NP 神经可塑性 1687 - 5443 2090 - 5904 Hindawi出版公司 10.1155 / 2016/6720420 6720420 研究文章 失去Myh14易感性增加噪音性听力丧失在CBA / CaJ老鼠 傅 枭龙 1 张 临清 1 金 邺城 1 太阳 小杨 1 张 Aizhen 1 温 Zongzhuang 1 周 一尘 1 夏 明 2 http://orcid.org/0000 - 0001 - 6619 - 7107 高 Jiangang 1 王 剑 1 生命科学学院教育部重点实验室的实验畸形学 山东大学 济南250100 中国 sdu.edu.cn 2 头颈外科 山东大学第二医院 济南250033 中国 sdey.net 2016年 22 12 2016年 2016年 31日 07年 2016年 08年 10 2016年 07年 11 2016年 2016年 版权©2016枭龙傅et al。 这是一个开放的文章在知识共享归属许可下发布的,它允许无限制的使用,分布和繁殖在任何媒介,提供最初的工作是正确的引用。

MYH14肌凝蛋白家族中的一员,被牵涉进很多能动的过程,如离子通道控制,细胞器易位,细胞骨架重排。突变MYH14导致DFNA4-type听力障碍。进一步的证据也表明,MYH14候选人噪音性听力丧失(NIHL)易感基因。然而,MYH14特定角色的听觉功能和NIHL并不完全理解。在目前的研究中,我们使用CRISPR / Cas9技术建立Myh14基因敲除小鼠在CBA / CaJ背景(现在称为Myh14−−/老鼠)和澄清在耳蜗和NIHL MYH14的角色。我们发现Myh14−−/老鼠才表现出显著的听力损失五个月的年龄。此外,Myh14−−/老鼠更容易受到高强度噪声控制老鼠相比。更重要的外毛细胞丢失在Myh14观察−−/听觉损伤后小鼠比野生型控制。我们的研究结果表明,Myh14可能发挥有益作用的保护耳蜗后声过度刺激在CBA / CaJ老鼠。

 中国国家自然科学基金 31171194 中国的973年国家基础研究项目 2014年cb541703 山东省科学技术关键项目 2009年gg10002039 1。介绍

噪音性听力丧失(NIHL)现在已经成为最普遍的职业伤害的报道( 1]。长期接触高强度噪声会导致感音神经性听力障碍。目前,据估计,世界上大约有5亿人患有这种风险( 2]。NIHL是可预防的赤字,但很难扭转它一旦发生因为失去了哺乳动物的感官细胞不能再生( 3- - - - - - 6];因此,了解其发病机制已成为研究的一个非常重要的任务。此外,有努力澄清NIHL所涉及的分子和生化机制。

研究表明,声学过度刺激可能导致发病机理和生物化学变化,导致听力损失( 7, 8]。继续和发展研究涉及NIHL已确定,之间存在着密切的关系噪音性耳聋的发生和变化在某些基因,细胞代谢,细胞凋亡 9),等等。NIHL的发病机制非常复杂,确切的机制尚不清楚。一般来说,它是遗传和环境因素相互作用的结果( 9- - - - - - 11]。尽管许多努力,NIHL的研究进展缓慢,很难研究NIHL在人类。没有执行,因为家庭遗传研究暴露在相同的噪声条件几乎是不可能的收集( 12]。基因修饰小鼠学习,好的模型NIHL机制。近年来,一些基因已经被发现影响易感性噪声在动物模型 13, 14]。几个基因敲除小鼠的开发,包括Pjvk−−/( 15), PMCA2+ /−( 16), P2RX2−−/( 17),而 CDH23+ /−( 18),决心更加敏感噪声比野生型控制。与此同时,更多的研究也开始寻找新的NIHL易感基因,和数百个单核苷酸多态性(SNP)位点的基因被发现参与不同通路的内耳。扩展的分析644个snp在53个候选基因在两个独立的执行(瑞典和波兰)数量;和两个单核苷酸多态性(rs667907和rs588035) MYH14导致积极的协会在波兰样本集和重要的交互与噪声暴露水平在瑞典样本集 19, 20.]。这个结果表明MYH14可能是NIHL易感性基因( 4, 19]。

MYH14,也称为nonmuscle II重链(NMHCII-C),连同其他两个nonmuscle连锁店(MYH9和MYH10),肌凝蛋白家族中的一员,已与许多能动的过程如离子通道控制、细胞器易位,细胞骨架重排( 21, 22]。突变MYH14导致DFNA4-type听力障碍。有趣的是,与MYH9 MYH14股伟大的相似之处和MYH10结构( 22]。MYH14已被证明在neuritogenesis扮演角色和维护上皮细胞顶端细胞连接的耳蜗内( 23, 24]。然而,MYH14和NIHL之间的关系仍然是模糊的,他们扮演的角色在NIHL需要进一步分析( 12]。

在我们的研究中,我们应用CRISPR / Cas9技术建立Myh14淘汰赛(Myh14鼠标线−−/)使用CBA / CaJ背景压力。然后,我们调查了这些老鼠的听觉阈值和形态学变化在正常情况下或在噪声暴露。我们发现Myh14−−/老鼠才表现出显著的听力损失五个月的年龄。此外,Myh14−−/老鼠更容易受到高强度噪声控制老鼠相比。更重要的外毛细胞(OHC)损失在Myh14观察−−/听觉损伤后小鼠。这些数据表明,缺乏Myh14可能增加易感性NIHL, Myh14可能发挥有益作用的保护耳蜗后声刺激在CBA / CaJ鼠标线。

 2。材料和方法 2.1。道德的声明

在这项研究中使用的动物和实验动物伦理审查委员会批准的程序是山东大学。动物管理严格按照标准执行的山东大学动物伦理委员会(许可证号码:ECAESDUSM 20123004)。

 2.2。代MYH14 <一口>−−/ < /一口>老鼠

使用CRISPR-Cas9生成Myh14-deficient老鼠基因编辑技术和维护在CBA / CaJ背景。pX330和pST1374都来自Addgene(质粒ID: # 42230, # 44758,职责)。老鼠CRISPR-Cas9的基因编辑技术使用如前所述[ 25, 26]。总之,一对目标序列的寡核苷酸(5′-CCTGAAGAAAGAGCGCAATA-3′)是退火和结扎PX330消化 BbsI。然后sgRNA是由体外转录(T7启动子)使用MEGAshortscript工具包(美国Am1354 Ambion)。源自pST1374-N-NLS-flag-linker-cas9 hCas9 mRNA,合成使用mMESSAGE 1 T7工具包(美国Am1345 Ambion)和腺苷酸聚(尾矿工具包(生活技术,美国)。sgRNA和Cas9 mRNA纯化使用MEGAclear工具包(美国AM1908 Ambion)和筛选了RNase-free水。

CBA / CaJ雌性小鼠超数排卵和CBA / CaJ雄鼠交配。然后,雌性老鼠牺牲和受精卵从输卵管中删除。纯化sgRNAs (50 ng / μL)和 hCas9信使rna (100 ng / μL) coinjected细胞质的卵原核的阶段。注射后原核的阶段,鸡蛋孵化了十分钟。然后,鸡蛋被转移到输卵管pseudopregnant CD1雌性老鼠。基因组DNA提取的尾巴新生的幼崽。周围的基因组DNA片段gRNA目标站点被使用两套引物PCR:放大Myh14向前,5′-ACCTCGTGCTTGTTCAG-3′, Myh14扭转5′-TGTCTTCAGCAGGGTGT-3′。PCR产物直接测序或获得使用T /一个克隆的方法克隆然后测序识别突变。

 2.3。分析潜在的非目标突变

非目标效应可能存在CRISPR / Cas9技术。为了应对这种可能性,我们使用了CRISPR设计web上可用的工具( http://crispr.mit.edu),搜索日常轨迹。五个潜在的非目标网站Myh14基因被发现。分析日常的引物如下:Sin3b 5′-GCCAGGAGGTATATGAGAAC-3′, 5′-GAAATTTCCCCAGGAATGGACTGACA-3′;Pcdh9 5′-GTGTACTTATAGCACTCACC-3′, 5′-CTAACGCGGAAACACCTCAC-3′;Patl1 5′-CCACTGAGCCTTTCCTACCTTC-3′, 5′-GTAAATTTAGAAATTTTATTTT-3′;Arhgap27 5′-GAAGCTAGGCCAGCGGGCGAAAG-3′, 5′-CTGCCCATGGGCGGGGCTG-3′;和Olfr1333 5′-GCGCTATACTGTCATCCTCAAC-3′, 5′-GCAAGCCAAGCTACGCACTG-3′。刚出生的幼崽是放大的基因组DNA片段使用上面提到的PCR引物。然后,PCR产物直接测序获得或使用T /一个克隆的方法克隆和测序识别突变。

 2.4。蛋白质的提取和免疫印迹分析做准备

老鼠斩首;耳蜗很快被删除从冰冷的头骨和均质细胞裂解缓冲(10毫米三羟甲基氨基甲烷、液pH = 7.4, 1% Triton x - 100, 150毫米氯化钠,1毫米EDTA, PMSF和0.2毫米),然后细胞溶解30分钟在冰上,离心机在4°C 10000×g 30分钟。上层清液被收集,蛋白质浓度测定用BCA试剂盒。样本与加载缓冲区和混合加热5分钟在100°C,储存在−20°C。蛋白质样品分离10%十二烷基硫酸钠(SDS)聚丙烯酰胺凝胶和转移到PVDF膜。5%脱脂奶粉的膜被TBS-T室温1 h和孵化主要抗体在一夜之间在4°C。与TBS-T洗涤后在室温下(10分钟三次),膜被孵化的anti-rabbit HRP-conjugated二级抗体(细胞信号1:8000年,美国)稀释5%脱脂奶粉在室温下TBS-T 1 h。接下来,在TBS-T洗膜(三次每10分钟)和乐队被发现使用ECL免疫印迹检测设备(美国热)。膜孵化了以下主要抗体稀释5%牛血清白蛋白(BSA):兔子anti-Myosin-IIa(细胞信号1:1000年,美国),兔子anti-Myosin-IIb (D8H8)(细胞信号1:1000年,美国),兔子anti-Myosin-IIc (D4A7)(细胞信号1:1000年,美国),和兔抗 β肌动蛋白(Bioworld 1: 5000年,中国)。

 2.5。听觉脑干反应(ABR)测量

老鼠深深与戊巴比妥钠麻醉(50毫克/公斤体重)腹腔内注射和体温维持在37°C用加热垫。测试是在一个执行sound-isolated房间。三个电极针插入皮下注射麻醉小鼠:一个是在前额之间插入耳朵,下面一个是左边的外耳,一个是在附近的尾巴。点击猝发音刺激频率的4、8、16和32 kHz生成和响应记录使用Tucker-Davis技术系统(TDT)、美国)工作站运行SigGen32软件(TDT)、美国)。听觉阈值(分贝)定义通过减少从90分贝的声音强度把dB步骤10 dB。ABR阈值被定义为最低的声音强度足以引起第一波清晰。

 2.6。RNA隔离和实时PCR

在平行实验中,总RNA提取鼠标cochleae在定义的时间点噪声暴露后使用试剂盒试剂(英杰公司)根据提供的方向。总RNA产量和纯度进行了评估与埃普多夫光度适应计+。所有样品都A260/280比率1.9 - -2.1,显示两个尖锐的峰对应于18岁和28 s RNA在重复。然后使用PrimeScript RT试剂盒与互补脱氧核糖核酸合成gDNA橡皮擦(豆类)。实时定量PCR进行Bio-Rad热循环系统与电力SYBR绿色PCR反应混合液(豆类)。放大反应混合物(20 μL)含有800 nmol SYBR绿色中的每个引物系统。信使rna定量的质量控制进行了使用三个综合控制检测PCR数组:反向转录控制,积极的PCR控制和基因组DNA控制。所有PCR通过控制测试运行。数据分析使用Bio-Rad只管理器软件。本研究使用的引物如下所示:Myh9 F: ACAATGGAGGCCATGAGAAT, Myh9 R: GAGATGACCCGCAGCAAG, Myh10 F: GGAGGACACCCTAGACACCA Myh10 R: CCACTTCCTGCTCACGTTTT

 2.7。噪声暴露

老鼠保持清醒和放置在一个不锈钢丝笼在一个开放田地声学室的中心。然后,他们暴露在2 - 10 kHz乐队105分贝的噪音的强度4 h诱导一个临时改变听觉阈值变化。声音是由噪声发生器生成(SF-06,随机噪声发生器,正是由于美国),由功率放大器放大(CDi 1000功率放大器,皇冠,美国),和交付给麦克风。噪音声音文件创建和平衡的音频编辑软件(audacity便携式)。声音水平校准在多个位置中的音响室,以确保一致性的刺激。

 2.8。疣状

如前所述执行cochleae[组织化学染色 27]。耳蜗固定在4%甲醛在10毫米磷酸盐(PBS)一夜之间在4°C和10% EDTA脱钙10毫米PBS在室温下至少一天。切片,cochleae与15%蔗糖脱水2 h,然后30%蔗糖在一夜之间在4°C。样本嵌入Tissue-Tek 10月化合物在液态氮冷冻,然后分为10 μ米厚片。包埋疣状,螺旋器的感觉上皮隔绝cochleae分为顶端,中间,然后基底部分转向permeabilize PBS Triton x - 100 0.5%的样品在室温下15分钟。部分或者耳蜗样本在PBS洗,然后屏蔽10%山羊血清在PBS 37°C为30分钟。样本孵化一夜之间在4°C主要抗体。洗后用PBS,其次是进一步孵化一个anti-rabbit TRITC-conjugated二级抗体稀释在PBS 37°C 1 h,其次是Alexa萤石488 -共轭phalloidin(美国Sigma-Aldrich) 37°C 30分钟和4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 37°C 10分钟,使用共焦激光扫描显微镜免疫荧光图像采集。Cochleae孵化了以下主要抗体在PBS稀释:兔子anti-Myosin-IIa(细胞信号1:100年,美国),兔子anti-Myosin-IIb (D8H8)(细胞信号1:100年,美国),兔子anti-Myosin-IIc (D4A7)(1: 50、细胞信号、美国),兔子anti-ZO-1(表达载体1:400年,美国),和兔子anti-E-cadherin(细胞信号1:200年,美国)。山羊anti-rabbit TRITC-conjugated二级抗体(1:200)来自表达载体,美国。

 2.9。组织学分析

耳蜗样本固定和脱钙使用过程类似于用于免疫染色试验,由乙醇脱水系列从30%到100%不等,然后和嵌入在石蜡切片的厚度10 μm。部分是由一个乙醇deparaffinized系列从100%到30%不等,苏木精和伊红染色()),并在光学显微镜下观察(尼康YS100、日本)。

 2.10。HC损失的定量评估

老鼠牺牲了2周后噪声暴露和耳蜗上皮细胞应用HC计数。短暂,顶端,中间,和基膜的基底部分计算和标记Alexa萤石488 -共轭phalloidin大纲高碳钢和定量评估的静纤毛。失踪ohc的数量清点,失踪的比率上凸轮轴被表示为一个百分比。

 2.11。统计分析

所有实验进行至少三次。数据表示为平均数±标准差。重复测量方差分析进行评估ABR阈值的差异变化,单向方差分析或 t 以及被选来测试MYH14表达和耳蜗听力损失,并使用GraphPad软件进行统计分析。所有测试的值 P < 0.05 被认为是具有统计学意义。

 3所示。结果 3.1。CRISPR / Cas9-Mediated代Myh14 <一口>−−/ < /一口>老鼠

调查的功能MYH14在听证会上,CRISPR / Cas9基因编辑技术被用来摧毁MYH14基因在小鼠体内。简而言之,一个导游RNA (sgRNA)包含一个20元目标序列和核酸内切酶Cas9成功目标至关重要。sgRNA指导Cas9目标序列时,会产生一个双链断裂。双链断裂产生indels(插入和删除),然后产生移码突变。Myh14基因的外显子9是CRISPR-amenable目标,如图 1(一)。Cas9 mRNA和sgRNA,由体外转录,microinjected入原核的小鼠胚胎阶段。移植后18天,37个幼崽出生。这些老鼠被指定为F0。其中37个幼崽,16个幼崽包含突变,由基因序列分析,和令人惊讶的是,他们所有人的杂合突变。然后,TA PCR产物的克隆被DNA测序分析,共有三种类型的突变在哪里(图所示 1 (b)和 1 (c))。我们选择了第三种类型突变作为我们的研究对象,因为这种类型的突变会引起移码突变,会出现一个终止密码子八氨基酸后(图 1 (d))。同时,我们进行了日常分析使用鼠标线上面提到的。结果显示没有脱靶效应在我们的实验中(数据没有显示)。为了产生一个Myh14纯合突变,F0雄性小鼠与野生型1 bp插入被培育CBA / canon女在内从而生成F1小鼠。然后,F1杂合的小鼠近交一代之久,获取鼠标应变Myh14基因纯合子。

CRISPR / Cas9-mediated代Myh14基因敲除小鼠。(一)原理图的sgRNA Myh14外显子9轨迹(红色箭头所示)。sgRNA序列是在黑色下划线,PAM序列所示红色。(b)测序Myh14色谱−−/老鼠。序列的突变网站变得匆忙。(c)三种类型的突变(3、6 bp删除和插入1 bp)生产。3型移码突变选择进行进一步分析。(d) Myh14移码突变−−/老鼠。突变是强调在黑色的。” ∗ ”表明过早的终止密码子。蛋白质的翻译终止点的箭头。

确认MYH14蛋白质MYH14突变老鼠被废除,我们进行了免疫印迹分析小脑(MYH14表达式是高)使用特定抗体。作为显示在图 2(一个),MYH14蛋白表达在小脑完全废除纯合突变体。最后,我们进行了免疫细胞化学实验在耳蜗整个支架(图 2 (b))。据报道,MYH14主要表现在或接近网状板( 21]。在我们的研究中,MYH14顶端交界复合物的免疫反应性(ajc)完全废除MYH14纯合突变体。这些结果一致显示成功的一代Myh14敲除老鼠使用CBA / CaJ应变。

验证MYH14蛋白质基因敲除突变体小鼠。(一)免疫印迹分析验证MYH14蛋白基因敲除突变小鼠小脑的( n = 3 为每个组)。(b)的共焦图像基膜在野生型和Myh14−−/老鼠。在野生型小鼠荧光观察,但没有在Myh14荧光−−/老鼠。规模的酒吧,20 μm。

 3.2。海拔ABR阈值在Myh14 <一口>−−/ < /一口>小鼠年龄5个月

跟踪分析Myh14−−/老鼠进行确定,没有明显的差异Myh14的外观−−/突变小鼠和野生型老鼠。)染色进行调查Myh14的耳蜗形态学−−/老鼠。为期三个月的旧Myh14 cochleae−−/小鼠没有表现出差异(图 3)。没有异常出现在高碳钢或胡志明市(螺旋神经节)。在Myh14上进行测量−−/小鼠和野生型小鼠相比。野生型小鼠( n = 1 0 )和Myh14−−/老鼠( n = 1 0 )显示,ABR阈值无统计学差异,直到五个月的年龄(图 4(一))。猝发音上显示,5个月大的孩子Myh14−−/老鼠有高频听力损失,统计数据显示,有显著差异。与ABR结果一致,免疫荧光结果显示没有失去HC和胡志明市的变化在三个月;然而,4% - -10% HC损失在耳蜗基底的5个月大的孩子被发现突变体。零星ohc也失去了在中间和顶端的cochleae(数字 4 (b), 4 (c), 4 (d))。

Myh14−−/小鼠耳蜗形态学显示正常。耳蜗形态学Myh14是正常的−−/突变的老鼠。耳蜗与苏木精和伊红染色从三个控制和Myh14−−/老鼠。没有显著差异,包括螺旋神经节(胡志明市)耳蜗轴(MO)和毛细胞(HC),发现了野生型和突变小鼠之间。酒吧,100 μm。

上测量和细胞突变小鼠的cochleae损失模式。(a) ABR阈值控制和Myh14之间−−/老鼠( n = 10 为每个组)。 P ∗ < 0.05 相对于控制。(b)在胡志明市密度无显著差异在野生型和突变小鼠之间。(c)毛细胞丢失(白色箭头)被发现在5个月大的孩子实验组( n = 8 )。(d)量化OHC损失在特定位置分为实验组和对照组。 P ∗ ∗ ∗ < 0.001 与对照组相比。

小Myh14损失对听力阈值的影响提出其他相关基因有可能弥补Myh14的缺失。证据表明,MYH14和MYH10与信息连接,MYH14股票巨大的相似性MYH9和MYH10结构;因此,他们可能在听觉功能互补效应。免疫印迹分析进行澄清MYH10和MYH9的表达的变化。结果表明,Myh14 cochleae MYH10的表达−−/老鼠是显著增加,但MYH9的表达没有明显变化(数据 5(一个)和 5 (b))。免疫荧光结果进一步验证了免疫印迹结果分析(数据未显示)。

表达MYH10 Myh14 cochleae的调节−−/老鼠。((a)、(b))的免疫印迹分析三个老鼠表明MYH10的表达,不是MYH9调节的cochleae Myh14−−/老鼠相比,控制( n = 3 为每个组)。 P ∗ ∗ < 0.01的学生 t 以及。

 3.3。表达MYH14 Exposure-Dependent是噪音

调查的反应在鼠标cochleae MYH14噪声暴露(2个月),免疫印迹分析和immunofluorescent染色( n = 3 为每个组)进行评估MYH14蛋白质含量在不同时间点:(2 h)之前,期间和之后(2和4 h, 1、2和7天)噪音暴露(图 6)。我们发现MYH14蛋白表达在很大程度上依赖于噪声暴露(数字 7(一)和 7 (b))。MYH14的表达水平显著调节通过声波刺激,他们达到了最高峰2 h后噪声处理。免疫荧光的结果还表明,upregulation MYH14是最明显的噪声治疗后2 h的高碳钢耳蜗(图 7 (c))。然而,这种upregulation逐渐消失,直到七天噪声暴露后,当MYH14是恢复到基底的表达水平(在噪声暴露之前)。这些结果表明,MYH14调节噪声暴露后,这种变化是时间。

实验设计对噪声暴露和ABR测试。野生型和Myh14−−/老鼠暴露在105分贝噪音4 h。ABR阈值测试在以下时间点:2 h, 2 h后,噪声暴露后7天。

表达MYH14 exposure-dependent是噪音。((a)和(b))西方的污点分析在不同时间点(之前、期间和之后噪声暴露)的表达水平MYH14 ( n = 3 为每个组)。MYH14达到最高峰的表达2 h后噪声暴露(P-2h),然后逐渐恢复到基底的水平(P-7d)。 P ∗ ∗ ∗ < 0.001 通过学生的 t 以及相比pre-noise暴露水平。(c)共焦图像显示的表达MYH14之前和2 h后螺旋器的噪声暴露。螺旋器被贴上Alexa 488 -共轭phalloidin(绿色);红色,MYH14;蓝色,DAPI。规模的酒吧,50 μm。

 3.4。Myh14 <一口>−−/ < /一口>老鼠不从噪声损伤中恢复的能力

确定的影响Myh14 NIHL淘汰赛,我们检查了Myh14的回应声创伤−−/小鼠与野生型相比控件(4个月大的时候, n = 8 为每个组)。ABR记录之前和之后声创伤。结果表明,ABR阈值几乎是声刺激前两基因型之间的可比性。然后,动物暴露在2 - 10 kHz乐队在105分贝噪音4 h。上录音2 h后接触表明,声学过度刺激诱导大听力损失(临时阈值变动,TTS) Myh14−−/小鼠和对照组;此外,两个基因型之间没有明显差异。ABR测试表明,野生型小鼠完全恢复两周后声创伤。然而,听力的突变小鼠未能恢复两周后声创伤。ABR阈值的突变体与对照组相比显著增加两周后高级噪声暴露(数字 8(一个), 8 (b), 8 (c), 8 (d), 8 (e))。这些结果表明,Myh14−−/老鼠不太能够恢复NIHL比控制。

ABR阈值变化Myh14之间的噪声暴露后−−/老鼠和控制。Myh14 ABR阈值变化进行了测试−−/老鼠和控制在噪声暴露和2 h,噪声暴露(48 h, 2周后 n = 8 为每个组)。 P ∗ < 0.05 相对于控制。 P ∗ ∗ < 0.01 通过学生的 t 以及。 P ∗ ∗ ∗ < 0.001 通过学生的 t 以及与对照组相比。上测量是可再生的。

 3.5。OHC损失显著增加听觉损伤后2周Myh14 <一口>−−/ < /一口>老鼠

为了比较的破坏程度高碳钢在Myh14噪声暴露后−−/小鼠和对照组,免疫荧光染色(phalloidin)进行比较HC的损失cochleae噪声暴露后两周。结果表明,HC损失主要发生在上凸轮轴,ohc的丧失是Myh14更重要−−/老鼠相比,控件(数字 9(一个)和 9 (b))。然而,内毛细胞的数量(包含ihc)显示两组老鼠的之间没有明显的差异。另外,我们没有观察到Myh14螺旋神经节的缺陷−−/或控制老鼠(数据未显示)。因为Myh14定位在顶端连接鼠标高碳钢,我们检查了紧密连接蛋白的表达,在Myh14 ZO1和钙−−/老鼠和控制噪声暴露后。免疫荧光染色鉴定表明,ZO1和钙粘蛋白的表达并没有改变(数据未显示)。免疫印迹分析和存在进行检查是否有MYH9和MYH10的表达水平的变化。结果表明,表达的cochleae MYH10 noise-exposed Myh14−−/小鼠与野生型小鼠相比显著增加,而没有明显的改变MYH9(数据的表达 10 ()和 10 (b))。

Myh14−−/噪声暴露后小鼠表现出更多的外毛细胞的损失相比,控制。(a)的共焦图像外毛细胞(ohc)野生型和Myh14−−/噪声暴露后小鼠2周。更多OHC Myh14损失(白色箭头)−−/老鼠。所有的实验进行至少三次。规模的酒吧,20 μm。(b) OHC损失的百分比在不同的耳蜗位置控制和Myh14−−/老鼠。 P ∗ < 0.05 相对于控制。 P ∗ ∗ < 0.0 1 相对于控件( n = 5 )。

MYH9的表达水平和MYH10噪声暴露后。((a)、(b))西方污点分析显示MYH9的表达水平和噪声暴露后MYH10 ( n = 3 为每个组)。(c)西方的屁股被实时PCR验证的结果。 P ∗ ∗ < 0.0 1 相对于控制。 P ∗ ∗ ∗ < 0.001 通过学生的 t 以及与对照组相比。

总之,Myh14−−/老鼠不太能够恢复噪声暴露,和更多的高碳钢声创伤后丢失。我们的数据表明Myh14−−/老鼠更容易受到高层噪声暴露,Myh14 ohc在噪音性损伤具有保护作用。

 4所示。讨论

据世界卫生组织(世卫组织)调查结果,NIHL已经成为一个非常严重的问题;因此,许多工作的重点是理解NIHL的机制和治疗听力损失(2015年2月更新)。已经建立了一个NIHL和各种基因之间的关系。近年来,许多NIHL易感性候选基因,包括MYH14 ,已经被发现了。MYH14属于肌凝蛋白家族,需要人类的正常听力。这个日期,许多人类MYH14突变基因已报告导致DFNA4-type听力障碍。然而,MYH14特定角色的听觉功能和NIHL并不完全理解。在我们目前的研究中,我们产生了Myh14−−/老鼠应变澄清的作用MYH14听觉系统和NIHL。我们的研究结果表明,MYH14声创伤后发挥有益的作用。

4.1。CBA / CaJ执行NIHL老鼠是一个理想的模型研究和其他案件的听证会

接触高层造成的噪音,NIHL是最常见的一种形式的知觉的听力损失。实验动物的一些研究报道形态和生理变化过度噪声暴露后小鼠的内耳。

NIHL与许多基因有关系。在NIHL-related基因研究已经取得了很大的进步。目前,主要有两种方法来研究NIHL易感基因:一是人口质量筛选,另一个是动物实验。质量检查是一种常用的方法在NIHL易感基因的研究。然而,基于人口的研究不允许收购的听觉器官。此外,执行人口NIHL易感基因的研究,有必要开展大规模的实地调查,以确定NIHL-susceptible人。与群体相比,基因敲除小鼠模型是一个很好的研究NIHL机制。在过去的几年中,各种动物的基因敲除模型已经开发出来。然而,传统gene-knockout动物模型的建立必须基于传统的干细胞的方法。是不可能避免使用129和C57BL / 6小鼠背景,有问题的老年性听力损失(AHL) [ 20., 28]。证据表明,AHL和NIHL有常见的分子机制 29日, 30.],C57BL / 6和129小鼠往往更容易受到比CBA / CaJ小鼠NIHL [ 31日]。C57BL / 6小鼠失去毛细胞和显示重要的听力损失,6个月大的时候( 32),129年和几个substrains除了129 sv /电动车也显示老年性听力损失( 33, 34]。因此,这将妨碍NIHL的发病机制的研究。因此,C57BL / 6和129小鼠不适合研究延迟听力损失和NIHL的菌株。相比之下,CBA / CaJ老鼠保留正常听力≥18个月的年龄,而且没有AHL应变。因此,CBA / CaJ鼠标成为最理想的鼠标执行案件的听证会研究菌株80天生的菌株 35]。CRISPR / Cas9技术在过去的三年里使CBA的操纵/ CaJ老鼠基因可能[ 35]。在我们目前的研究中,我们结合了CRISPR / Cas9技术在CBA / canon鼠标应变生成Myh14基因敲除模型在内从而避免不利的遗传背景的影响实验结果。

马等人建立了一个Myh14此前进行的研究−−/鼠标使用C57 / B6和129 / Sv菌株。他们发现Myh14之间没有明显的差异−−/小鼠和野生型小鼠( 23, 36]。在我们目前的研究中,我们产生了Myh14−−/鼠标使用CBA / CaJ背景。在这个模型中,在外表上没有明显的差异被发现;的cochleae Myh14−−/老鼠的正常发育。然而,我们Myh14−−/老鼠有高频听力损失在5个月;此外,适度的HC损失还发现在耳蜗基底的突变体,也在这个时期开始。它是可以理解的,这两个鼠标模型可能有不同的表型;一个可能的解释是,在这项研究中使用的鼠标应变是不一样的在先前的研究中,使用的和容易NIHL不同菌株之间 37, 38]。

 4.2。MYH10可能弥补缺乏MYH14 Cochleae

肌凝蛋白是一个总科相关的蛋白质分子的运动存在于所有真核细胞;它与肌动蛋白结合和使用ATP沿肌动蛋白丝。肌凝蛋白总科分为两大类:传统的肌球蛋白(nonmuscle肌凝蛋白II;纳米II)和非传统肌凝蛋白(肌凝蛋白和III-VII)。肌凝蛋白家族在耳蜗的分布是不同的,有差异在耳蜗的正常生理功能。纳米二世被认为是参与调节上皮组织形态发生和张力的体内平衡,调节力量在上皮细胞顶端连接( 39- - - - - - 41]。有三种亚型的纳米二世在耳蜗,编码 myh9, myh10, myh14在老鼠 21]。三海里II亚型有着非常相似的分子结构( 22]。因此,轻微的影响MYH14损失听力阈值提出了这样的可能性,其他两个基因可能会弥补其缺席( 36]。免疫印迹分析结果显示,只有MYH10的表达明显增加,并没有明显的改变MYH9的表达。一项研究报道,MYH10调节谢弗抵押品输入(主要对碘氧基苯甲醚 42];因此,MYH10很可能增加,但不是MYH9,可以弥补大多数MYH14在耳蜗的功能。MYH14基因筛查的结果揭示了一个无义突变。受影响的个体表现出进步听力障碍在第一个十年的开始在第四届十年生活深刻的听力损失。这是与我们的Myh14−−/老鼠开始出现进行性听力损失在5个月的年龄。这与我们的Myh14温和的表型观察−−/老鼠可以解释为一个更明显的补偿MYH10 MYH14在小鼠模型的影响。然而,MYH10不能完全取代的功能MYH14因为MYH14高碳钢的损失−−/老鼠还观察到从5个月。此外,我们不能排除这种可能性,其他不明分子可能弥补MYH14。

 4.3。MYH14促进NIHL的损失

几个老鼠突变体的证据显示,AHL的发病机制和NIHL是高度相似的在大多数情况下 17, 18]。在我们的研究中,Myh14−−/老鼠用于调查的角色MYH14 NIHL机制。我们发现,废除Myh14增加老鼠对听觉损伤的易感性。在野生型小鼠,105分贝噪声暴露4 h造成TTS,和他们的ABR阈值恢复噪声暴露后两周。然而,突变小鼠表现出恢复受损的ABR阈值。此外,更多的观察HC损失(主要是ohc)突变小鼠相比,控制噪声暴露后两周。符合之前的报道( 43- - - - - - 45),我们的研究结果表明,ohc包含ihc相比更容易受到噪声。没有复苏的ABR阈值突变小鼠可能部分永久HC损失造成的耳蜗。

此外,我们发现没有明显的差异螺旋神经节和侧壁(另外两个地方容易受到噪声暴露)Myh14之间−−/和控制噪声暴露后的老鼠。因此,我们的研究结果表明,在高碳钢MYH14扮演着不可或缺的角色,相比其他地区的耳蜗。在一起,这些发现表明,MYH14可能发挥有益作用的保护耳蜗后声刺激在CBA / CaJ鼠标线。

我们试图确定Myh14的机制−−/老鼠容易NIHL。因为MYH14定位在顶端连接鼠标高碳钢,我们研究ZO-1和上皮细胞的表达结蛋白MYH14−−/老鼠噪声暴露后用免疫荧光分析,然后与对照组比较。我们发现没有统计上显著的差异这两个Myh14蛋白质−−/老鼠相比,控制。然后,如何MYH14不足导致更多的噪声暴露后HC损失吗?可能的解释是,亏损MYH14会损坏离子的渗透性在嘈杂的环境。在正常情况下,MYH10可以部分弥补MYH14的功能,但缺乏MYH14使突变小鼠更容易被损坏在ajc相比,控制在一个嘈杂的环境。ajc与长期的损害可能会导致离子浓度的变化,最终导致HC Myh14损失更多−−/老鼠( 46, 47]。然而,这个假设的具体机制需要进一步分析。

 5。结论

我们使用了CRISPR / Cas9技术在CBA / CaJ鼠标应变来生成一个MYH14基因敲除模型。Myh14−−/老鼠更容易受到高强度噪声控制老鼠相比。MYH14可能在NIHL发挥有益的作用。额外的实验是必要的识别机制MYH14有助于NIHL。

 相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

 确认

这项工作是支持由中国自然科学基金(31171194)、中国国家973基础研究项目(2014 cb541703)和山东省科技关键项目(2009 gg10002039)。

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