电针通过小泡蛋白-1介导的分子通路对大鼠脑出血起神经保护作用

摘要

自发性脑出血（ICH）是最具破坏性的中风类型之一。在这里，我们旨在证明电针百会穴（GV20）通过caveolin-1/基质金属蛋白酶/血脑屏障通透性通路可能对急性脑出血有神经保护作用。采用胶原酶VII建立脑出血模型。大鼠随机分为假手术组、假电针组和电针组。每组进一步分为两组根据6个时间点分为4个亚组 h、 一, d、 三, d、 和7 方法包括根据Longa量表检查神经功能缺损评分，通过伊文思蓝含量测量血脑屏障通透性，原位脑内小窝蛋白-1的免疫荧光检测，脑内小窝蛋白-1的westernblot分析，以及原位酶谱法测定脑基质金属蛋白酶2/9活性。而虚假的电针刺激组、电针刺激组导致显著改善神经功能缺损评分和伊文思蓝含量减少,表达caveolin-1,和活动的矩阵metalloproteinase-2/9 6 h, 1 d、3 d、7 d后我()．综上所述，电针GV20可改善脑出血后神经功能缺陷评分，降低血脑屏障通透性，其作用机制可能针对小泡蛋白-1/基质金属蛋白酶/血脑屏障通透性通路。

1.介绍

脑出血(Intracerebral hemorrhage, ICH)是人类死亡的主要原因之一，其发病率、致死率和致残率都很高，占世界范围内所有中风的10%~15% [1.]．脑出血的总发病率为24.6 / 10万人年，1个月的中位病死率为40.4% [2.]．即使在强震中幸存下来，大多数患者的神经功能缺陷仍然存在，6个月后独立的患者不超过40% [2.]在过去的二十年中，越来越多的动物和临床研究被用来确定脑出血引起的脑损伤的机制，脑损伤被认为是由原发性损伤和继发性损伤组成的[3.]．根据原发损伤，应清除血块或防止血肿扩大，以减少血肿对机体的影响。然而，对于大多数脑出血患者来说，凝块清除的有效性尚不确定，使用重组激活因子VII等止血药物存在较高的血栓栓塞风险，而对无凝血病的脑出血患者没有明确的临床益处[4.]此外，尽管有一组潜在的治疗靶点可用于预防ICH继发性脑损伤，但相关建议仅为症状和支持性建议[4.]．因此，越来越多的患者采用补充替代药物治疗脑出血。

针灸作为CAM的一种形式，在世界范围内有着悠久的历史[5.]，其治疗中风的疗效是公认的[6.]．头皮针灸是在传统针灸科学基础上结合现代解剖学、神经生理学和生物全息理论发展起来的一门新的针灸学科[7.]．属于微穿刺系统，采用丝状针穿透头皮特定刺激区域[8.]．历史上，SA已经被用于治疗各种疾病数千年，通过针刺和刺激头皮的特定区域，但SA在最近几十年发展如此迅速。1983年，世界卫生组织西太平洋区域委员会委托中国针灸协会编制了SA针线标准命名方案。在1984年、1985年和1987年，经过标准化工作组的讨论，达成了共识，并命名为《拟议的国际针灸命名标准:3.6头皮针灸线》。1989年，世卫组织举行的一次科学小组会议正式通过了这一计划。1991年，SA系列的正式版本出版[9]．我们组的一项荟萃分析显示，SA可能可以改善急性脑出血患者的神经缺陷[10]．此外，在大鼠模型中，GV20被认为是急性脑出血最重要的穴位[11]．然而，SA对急性脑出血的作用机制尚不完全清楚。

血脑屏障(血脑屏障)在脑出血继发性脑损伤中起着重要作用。一系列的因素，如凝血酶、趋化因子和基质金属蛋白酶(MMPs)，都与血脑屏障破坏的诱导有关[12–14]．因此，阻断多条通路或阻断共同末端通路等防止血脑屏障破坏是预防脑出血损伤的主要方法。小泡蛋白-1 (Caveolin-1)是细胞质膜中小泡的主要结构蛋白[15]在内皮细胞、成纤维细胞、上皮细胞和平滑肌细胞中含量特别丰富[16]．Cav-1具有许多重要的功能，如调节各种信号分子，参与细胞胆固醇运输，维持体内稳态[17]．cav1也被认为是大脑微血管内皮细胞紧密连接相关蛋白表达的调控[18]．此外，有报道称，在实验性脑缺血/再灌注损伤中，Cav-1在调节血脑屏障通透性方面发挥重要作用[19,20.]这些证据表明Cav-1可能在脑卒中后的脑损伤中起重要作用。

MMPs是一簇蛋白水解含锌酶，可降解脑血管和神经元周围的细胞外基质[21]．此外，基质金属蛋白酶可通过降解紧密连接蛋白提高血脑屏障的通透性[22]．人们认为MMPs的激活是BBB打开的关键步骤[22]．MMPs抑制剂BB-1101可显著降低ICH模型脑水和钠含量[23]．我们之前的研究表明，mmp的活性可被Cav-1调控，血脑屏障的通透性可通过Cav-1/ mmp途径调控[19]．因此，在本研究中，我们假设电针百会(GV20)可能通过Cav-1/MMP/BBB通透性途径对急性脑出血起神经保护作用。

2.材料和方法

2．1．道德声明

所有动物实验均按照美国国立卫生研究院发布的《实验室动物护理和使用指南》(出版物编号85-23)进行。所有动物实验方案均经温州医科大学地方伦理委员会批准和规范(编号wydw2014-0104)。实验结束时全部动物麻醉处死。

2.2.动物、分组和ICH模型的诱导

雄性成年Sprague-Dawley（SD）大鼠来自上海实验动物中心（编号：上海SCXK，2013-148）。大鼠随机分为三组：假手术组、假电针（EA）组和电针组。每组根据6个时间点进一步分为4个亚组 h、 一, d、 三, d、 和7 如前所述，使用胶原酶VII建立脑出血模型[24]．简单麻醉SD大鼠，10%水合氯醛腹腔注射(400 mg/kg)。刮毛和常规消毒后，将大鼠置于立体定向框架中。纵向切开头皮，中线0.8 cm切口，在头盖骨后0.2 mm，外侧2.9 mm处用牙钻在颅骨上凿一个0.8 mm的单孔。然后用直径0.7 mm的无菌针头向下刺入右尾状核腹侧6mm处。生理盐水3μ含胶原酶VII的L 0.6 U/μSham EA组和EA组大鼠右侧尾状核注射L。然后取出针头，将头皮缝合在一起。所有老鼠都被允许自由获得食物和水。假手术组在不注射胶原酶VII的情况下，对大鼠进行相同操作。

２．３．EA治疗

EA治疗是按照我们组之前公布的方法学标准进行的[25]．将动物固定在框架上后，将直径0.25 mm的无菌针灸针插入向曲宾方向的GV20 (GB7)中，另一针插入紧固于尾部的湿纱布中。然后将两针均连接到G-6805型EA刺激器上。针的刺激强度为0.2 mA，频率为2 Hz，刺激时间为30 min。脑出血后各组给予电刺激治疗，每日1次，直至处死大鼠。因此，EA对ICH大鼠在6 h、1 d、3 d、7 d组的治疗次数分别为1次、2次、4次、8次。假电刺激组在治疗穴位上用假电刺激固定在框架上，不穿刺，不电刺激。每组每天治疗1次，直至处死大鼠。

２.４.神经功能缺损评分

在脑出血后6 h、1 d、3 d和7 d，由一名对实验设计不知情的研究者根据Longa等人之前描述的5分量表评估神经缺陷评分[26]，得分0表示无神经功能障碍;1分轻度局灶性神经功能障碍(伴对侧前肢屈曲);2分中度局灶性神经功能障碍(向对侧旋转);重度局灶性神经功能障碍(向对侧下降);得分4，没有自发活动，意识水平低下或死亡。得分越高的大鼠表现出越严重的神经缺陷。只有在脑出血后6小时评分为1 - 3的大鼠被认为是成功的模型，并在本研究中使用。

2．5．血脑屏障渗透率的测量

以伊文思蓝(Evans Blue, EB)含量为指标，观察EA对血脑屏障通透性的影响。麻醉后静脉注射2% EB染料4 mL·kg^−1.通过股静脉。90分钟后，经左心室灌注生理盐水250ml，取脑解剖。称量每个半球，放入3ml甲酰胺中，37℃水加热24 h。然后样品在5000 rpm下离心20分钟，然后在10000 rpm下离心10分钟。用分光光度计在632 nm波长下测定上清液的吸光度。

2.6。原位脑组织中Cav-1的免疫荧光检测

冰冻的冠状血肿切片用于原位免疫荧光化学检测Cav-1。切片用含0.2% Triton (Sigma)和50 mM磷酸盐缓冲液(PBS)的缓冲液处理5分钟，抗原回收缓冲液处理5分钟，10%驴血清处理1小时，然后用多克隆兔Cav-1 (1: 400;CST)在4°C过夜。PBS冲洗后，用Alexa 488山羊抗兔二抗(1:40 0;一种荧光标记的驴抗兔IgG (H+L)抗体，在37℃下孵育1 H。Alexa Fluor®染料，这些抗体偶联提供非常明亮的抗体偶联。切片用抗褪色安装介质(Beyotime)安装。使用尼康荧光显微镜在恒定曝光下获得图像。

2.7。Western Blot分析脑内Cav-1

大鼠深度麻醉，经心脏灌注生理盐水。然后迅速将大脑从颅骨中取出，储存在−80°C，直到下一步。从整个冰冻冠状切片中提取的变性蛋白样品在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶中溶解，转移到聚偏氟乙烯膜(Invitrogen公司)。阻断后，用多克隆兔Cav-1在4℃下孵育过夜(1:1000;CST)，然后与山羊抗兔辣根过氧化物酶结合的二抗孵育(1:5000;柏妘生物技术)。在成像系统(MicroChemi)下用ECL先进的western blotting检测试剂进行化学发光检测。

2.8。原位酶谱法测定脑内MMP-2/9活性

大鼠深度麻醉后经心脏灌注生理盐水，再灌注4%多聚甲醛。大脑在4°C的4%多聚甲醛中过夜后固定。组织在最佳切割温度复合中冷冻，在−80°C保存至切片。将组织切成冠状μm厚切片使用冷冻机(Thermo山东)。测定冰冻脑切片MMP-2/9的溶胶活性原位按照制造商的说明，使用EnzCheck胶原酶试剂盒（Invitrogen）进行酶谱分析。冷冻脑切片与含有0.8%葡萄糖的1x反应缓冲液孵育 在37°C下过夜，mg/mL FITC标记的DQ明胶。明胶被MMP-2/9切割并产生肽，其荧光强度被检测为MMP-2/9凝胶溶解活性的代表。荧光强度在恒定暴露条件下用荧光显微镜测量。

2.9。统计分析

所有数据均以均数±标准差(mean±SD)表示。采用SPSS 15.0统计软件进行统计学分析。多组实验采用单因素方差分析(ANOVA)进行比较，多组内两组比较采用Dunnett检验。显著性水平设为.

3.结果

３．１．EA改善神经功能

假操作的大鼠没有显示出明显的神经缺陷。脑出血后6 h神经功能评分升高，1 d达到峰值，然后逐渐下降。与假手术组比较，假手术EA组在脑出血后6 h、1 d、3 d、7 d时间点有显著性差异()．与Sham EA组比较，EA组在脑出血后6 h、1 d、3 d、7 d有显著性差异()．与假手术组比较，EA组在脑出血后6 h、1 d、3 d有显著性差异()(图1.)．

３.２．EA减少血脑屏障破坏

脑出血后6 h脑内EB含量升高，1 d时达到峰值，7 d时逐渐下降，但仍高于正常水平。与假手术组比较，假手术EA组在脑出血后6 h、1 d、3 d、7 d时间点有显著性差异()．与Sham EA组比较，EA组在脑出血后6 h、1 d、3 d、7 d有显著性差异()．与假手术组比较，EA组在脑出血后6 h和1 d有显著差异()(图2.)．

３．３．EA下调Cav-1的表达

免疫荧光和免疫印迹结果显示，小泡蛋白-1在ICH后6 h表达增加，1 d时达到峰值，随后逐渐下降，但在7 d时仍高于正常水平。与假手术组比较，假手术EA组在脑出血后6 h、1 d、3 d、7 d时间点有显著性差异()．与Sham EA组比较，EA组在脑出血后6 h、1 d、3 d、7 d有显著性差异()．与假手术组比较，EA组在脑出血后6 h、1 d、3 d、7 d有显著性差异()(数据3.和4.)．

3．4．EA降低MMP-2/9活性

MMP-2/9活性检测采用免疫组化法原位zymography。结果显示，脑出血后6 h MMP-2/9活性升高，此后仍高于正常水平，无下降或上升趋势。与Sham EA组比较，EA组和假手术组在脑出血后6 h、1 d、3 d、7 d时间点均有显著性差异()．与假手术组比较，EA组在脑出血后1 d ()(图5.)．

4.讨论

本研究表明，电针对GV20有改善急性脑出血大鼠神经功能、降低血脑屏障通透性的作用。本研究还提供了EA下调ICH模型大鼠Cav-1表达及MMP-2/9活性的机制。这些数据支持EA通过Cav-1/MMPs/BBB渗透通路对急性脑出血起神经保护作用的假设。

电针灸是在传统针灸与现代电疗结合的基础上发展起来的一种针灸技术。EA具有多种优势，因为它的刺激参数易于量化，如频率、强度和持续时间[27]．GV20穴属于督经(政府脉)。它位于连接两耳尖的线与头部中线的交点，根据针灸理论和WHO的定义，位于后发际正上方7寸，前发际后5寸[28]．根据中医理论，百会位于头部的最高位置，所有阳经的交汇处[29]．GV20具有补阳、提气、升脾、消内风、清心、促复苏的作用[30.]．因此，GV20被专门用于治疗精神和神经疾病，如中风、头晕、头痛和焦虑。我们之前的研究显示，基于GV20的针灸可以显著减少神经缺陷和脑水肿，并可能在脑出血和中风的动物模型中具有潜在的神经保护作用[11]．而且，通过GV20向GB7穿刺作为基于GV20的头皮透针的一种，不仅是脑卒中SA最重要的分支之一，也是最常用的针刺方法，具有定位方便的优点[7.]．因此，本研究采用头针GV20向GB7方向治疗实验性ICH。

脑出血的临床前模型对于了解出血损伤的基本机制和随后的功能恢复以及潜在治疗的初步试验都是至关重要的。到目前为止，了解ich微球囊植入、自体血液注射和胶原酶注射模型的生理学主要有三种模型。每种模式都有自己的优点和缺点。微球囊的插入可以显示预设体积的质量效应，但它不能产生血液元素的毒性等因素，并导致血脑屏障破坏[31]．可控制质量大小的自体血液注射用于研究质量效应和血液制品的效果。但缺点是不能模拟出血肿块的增长，而出血肿块的增长在脑出血的病理过程中经常发生[32]．胶原酶注射模型克服了上述缺点，较好地模拟了自发性脑出血，但其缺点是小血管弥漫性出血，而不是脑出血患者发生的动脉源性出血[31]．因此，我们采用胶原酶注射模型进行研究。

Cav-1在脑损伤中起着重要作用。在我们的研究组中，我们发现Cav-1缺失的Cav-1 KO小鼠在缺血再灌注损伤期间比野生型小鼠具有更高的BBB通透性。此外，维持BBB完整性的分子机制中，Cav-1通过抑制MMPs活性发挥重要作用在我们以前的研究中已经报道了TJ蛋白在脑缺血再灌注损伤中的保护作用[19]．然而，目前关于Cav-1在急性脑出血中的表达和功能的报道很少。一项研究报道，小鼠脑出血后1天Cav-1上调[33]，而另一项研究报道，大鼠脑出血后1 d Cav-1下调，3 d和7 d上调[34]．因此，急性脑出血中Cav-1的表达是增加还是减少，目前尚无定论。我们的实验结果表明，Cav-1的表达在ICH后6 h开始升高，1 d时达到峰值，然后下降，但在7 d时仍高于假手术组。提示脑出血导致脑内Cav-1上调。此外，与Sham EA组相比，EA治疗组在各观察时间点均有显著性差异，提示GV20电刺激可降低脑出血急性期Cav-1的表达，发挥脑出血模型大鼠的神经保护作用。

众所周知，脑出血后MMP-2和MMP-9的表达均增加[35,36]．临床研究发现，急性脑出血后MMP-2和MMP-9水平均升高，且MMP-9升高与急性期血肿周围水肿和神经系统恶化有关[37,38]．本研究表明，在所有观察时间点，脑出血均显著增加MMP-2/9的活性，电针治疗显著抑制脑出血诱导的脑内MMP-2/9的活性。

综上所述，本研究证实GV20电针可改善脑出血后神经功能缺损，降低血脑屏障通透性，其机制可能针对Cav-1/MMP/血脑屏障通透性通路。

相互竞争的利益

两位作者都没有潜在的竞争利益需要披露。

作者的贡献

李惠勤、李彦和陈子贤对这项工作做出了同样的贡献。

致谢

本项目得到中国国家自然科学基金（81573750/81473491／81173395／H2902）资助；中国省浙江省市中青年学科带头人（2013277）；浙江省高层次卫生人才培养方案（2015）。

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