当DISC1-GFP ErbB4在HEK293细胞中都有表达,我们发现两个蛋白质之间的相互作用,证明他们可以直接绑定(图4(一)星号)。有趣的是,我们发现这种交互是减少激酶死版的ErbB4表示时,指示DISC1可能需要NRG1激活细胞内的ErbB4绑定(图4(一))。然而,之间的交互DISC1 ErbB4并没有改变在NRG1刺激可能是因为过表达ErbB4受体self-dimerizes,导致transactivation [60]。虽然这些实验表明ErbB4可以绑定DISC1,这些结果不延长抑制性神经元。考虑到只有10 - 25%的培养皮层神经元抑制性神经元,传统coimmunoprecipitation实验将无法检测抑制性神经元中特定的相互作用。因此,我们用另一种方法来克服这个问题,研究具体的互动-GFP-positive培养抑制性神经元。

为此,我们进行了接近结扎试验(PLA) DIV21皮质文化转染DIV7 gfp(数字4 (b)- - - - - -4 (d))。解放军是可视化的方法,允许固定细胞内源性蛋白质-蛋白质之间的关系和结果在一个点状的荧光信号中的蛋白质是40 nm的彼此。分析解放军皮层信号密度抑制性神经元的表达gfp透露,NRG1导致解放军信号密度显著增加而接受pbs控制主要在胞体和树突(数字4 (b)- - - - - -4 (d))。信号密度在PBS治疗细胞没有和控制计划的条件不同,主要抗体被忽略(数字4 (b)- - - - - -4 (d))。我们还发现解放军GFP-inhibitory神经元之外的信号,我们DISC1绑定属性ErbB4低水平的兴奋性神经元(图4 (b)左下方面板)。以生化和解放军的结果在一起,他们证明ErbB4结合DISC1这NRG1刺激增加发展中皮质抑制性神经元的相互作用。这表明DISC1可以招募激活ErbB4 NRG1绑定ErbB4和初始的一部分信号级联的下游NRG1-ErbB4在开发过程中。

4所示。讨论

皮质抑制性神经元的发展是至关重要的正常的认知过程,并破坏这些细胞的发育和功能与神经发育和精神疾病。然而,由于他们的发展不是很好理解,重要的是要更好地了解信号的机制,调节抑制树突和突触的生长。我们的研究显示,NRG1-ErbB4信号函数通过DISC1调节树突增长和皮质抑制性神经元兴奋性突触的形成。具体来说,我们发现NRG1刺激增加DISC1水平及其本地化兴奋性突触的初级皮层抑制性神经元的树突的可能机制的发育影响NRG1树突增长和兴奋性突触发生在大脑皮层抑制神经元。此外,我们表明,NRG1-ErbB4信号通过DISC1发育调节神经元兴奋性突触发生在大脑皮层抑制。第三,我们表明,NRG1-ErbB4信号通过DISC1调节皮质抑制性神经元树突增长的发展。最后,我们表明,NRG1刺激促进绑定ErbB4 DISC1的皮质抑制性神经元。

这项研究的结果是一致的在体外NRG1研究表明NRG1调节树突增长和兴奋性突触发生在大脑皮层抑制中间神经元(15,16]。在活的有机体内数据来自两个不同的条件皮层抑制特异性神经元ErbB4基因敲除小鼠模型显示减少VGLUT1 puncta密度对海马中间神经元进一步印证了我们的发现(17,30.]。本研究中的数据提供了一个潜在的机制调节的影响NRG1信号在大脑皮层抑制神经元的发展,即DISC1 NRG1-Erbb4下游信号功能。卡希尔等人于2012年一项研究阐明机制即NRG1-ErbB4信号调节皮质抑制性中间神经元树突增长通过放纵RAC1-GEF Kalirin-7 [15]。有趣的是,Kalirin-7也是一个绑定合作伙伴DISC1的突触后密度(PSD) (46),这表明ErbB4、DISC1 Kalirin-7可能在大脑皮层形成一个功能复杂的抑制性神经元调节树突增长,并为进一步的研究提供了一个大道到下游NRG1信号机制。

在这项研究中,我们对一个潜在的机制DISC1介导NRG1-ErbB4信号的影响,其中NRG1-ErbB4信号调节DISC1水平主皮质抑制性神经元的树突。这符合瑟哈德里和他的同事在2010年的一项研究显示,治疗的主要鼠皮质神经元NRG1增加130 kDa的表达同种型DISC1的初级皮层神经元的树突(49]。然而,这种效应被发现由ErbB2/3形成,可能反映了从大脑皮层兴奋性神经元的大量文化(~ 80 - 90%),因为他们没有隔离抑制性神经元(49]。此外,由于ErbB4表达更高的抑制性神经元的兴奋性神经元(17,26- - - - - -28),难怪NRG1兴奋性神经元需要ErbB2/3 DISC1的监管水平,而不是ErbB4。我们也表明NRG1刺激增加colocalization DISC1 VGLUT1皮质抑制性神经元,这表明NRG1刺激兴奋突触联系抑制性神经元定位DISC1发展。因此,我们的研究提供了第一个证据,NRG1调节DISC1发展中皮质抑制性神经元的表达和定位。然而,这是否进行转录,平移或转译后的水平还有待在将来的研究中阐明。

DISC1的角色在精神疾病仍然是有争议的;然而,许多生物研究表明DISC1在皮质的发展中扮演重要角色(44,46,50,55,56]。很少有研究在皮质DISC1抑制性神经元的功能(61年,62年];因此扮演什么角色在他们的发展仍不清楚。我们的研究提供了第一份报告DISC1调节树突增长和glutamatergic突触形成专门皮质抑制性神经元在神经发育。我们将展示使用-DISC1DN构造,这表达了一个占主导地位的否定形式GABA-ergic DISC1的神经元,DISC1调节树突细胞自动的方式增长。此外,inhibitory-specific表达的显性负DISC1突变和inhibitory-specific超表达的完整DISC1都能够废除对树突arborisation NRG1-induced影响,这表明一个最佳水平的NRG1-ErbB4信号为适当的树突增长是必要的。支持这个假说的研究两个突变NRG1鼠标菌株,与cysteine-rich域——(CRD) NRG1水平升高在皮质锥体神经元和CRD-NRG1水平降低,都能够扰乱excitatory-inhibitory平衡的神经传递63年]。相比之下,表达的显性负DISC1突变,但不是长篇DISC1,能够阻止NRG1-induced影响glutamatergic突触发生在大脑皮层抑制性神经元在目前的研究。这表明NRG1-ErbB4-DISC1信号可能调解对枝晶生长和兴奋性突触发育的影响通过两种不同的机制在大脑皮层抑制神经元。NRG1-ErbB4信号被发现调节突触成熟和树突增长通过两个不同的机制在海马鼠标文化57]。具体来说,监管的成熟的海马神经元突触联系ErbB4-positive ErbB4是依赖于细胞外的域和PDZ主题,而酪氨酸激酶域是不需要57]。相比之下,ErbB4调节树突增长通过酪氨酸激酶域和PI3激酶信号(57]。DISC1下游NRG1-ErbB4刺激可能执行不同的功能取决于它与不同的ErbB4域(PDZ或酪氨酸激酶域)或它的交互与其他ErbB4绑定蛋白优先结合PDZ或酪氨酸激酶域。

ErbB4 DISC1共同绑定合作伙伴在突触后密度,包括PSD95和Kalirin-7 [15,46,47]。然而,ErbB4之间的物理相互作用和DISC1没有检查到目前为止在初级抑制性神经元由于难以分离大量纯化的细胞兴奋性神经元(缺乏)。在这里,使用一个替代技术(接近结扎试验),我们已经表明,NRG1刺激促进绑定ErbB4 DISC1的皮质抑制性神经元。需要进一步的调查,以确定哪些蛋白质域是重要的对于这种交互和NRG1-induced影响大脑皮层抑制神经元发展和Kalirin-7是否也参与了这个复杂的。此外,这将是重要的理解DISC1的潜在机制发育开关调节ErbB4信号在开发过程中与成熟的皮层,这些角色可能相反。

NRG1函数,而我们的研究提供了一种机制在抑制性神经元的发展过程中,它强调潜在的差异与成熟的皮质NRG1信号。瑟哈德里等人最近报道,DISC1负调节ErbB4信号,,DISC1去除后,有增加磷酸化ErbB4和绑定PSD95 (55]。这些结果与我们的研究结果,这表明DISC1积极调节ErbB4信号。然而,这可以解释为不同时间点在脑功能检查,因为我们检查神经发育年龄而瑟哈德里等人研究了抑制性神经元成熟的皮层的功能。此外,扰乱DISC1函数方法的差异也可以解释潜在的差异。例如,我们的研究使用DISC1的占主导地位的否定形式模型苏格兰突变,而瑟哈德里等人研究使用成分和DISC1淘汰赛转基因小鼠模型。这也凸显出苏格兰突变可能不是准确建模DISC1的完全丧失功能。未来的研究需要梳理NRG1-ErbB4监管由DISC1的确切机制在不同的发育和成年抑制性神经元函数的时间点。

5。结论

总之,本研究阐明小说融合NRG1-ErbB4信号和DISC1到一个共同的信号通路调节皮质抑制性神经元的发展。NRG1、ErbB4和DISC1候选人schizophrenia-associated风险基因19- - - - - -21,23,34- - - - - -41),这项研究的结果不仅揭示了分子机制管理皮质抑制性神经元的正常发展,也可以提供洞察潜在精神疾病的异常流程。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突。

确认

作者要感谢戈登博士Fishell DLX5/6-GFP的构造和格拉迪克里斯多博士绿色荧光蛋白结构。这项工作是支持由加拿大自然科学和工程研究理事会(NSERC), j.p. Bickell基金会和苏格兰仪式慈善基金会卡鲁恩河k·辛格。

补充材料