Myh14的缺失增加了CBA/CaJ小鼠对噪声性听力损失的易感性

摘要

MYH14是肌凝蛋白家族的一员，参与了许多运动过程，如离子通道门控、细胞器易位和细胞骨架重排。MYH14突变导致dfna4型听力损害。进一步的证据也表明MYH14是噪声诱发听力损失(NIHL)的候选易感基因。然而，MYH14在听觉功能和NIHL中的具体作用尚不完全清楚。在本研究中，我们使用CRISPR/Cas9技术建立了一个Myh14敲除小鼠系，CBA/CaJ背景(现称Myh14)^−/−并阐明MYH14在耳蜗和NIHL中的作用。我们发现Myh14^−/−小鼠直到5个月大时才表现出明显的听力损失。此外,Myh14^−/−与对照组相比，小鼠更容易受到高强度噪音的影响。在Myh14中观察到更明显的外毛细胞丢失^−/−比野生型小鼠在听觉损伤后的表现要好。本研究结果提示Myh14可能在CBA/CaJ小鼠听觉过度刺激后的耳蜗保护中发挥有益作用。

1.介绍

噪音性听力损失(NIHL)现已成为最普遍的职业伤害报告之一[1］.长期暴露在高强度噪音中会导致这种感音神经性听力障碍。目前，据估计，世界上大约有5亿人遭受这种危害[2］.nhl是一种可预防的缺陷，但一旦发生就很难逆转，因为失去的哺乳动物感觉细胞无法再生[3.- - - - - -6]因此，了解其发病机制已成为研究者的一项重要任务。此外，人们一直在努力阐明NIHL的分子和生化机制。

研究表明，声音过度刺激可能导致导致听力损失的发病机制和生化变化[7，8］.NIHL持续不断和不断发展的研究已经确定，噪声诱发耳聋的发生与某些基因、细胞代谢、细胞凋亡的变化有密切的关系[9等等。NIHL的发病机制非常复杂，确切的发病机制尚不清楚。一般来说，它是遗传因素和环境因素相互作用的结果[9- - - - - -11］.尽管付出了很多努力，但NIHL的研究进展缓慢，对人体NIHL的研究也很困难。没有进行遗传研究，因为暴露在相同噪音条件下的家庭几乎不可能收集到[12］.基因修饰小鼠是研究nhl发病机制的良好模型。近年来，在动物模型中发现了一些影响噪声易感性的基因[13，14].已开发的几种基因敲除小鼠系，包括Pjvk^−/−［15]，PMCA2^+/−［16]，P2RX2^−/−［17),而CDH23^+/−［18它们对噪音的敏感度要高于野生型。与此同时，更多的研究开始寻找新的NIHL易感基因，在内耳不同通路的基因中发现了数百个单核苷酸多态性位点。在两个独立的群体(瑞典和波兰)中，对53个候选基因中的644个snp进行了扩展分析;MYH14中的两个SNPs (rs667907和rs588035)导致波兰样本集的正相关，并与瑞典样本集的噪声暴露水平存在显著交互作用[19，20.]提示MYH14可能是NIHL易感基因[4，19］.

MYH14，也被称为非肌II重链(NMHCII-C)，与另外两条非肌链(MYH9和MYH10)一起，是肌凝蛋白家族的成员，涉及许多运动过程，如离子通道门控、细胞器易位和细胞骨架重排[21，22］.MYH14突变导致dfna4型听力损害。有趣的是，MYH14在结构上与MYH9和MYH10有很大的相似之处[22］.MYH14已被证明在耳蜗上皮细胞的神经细胞发生和顶端细胞连接的维持中发挥作用[23，24]然而，MYH14和NIHL之间的关系仍不清楚，它们在NIHL中的作用需要进一步分析[12］.

在我们的研究中，我们应用CRISPR/Cas9技术建立Myh14敲除小鼠系(Myh14^−/−)，使用CBA/CaJ背景应变。然后，我们研究了正常条件下和噪声环境下小鼠的听力阈值和形态学变化。我们发现Myh14^−/−小鼠直到5个月大时才表现出明显的听力损失。此外,Myh14^−/−与对照组相比，小鼠更容易受到高强度噪音的影响。在Myh14中观察到更显著的外毛细胞(OHC)丢失^−/−听觉损伤后的小鼠。这些数据表明Myh14的缺失可能增加对NIHL的易感性，Myh14可能在CBA/CaJ小鼠耳蜗声学刺激后的保护中发挥有益作用。

2.材料和方法

2．1．道德的声明

本研究使用的动物和实验步骤得到了山东大学动物伦理审查委员会的批准。严格按照山东大学动物伦理委员会标准(许可证号:ECAESDUSM 20123004)进行动物管理。

2.2. MYH14的产生^−/−老鼠

myh14缺陷小鼠使用CRISPR-Cas9基因组编辑技术生成，并在CBA/CaJ背景下维持。pX330和pST1374均来自Addgene(质粒ID分别为#42230和#44758)。如前所述，CRISPR-Cas9基因组编辑技术用于小鼠[25，26]简言之，对靶序列的一对寡核苷酸（5′-CCTGAAGAGAGAAGCGCAATA-3′）进行退火并连接到用酶消化的PX330BbsI．然后使用MEGAshortscript试剂盒(Ambion, Am1354, USA)体外转录(T7为启动子)生成sgRNA。hCas9 mRNA来源于pst1374 - n - nls -flag-link -cas9，使用mMESSAGE mMACHINE T7试剂盒(Ambion, Am1345, USA)合成，并用polyA尾链试剂盒(Life Technologies, USA)聚腺酐化。sgRNA和Cas9 mRNA均使用MEGAclear试剂盒(Ambion, AM1908, USA)纯化，并在RNase-free水中洗脱。

CBA/CaJ雌性小鼠超排卵后与CBA/CaJ雄性小鼠交配。然后，将雌性小鼠处死，将受精卵从输卵管中取出。纯化的sgrna (50 ng/μL)和hCas9mRNAs（100 ng/μL)共注入原核期卵的细胞质中。在注入原核阶段之后，孵育卵10分钟。然后将卵转移到假孕CD1雌性小鼠的输卵管内。基因组DNA是从新生幼犬的尾巴中提取的。利用Myh14正向引物5 ' -ACCTCGTGCTTGTTCAG-3 '和Myh14反向引物5 ' -TGTCTTCAGCAGGGTGT-3 '，通过PCR扩增gRNA靶位点周围的基因组DNA片段。获得的PCR产物直接测序或T/A克隆法克隆，然后进行测序鉴定突变。

2．3.潜在脱靶突变分析

CRISPR/Cas9技术可能存在脱靶效应。为了应对这种可能性，我们使用了网上的CRISPR设计工具(http://crispr.mit.edu)，以搜索脱靶轨迹。发现了Myh14基因的5个潜在脱靶位点。脱靶分析引物为Sin3b 5 ' -GCCAGGAGGTATATGAGAAC-3 '和5 ' -GAAATTTCCCCAGGAATGGACTGACA-3 ';Pcdh9 5 ' -GTGTACTTATAGCACTCACC-3 '和5 ' - ctaacgcggaaacacccacc -3 ';pat1 5 ' -CCACTGAGCCTTTCCTACCTTC-3 '和5 ' - gtaaattttagaaattttttttt -3 ';Arhgap27 5 ' -GAAGCTAGGCCAGCGGGCGAAAG-3 '和5 ' -CTGCCCATGGGCGGGGCTG-3 ';和Olfr1333 5 ' -GCGCTATACTGTCATCCTCAAC-3 '和5 ' -GCAAGCCAAGCTACGCACTG-3 '。利用上述PCR引物扩增新生幼犬基因组DNA片段。然后将获得的PCR产物直接测序或T/A克隆法克隆，并进行测序鉴定突变体。

２.４.蛋白提取液的制备及Western Blot分析

老鼠斩首;耳蜗很快被删除从冰冷的头骨和均质细胞裂解缓冲(10毫米三羟甲基氨基甲烷、液pH = 7.4, 1% Triton x - 100, 150毫米氯化钠,1毫米EDTA, PMSF和0.2毫米),然后细胞溶解30分钟在冰上,离心机在4°C 10000×g 30分钟。收集上清，用BCA试剂盒测定蛋白浓度。将样品与上样缓冲液混合，在100°C下加热5分钟，在−20°C下保存。蛋白质样品用10%十二烷基硫酸钠(SDS)聚丙烯酰胺凝胶分离，转移到PVDF膜上。用5%脱脂奶粉在TBS-T中室温封闭膜1小时，用一抗在4°C孵育过夜。用TBS-T洗涤后(3次，每次在室温下10分钟)，用抗兔酶标二抗(1:8 00,Cell Signaling, USA)在TBS-T中稀释5%脱脂奶粉，室温下孵育1小时。然后，用TBS-T洗涤膜(3次，每次10分钟)，用ECL Western blot检测试剂盒(Thermo, USA)检测条带。用5%牛血清白蛋白(BSA)稀释的一抗培养膜:兔抗肌球蛋白iia(1:10 00，美国)，兔抗肌球蛋白iib (D8H8)(1:10 00，美国)，兔抗肌球蛋白iic (D4A7)(1:10 00，美国)，兔抗β-肌动蛋白（1 : 5000，生物世界，中国）。

2．5．听觉脑干反应(ABR)测量

用戊巴比妥钠（50%）深度麻醉小鼠 mg/kg体重），并使用加热垫将体温保持在37°C。测试在隔音室中进行。将三个针状电极插入麻醉小鼠皮下：一个插入前额的耳朵之间，一个位于左外耳下方，一个位于尾部附近的背部。频率为4、8、16和32的点击和音调突发刺激 使用运行SigGen32软件（美国TDT）的Tucker-Davis技术系统（美国TDT）工作站生成kHz，并记录响应。听觉阈值（dB SPL）是通过降低5%的声音强度来确定的 从90分贝步进 分贝至10分贝 dB。ABR阈值被定义为足以清晰激发第一波的最低声强。

2.6.RNA分离和实时PCR

在平行实验中，使用TRIzol Reagent (Invitrogen)，按照所提供的说明，在噪声暴露后指定时间点从小鼠耳蜗中提取总RNA。总RNA的产量和纯度用Eppendorf biophotomer plus检测。所有样品的A260/280比值为1.9 ~ 2.1，电泳图上有两个对应于18S和28S RNA的尖峰。然后用PrimeScript RT试剂盒和gDNA Eraser (Takara)合成cDNA。采用Bio-Rad实时热循环系统，采用Power SYBR Green PCR Master Mix (Takara)进行定量PCR。扩增反应混合物(20μ五十） 包含800个 在SYBR Green系统中对每个引物进行nmol。使用PCR阵列中的三个综合控制分析对mRNA定量进行质量控制：逆转录控制、阳性PCR控制和基因组DNA控制。所有PCR运行均通过控制测试。使用Bio-Rad CFX manager软件分析数据。pri本研究中使用的多聚体如下所示：Myh9 F:Acaatgagccatgaat、Myh9 R:GAGATGACCCGCAGCAAG、Myh10 F:ggaggaccacctagacacaca和Myh10 R:ccattctgcacgtt

2.7.噪音暴露

小鼠保持清醒，并被放置在一个露天声室中心的不锈钢丝笼中。然后，他们暴露在强度为105 dB SPL的2-10 kHz频带噪声4小时，以诱导听觉阈值的暂时变化。声音由一个噪声发生器(SF-06, Random noise generator, RION, USA)产生，由一个功率放大器(CDi 1000 power amplifier, Crown, USA)放大，然后传送到麦克风。噪音声音文件被创建并与音频编辑软件(audacity portable)均衡。声级在声室的多个位置进行校准，以确保刺激的一致性。

2.8。疣状

耳蜗免疫染色如前所述[27］.耳蜗在4℃下用4%甲醛和10mm磷酸盐缓冲盐水(PBS)固定过夜，在室温下用10% EDTA 10 mM PBS脱钙至少一天。切片时，耳蜗用15%蔗糖脱水2小时，然后用30%蔗糖在4°C下过夜。将样品包埋在Tissue-Tek OCT化合物中，液氮冷冻后切片10份μ我是厚片。对于全套免疫染色，从耳蜗分离Corti感觉上皮器官，并将其分为心尖、中间和基底转弯部分，然后在室温下将样品在PBS中的0.5%Triton X-100中渗透15分钟 至少。切片或耳蜗样本在PBS中清洗，然后在37°C下在PBS中的10%山羊血清中封闭30分钟 样品在4°C下与一级抗体孵育过夜。用PBS洗涤后，随后用在PBS中37°C下稀释的抗兔TRITC结合二级抗体进一步孵育1小时 h、 接着是Alexa Fluor 488共轭鬼臼环肽（美国西格玛·奥尔德里奇），在37°C下放置30分钟 在37°C下10分钟和4′，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI） 使用共焦激光扫描显微镜收集免疫荧光图像。耳蜗与下列在PBS中稀释的一级抗体一起孵育：兔抗肌球蛋白IIa（1 : 100，细胞信号，美国），兔抗肌球蛋白IIb（D8H8）（1 : 100，细胞信号，美国），兔抗肌球蛋白IIc（D4A7）（1 : 50，细胞信号，美国），兔抗ZO-1（1 : 400，Invitrogen，美国），和兔抗E-钙粘蛋白（1 : 200，细胞信号，美国）。山羊抗兔TRITC结合二级抗体（1 : 200）人来自美国因维特罗根。

2.9. 组织学分析

耳蜗样本采用类似于免疫染色试验的程序固定和脱钙，用30%到100%的乙醇系列脱水，并包埋在石蜡中，然后以10%的厚度进行切片 μM切片用100%到30%的乙醇系列脱蜡，用苏木精和伊红（H&E）染色，并在光学显微镜下观察（日本尼康YS100）。

2.10。HC损失的定量评估

噪声暴露后2周处死小鼠，耳蜗上皮免疫染色检测HC计数。简单地说，用Alexa Fluor 488标记的phalloidin对基底膜的顶端、中间和基底部分进行计数和标记，以勾勒出hc及其静纤毛的轮廓，以进行定量评估。统计缺失OHCs的数量，并用百分比表示缺失OHCs的比例。

2.11.统计分析

所有的实验都至少进行了三次。数据用平均值±SD表示。采用重复测量方差分析(Repeated-measures ANOVA)评估ABR阈值偏移、单因素方差分析(one-way ANOVA)或采用-test检测MYH14表达及耳蜗听力损失情况，使用GraphPad软件进行统计分析。对于所有测试，值为被认为具有统计学意义。

3.结果

３．１．CRISPR/ cas9介导的Myh14的生成^−/−老鼠行

为了研究MYH14在听力中的功能，使用CRISPR/Cas9基因组编辑技术在小鼠体内破坏MYH14基因 nt靶序列和核酸内切酶Cas9是成功靶向的关键。当sgRNA将Cas9引导到靶序列时，将产生双链断裂。双链断裂产生INDEL（插入和删除）Myh14基因的第9外显子是CRISPR修饰的靶点，如图所示1(一). 将体外转录产生的cas9mrna和sgRNA显微注射到小鼠胚胎的原核期。移植18天后，37只幼崽出生。这些小鼠被指定为F0。根据基因分型序列分析，在这37只幼崽中，有16只幼崽含有突变，令人惊讶的是，它们都有杂合突变。然后，通过DNA测序分析PCR产物的TA克隆，共显示三种类型的突变（图1 (b)和1 (c))我们选择第三种类型的突变作为研究对象，因为这种突变会导致移码突变，并且在八个氨基酸之后会出现一个终止密码子（图1）1 (d)).同时，我们使用上述鼠标线进行了偏离目标的分析。结果表明，在我们的实验中没有偏离目标的效应（数据未显示）。为了产生Myh14纯合突变体，F0雄性小鼠 bp插入与野生型CBA/CaJ雌性繁殖，从而产生F1小鼠。然后，将F1杂合子小鼠近交一代，获得Myh14基因的纯合子小鼠品系。

为了证实MYH14突变小鼠MYH14蛋白被消除，我们使用特异性抗体对MYH14表达高的小脑进行了Western blot分析。如图所示2(一个)， MYH14蛋白在小脑中的表达在纯合突变体中完全消失。最后，我们在整个耳蜗支架上进行免疫细胞化学实验(图)2 (b))．有报道称MYH14主要表达于网状板或其附近[21］.在我们的研究中，MYH14纯合突变体在根尖连接复合物(AJCs)中的免疫反应性被完全消除。这些结果一致表明，使用CBA/CaJ菌株成功地产生了Myh14敲除小鼠。

3.2. Myh14中ABR阈值的升高^−/−五个月大的老鼠

Myh14的跟踪分析^−/−小鼠进行实验，以确定Myh14的外观没有显著差异^−/−突变型小鼠和野生型小鼠。采用H&E染色观察Myh14的耳蜗形态^−/−老鼠。三个月大的Myh14的耳蜗^−/−小鼠没有表现出任何差异(图3.)．hc和SGN(螺旋神经节)均未见异常。Myh14进行ABR测量^−/−将小鼠和与野生型小鼠进行比较()和Myh14^−/−老鼠()在5个月大之前，ABR阈值无统计学差异（图4（a）).短纯音ABR显示5个月大的Myh14^−/−小鼠有高频听力损失，统计数据显示存在显著差异。与ABR结果一致，免疫荧光结果显示，在三个月时HC没有损失，SGN没有变化；但是，在5个月大的突变体的耳蜗基底转中发现了4%-10%的HC损失。散在OHC也在中期丢失耳蜗的dle和顶端旋转（图4（b），4（c）和4（d）)．

Myh14缺失对听力阈值的微小影响增加了其他相关基因可能弥补Myh14缺失的可能性。MYH14和MYH10在细胞-细胞连接中共定位，MYH14与MYH9和MYH10在结构上有很大的相似性;因此，它们在听觉功能上可能具有互补作用。采用免疫印迹分析明确MYH10和MYH9表达的变化。结果显示Myh14耳蜗中MYH10的表达^−/−小鼠MYH9表达明显增加，但MYH9表达变化不明显(图)5（a）和5（b）)．免疫荧光结果进一步验证了免疫印迹分析结果(数据未示)。

3.3. MYH14的表达依赖于噪声暴露

研究2个月大的小鼠耳蜗中MYH14对噪声暴露、免疫印迹分析和免疫荧光染色的反应(在不同时间点:噪音暴露前(2 h)、期间和之后(2和4 h、1、2和7天)，对MYH14蛋白水平进行评估(图)6)．我们发现MYH14蛋白的表达在很大程度上依赖于噪声暴露(图)7(一)和7 (b))．MYH14的表达水平在声学刺激下显著上调，噪声处理2 h后达到峰值。免疫荧光结果也显示，噪声处理后2小时耳蜗hc中MYH14的上调最为明显(图)7 (c))．然而，这种上调逐渐消失，直到噪声暴露7天后，MYH14的表达恢复到基础水平(噪声暴露前)。所有这些结果表明MYH14在噪声暴露后上调，且这种变化具有时间依赖性。

3．4．Myh14^−/−老鼠从噪音损伤中恢复的能力较差

为了确定Myh14敲除对NIHL的影响，我们检测了Myh14对听觉损伤的反应^−/−与野生型小鼠相比(4个月大，每一组）。在声损伤前后记录ABR。结果表明，在声刺激前，两种基因型的ABR阈值几乎相当。然后，将动物暴露在2-10%的环境中 105 kHz频带噪声 用于4的db SPL H美国广播公司录音2 暴露后h，在Myh14和Myh14中，声过度刺激都会导致巨大的听力损失（暂时性阈移，TTS）^−/−小鼠和对照组;两种基因型间无显著差异。ABR试验表明，野生型小鼠听觉损伤两周后完全恢复。然而，突变小鼠的听力在遭受听觉损伤两周后仍未恢复。与对照组相比，突变体的ABR阈值在高强度噪声暴露两周后显著增加(图)8(一个)，8 (b)，8 (c)，8 (d)和8 (e)).这些结果表明Myh14^−/−与对照组相比，小鼠从NIHL中恢复的能力更弱。

3．5．Myh14听神经损伤2周后OHC损失显著增加^−/−老鼠

目的比较Myh14噪声暴露对hc的损伤程度^−/−采用免疫荧光染色法(phalloidin)比较噪声暴露2周后耳蜗HC损失情况。结果表明，HC损失主要发生在热链中，而Myh14的热链损失更为显著^−/−小鼠与对照组比较（图9(一个)和9 (b))．但两组小鼠内毛细胞(ihc)数量无明显差异。此外，我们没有在Myh14的螺旋神经节中观察到缺陷^−/−或对照组小鼠(数据未显示)。因为Myh14位于小鼠hc的顶端连接，我们检测了Myh14中紧密连接蛋白ZO1和E-cadherin的表达^−/−小鼠和对照组暴露于噪声后。免疫荧光染色显示ZO1和E-cadherin的表达未发生改变(数据未显示)。采用免疫印迹分析和qRT-PCR检测MYH9和MYH10的表达水平是否有变化。结果表明，噪声暴露的Myh14耳蜗中MYH10的表达明显增加^−/−与野生型小鼠相比，MYH9的表达明显增加，而MYH9的表达无明显变化(图)10（a）和10（b）)．

总之,Myh14^−/−小鼠从噪音中恢复的能力较差，听觉损伤后丧失的hc较多。我们的数据表明Myh14^−/−小鼠更容易受到高水平噪声暴露的影响，Myh14在噪声诱导的OHC损伤中起到保护作用。

4.讨论

根据世界卫生组织（WHO）的调查结果，NIHL已成为一个非常严重的问题；因此，人们正致力于了解NIHL的机制和听力损失的治疗（2015年2月更新）NIHL与多种基因之间的关系已经建立。近年来，许多NIHL易感性候选基因，包括MYH14，已经发现。MYH14属于肌球蛋白家族，是人类正常听力所必需的。到目前为止，据报道，人类MYH14基因的许多突变会导致DFNA4型听力障碍。然而，MYH14在听觉功能和NIHL中的具体作用尚未完全了解。在我们目前的研究中，我们产生了Myh14^−/−为了阐明MYH14在听觉系统和NIHL中的作用，对小鼠进行了研究。我们的研究结果表明，MYH14在听觉创伤后发挥了有益的作用。

4．1.CBA/CaJ小鼠是进行NIHL和其他听力相关研究的理想模型

NIHL是由高强度噪音引起的，是最常见的感觉性听力损失形式之一。一些实验动物研究报道了过度暴露于噪声后小鼠内耳的形态和生理变化。

NIHL与许多基因有关。与nihl相关的基因研究取得了很大进展。目前研究NIHL易感基因主要有两种方法:一种是人群的大规模筛查，另一种是动物实验。大规模筛查是研究NIHL易感基因的常用方法。然而，基于人群的研究不允许听觉器官的获取。此外，要开展人群NIHL易感基因的研究，还需要进行大规模的实地调查，以确定NIHL易感人群。与人类组相比，敲除小鼠是研究NIHL发病机制的良好模型。在过去的几年里，各种动物敲除模型被开发出来。然而，传统基因敲除动物模型的建立必须以传统的干细胞方法为基础。要避免使用129和C57BL/6背景小鼠是不可能的，它们有年龄相关性听力损失(AHL)的问题[20.，28］.有证据表明AHL和NIHL有共同的分子机制[29，30.]， C57BL/6和部分129小鼠比CBA/CaJ小鼠更易感染NIHL [31］.C57BL/6小鼠在6个月大时毛细胞减少，听力明显下降[32]，除129 sv /Ev外的几个129亚株也表现出与年龄相关的听力损失[33，34]因此，这将干扰我们对NIHL发病机制的研究。因此，C57BL/6和大约129只小鼠不适合研究延迟性听力损失和NIHL。相比之下，CBA/CaJ小鼠的听力保持在正常水平≥18个月大，该菌株中没有AHL。因此，CBA/CaJ小鼠成为在80个近交系中进行听力相关研究的最理想小鼠系之一[35］.过去三年发展的CRISPR/Cas9技术使CBA/CaJ小鼠基因的操作成为可能[35].在我们目前的研究中，我们将CRISPR/Cas9技术与CBA/CaJ小鼠品系相结合，以产生Myh14基因敲除模型，从而避免不利的遗传背景对实验结果的影响。

Ma等人先前的一项研究建立了Myh14^−/−使用C57/B6和129/Sv菌株的小鼠。他们发现Myh14之间没有明显差异^−/−小鼠及野生型小鼠[23，36］.在我们目前的研究中，我们生成了Myh14^−/−小鼠使用CBA/CaJ背景。在该模型中，未发现明显的外观差异；Myh14的耳蜗^−/−小鼠发育正常。然而，我们的Myh14^−/−老鼠在五个月大时就会出现高频听力损失;此外，从突变体的基础转向开始，耳蜗中也发现中度HC损失，这也是在这个时期开始的。这两种小鼠模型可能有不同的表型是可以理解的;一种可能的解释是，本研究中使用的小鼠品系与之前的研究中使用的小鼠品系不同，品系对NIHL的易感性不同[37，38］.

4．2．MYH10可能弥补耳蜗MYH14的缺失

肌凝蛋白是与存在于所有真核细胞中的分子运动相关的蛋白质超家族;它与肌动蛋白结合，利用ATP沿着肌动蛋白丝移动。肌凝蛋白超家族主要分为两大类:传统肌凝蛋白(非肌凝蛋白II;NM II)和非常规肌凝蛋白(肌凝蛋白I和III-VII)。肌球蛋白家族在耳蜗中的分布不同，其正常生理功能在耳蜗中也存在差异。NM II被认为参与介导上皮组织形态发生和张力稳态，上皮顶端连接内的调节力[39- - - - - -41］.耳蜗内的NM II有三种亚型，由myh9，myh10和myh14在老鼠21］.三种纳米II亚型具有非常相似的分子结构[22]因此，MYH14缺失对听力阈值的轻微影响增加了其他两个基因可能弥补其缺失的可能性[36］.免疫印迹分析结果显示，仅MYH10的表达量显著增加，MYH9的表达量无明显变化。先前的一项研究报道MYH10是调节Schaffer侧副输入的主要亚型[42];因此，MYH10的增加，而不是MYH9的增加，很可能可以弥补耳蜗MYH14的大部分功能。MYH14基因筛选结果显示一个无义突变。受影响的个体在生命的第一个十年开始表现出进行性的听力损害，在第四个十年严重的听力损失。这是和Myh14的对比^−/−在5个月大时开始出现进行性听力损失的小鼠。Myh14观察到这种更温和的表型^−/−在小鼠模型中，MYH10对MYH14有更明显的代偿作用。然而，MYH10并不能完全取代MYH14的功能，因为MYH14中hc的缺失^−/−小鼠在五个月后仍被观察。此外，我们不能排除其他未知分子可能补偿MYH14的可能性。

4．3．MYH14缺失促进NIHL

来自多个小鼠突变体的证据表明，在大多数情况下，AHL和NIHL的发病机制非常相似[17，18］.在我们的研究，Myh14^−/−以小鼠为实验对象，研究MYH14在NIHL发病机制中的作用。我们发现Myh14的废除增加了小鼠对听觉损伤的易感性。在野生型小鼠中，105 dB SPL噪声暴露4 h引起TTS，噪声暴露2周后ABR阈值恢复。然而，突变小鼠ABR阈值恢复受损。此外，与对照组相比，暴露于噪声两周后，突变小鼠的HC损失(主要是OHCs)更多。与以往的报告一致[43- - - - - -45，我们的结果表明，OHCs比ihc更容易受到噪音的影响。突变小鼠ABR阈值恢复失败可能部分是由于耳蜗永久性HC丧失所致。

另外，我们发现Myh14的螺旋神经节和侧壁(另外两个容易受噪声影响的部位)没有明显差异^−/−和暴露于噪声后的对照组小鼠。因此，我们的研究结果表明，与耳蜗其他部位相比，MYH14在hc中起着不可或缺的作用。综上所述，这些发现表明MYH14可能在CBA/CaJ小鼠耳蜗声学刺激后的保护中发挥有益作用。

我们试图确定Myh14的机制^−/−小鼠对NIHL易感。由于MYH14位于小鼠hc的顶端连接，我们研究了ZO-1和E-cadherin细胞连接蛋白在MYH14中的表达^−/−小鼠噪声暴露后使用免疫荧光分析，然后将其与对照组进行比较。我们发现在Myh14中这两种蛋白之间没有统计学上的显著差异^−/−与对照组相比，小鼠。那么，在噪声暴露后，MYH14缺乏如何导致更多HC损失？一个可能的解释是，MYH14的损失会损害噪声环境中离子的渗透性。在正常情况下，MYH10可以部分补偿MYH14的功能，但MYH14的缺失使变形杆菌更容易感染与在嘈杂环境中的对照组相比，AJCs对小鼠可能造成损伤。长期损伤的AJCs可能会引起离子浓度的变化，最终导致Myh14中更多HC损失^−/−老鼠(46，47］.但这一假设的具体机制有待进一步分析。

5.结论

我们在CBA/CaJ小鼠品系中使用CRISPR/Cas9技术生成MYH14敲除模型。Myh14^−/−与对照组相比，小鼠更容易受到高强度噪音的影响。MYH14可能在nhl中发挥有益作用。需要更多的实验来确定MYH14促进NIHL的机制。

相互竞争的利益

作者声明本文的发表不存在利益冲突。

致谢

国家自然科学基金项目(no . 31171194);国家973重点基础研究发展计划项目(no . 2014CB541703);山东省科技支撑计划项目(no . 2009GG10002039)。关键词:岩石力学，边坡稳定性，边坡稳定性

参考文献

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