大鼠出生后发育过程中Prestin表达与听觉脑干反应的同步进展

摘要

普雷汀是哺乳动物内耳的耳蜗外毛细胞（OCCS）中表达的电机蛋白。普雷斯汀驱动的OCCs的电势负责耳蜗扩增，这是成年动物正常听力所必需的。普雷斯汀和OCCs活性的后期表达可能有助于啮齿动物的听力成熟。然而，在开发过程中幼耳蛋白在幼耳子中的时间和空间表达并不具备很好的表现。在本研究中，我们研究了产后大鼠耳蜗的顶端，中间和基础上的OCCS中普生素的表达和功能。普雷斯汀首先出现在后期6天（P6）的基础转弯，中转P7，以及用于耳蜗顶圈的P9。在接下来的几天内，表达水平逐渐增加，P14达到了所有三个段的成熟水平。通过比较不同频率的听觉脑干响应的时间过程，我们的数据揭示了与听力发展同步的普发汀表达。本研究表明，听力的起始时间可能需要普雷斯汀的表达，并且由OCCS的成熟功能决定。

1.介绍

哺乳动物的听觉具有令人难以置信的灵敏度和灵敏的频率选择性。然而，在包括啮齿动物在内的许多物种中，听觉功能是在出生后发育的。大鼠在出生后第10 ~ 11天(P10-P11)之前无法从初级听觉皮层神经元获得动作电位[1，2］.因此，这个大约在P10的时期是大鼠听觉发育的重要阶段，被称为“听力发作”。在随后的几天内，听力灵敏度迅速增加，P11-P14的最小听力阈值下降约30-50 dB，达到成人水平[2，3.］.听觉感知的成熟需要完成听觉外围和中枢听觉系统的结构和功能发展。一些重要的研究已经对中枢神经元的成熟和突触连接的细化进行了研究[4，5］.体内膜片钳数据显示，在听力发作前，皮质神经元中观察到阈下听觉输入[3.，6］.这些报告表明，在听力发作之前开发了耳蜗功能。

摘要耳蜗的形态和功能发育已经得到了广泛的研究。内毛细胞(ihc)和外毛细胞(OHCs)是哺乳动物耳蜗中的两种感觉细胞。ohc将声音振动转换成电信号，并在声波频率下改变细胞长度[7，8］.这些形状的变化，被称为电动势，被认为是机械反馈过程的一部分，放大低电平的声音[7，9］.OHCs运动产生的耳蜗放大使微弱声音的灵敏度提高40-60 dB [9，10］.OHC的电动力是由一种名为prestin的运动蛋白提供的，这种蛋白位于OHC的侧膜中。在膜电压变化的驱动下，细胞内的氯离子进出prestin分子，从而触发prestin在长、短状态之间的构象开关[10，11］.有趣的是，OHCs的形态和功能成熟发生在出生后年龄[12，13］.Belyantseva等人报道，prestin表达在出生后逐渐增加，其时间进程与电动势相一致[14］.这些发现表明，ihc的电性可能是发育成熟听力的一个重要限制因素。

听觉脑干反应（ABR）可能是对声音刺激的整体神经反应的重要表现，通常认为与体内听觉功能有关。因此，在本研究中，我们研究了出生后大鼠ABR的发育和prestin的表达。我们的结果表明stin与ABR发展的时间进程相吻合。

2.材料和方法

2．1．实验动物

成年(2 ~ 3个月大)Sprague-Dawley大鼠和出生后0日(P0)至P14日的大鼠幼仔。这些动物被维持在12小时光照/12小时黑暗的计划中，可以免费获得水和标准饮食。所有研究均按照中国《防止虐待动物法》进行，并获得南方医科大学实验动物中心的许可。

2．2.上记录

实验分别在P0-P14岁幼鼠和成年大鼠上进行。简单地说，每只动物都被腹腔注射戊巴比妥钠麻醉(幼犬22毫克/公斤，成年犬30毫克/公斤)。然后，动物被放在一个隔音室的防振台上。在ABR记录期间，用加热垫将动物的体温维持在37.5℃。在颅骨顶部放置真皮下电极针。地面放置于左外耳廓腹外侧，参考物放置于右外耳廓腹外侧。使用TDT SigGenRP软件(Tucker-Davis Technologies)生成校准刺激。使用距动物50厘米的校准TDT ES1扬声器，可以看到不同频率(1,2,4,8,16,24和32khz)和强度(0-90 dB声压级，5 dB间隔)的音调突发(1 ms上升/下降，3 ms平台)。频率-振幅扫描由计算机控制(TDT System 3, Tucker-Davis Technologies)，并按随机顺序进行。每个频率-振幅组合以每秒10次的频率重复256次。 The ABR signals were filtered (100–1000 Hz), amplified and averaged using TDT hardware (TDT System 3, Tucker-Davis Technologies), and recorded using BioSigRP software (Tucker-Davis Technologies). Hearing thresholds were determined by visual inspection of ABR waveforms and defined as the minimum intensity at which averaged waveforms could be distinguished. Data were stored for offline analysis. The entire recording for one animal spanned about 40 minutes.

2．3.免疫荧光染色

将幼鼠和成年Sprague-Dawley大鼠的颞骨分离并放入L-15培养基(Invitrogen, Carlsbad, CA)。Corti的器官被分离出来并被切成三段，分别代表基部、中部和顶端的轮匝。用4%多聚甲醛在0.1 M PBS (pH 7.4)中固定组织，25°C 2小时。用PBS洗净后,组织孵化在阻止溶液BSA在PBS山羊血清(10%和1%)与0.3% Triton x - 100在室温下20分钟,然后孵化与主要抗体prestin糖(1:200年,圣克鲁斯生物技术公司,圣克鲁斯,CA)一夜之间在4°C。PBS洗净一抗后，将组织样本与Alexa Fluor 488结合的二抗(1:600;Invitrogen，卡尔斯巴德，CA)在室温下阻断溶液1小时。用异硫氰酸四甲基罗丹明标记的phalloidin进行静纤毛反染色(TRITC-phalloidin, 1: 200;Sigma, St. Louis, MO, USA)室温下加热20分钟。在PBS中洗涤三次后，使用延长抗褪色试剂(Invitrogen, Carlsbad, CA)将样品安装在载玻片和盖玻片之间。荧光图像由尼康显微镜(尼康，A1+，日本)使用20倍或40倍物镜获得。

２.４.免疫印迹

Western blot按照我们之前的研究进行[15］.简而言之，在添加cOmplete™蛋白酶抑制剂(Roche)的裂解缓冲液(50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 1%脱氧胆酸钠，0.1% SDS)中分离并均质Corti器官的顶端拐弯。冰冻孵育30 min后，4℃，12,000 rpm离心15 min，收集上清作进一步分析。随后,20μg耳蜗总蛋白用8% SDS-PAGE分离，转移到硝酸纤维素膜(Millipore)上。用含0.1% Tween 20的TBS用5%脱脂牛奶阻断后，将膜与一抗(Sigma, St. Louis, MO, USA)在4°C的摇床上过夜，然后在室温下与辣根过氧化物酶结合的二抗(Invitrogen, Carlsbad, CA)孵育1小时。通过增强化学发光检测免疫反应条带，并使用Amersham Imager™600 (GE Healthcare)进行可视化。根据制造商的说明，使用ImageQuant™TL图像分析软件(GE Healthcare)对Prestin和GAPDH条带进行量化。

2．5．膜片钳记录和非线性电容测量

用一氧化碳麻醉动物₂吸入和斩首。耳蜗从颞骨迅速移除，并置于填充有冰冷的Leibovitz的L-15媒体（Invitrogen，Carlsbad，CA）的培养皿中。将Corti的器官从耳蜗的顶圈中分离出来，并用胶原酶接受轻度酶消化5分钟（2mg / ml胶原酶IV，Sigma，St.Louis，Mo）。在温和移液后，将细胞转移到填充有酶L-15培养基（〜1.5mL）的小塑料室，补充有10mM Hepes（pH 7.35和300 mOSM）。然后将腔室放在尼康倒数显微镜（Eclipse Ti-S，尼康，日本）的舞台上，用摄像机（DS-Fi1c，尼康，日本）。选择健康的孤立的OCCS用于电生理实验。呈现出任何收缩，肿胀或损坏的任何迹象的细胞被排除在贴片夹录制之外。如我们以前的出版物中所述测量非线性电容（NLC）[16- - - - - -19］.用吸管拔出器(P97, Sutter)拉动记录膜片移液管，并回填细胞内溶液(140 CsCl, 10 EGTA, 2 MgCl)₂， 10 HEPES在mM, 305 mOsm和pH 7.35)。贴片移液管在浴液中的初始阻力通常为2.5-3.5 MΩ。使用Axopatch 200B放大器和1440 a /D转换器(Molecular Devices, CA, USA)在全细胞配置下进行经典膜片钳记录。OHCs的膜电容测量采用双正弦波电压刺激协议，保持电位为0 mV [20.］.使用jClamp软件(Scisoft, New Haven, CT)控制刺激并获取数据。使用OriginPro软件(OriginLab Corporation, Northampton, MA)进行离线数据分析。NLC可以用双态玻尔兹曼函数拟合，并能反映非线性电荷运动到膜电压[21］.电容拟合的玻尔兹曼函数描述为 四个参数(，，,)，由公式与prestin的功能活性有关:为通过膜的最大电荷转移量;(或)为发生最大电荷运动时的膜电压，或等效为电容-电压函数的峰值;为线性电容;和表示电压依赖性的斜率(,在那里是玻尔兹曼常数，是绝对温度，价电子是电荷运动，和为电子电荷)。是由细胞膜的表面积决定的。为了比较不同细胞大小的ohc获得的NLC的大小值，我们将NLC归一化来．

2.6。OHC长度测量

如上所述，从Corti的器官中分离出OHCs。简而言之，将Corti器官迅速从耳蜗中取出，在冰冷的L-15培养基中均匀切成三段。经过温和的酶解5min (2mg /mL胶原酶IV, Sigma, St. Louis, MO)，组织转移到一个充满无酶的L-15培养基(7.35 pH, 300 mOsm)的小塑料室。毛细胞被温和的磨损组织与100μl Hamilton注射器和25克针。通过使用该技术，可以获得相当大量的分离的毛细胞。将含有毛细胞的腔室置于尼康倒置显微镜（Eclipse Ti-S，日本）的阶段，配备有摄像机（DS-Fi1c，日本）。由于它们的形态，在大多数准备中，IHC和OHC都很容易识别。通常，OHCs显示出较大的轴直径比，而IHCs具有紧密的颈部[22］.角质层板和细胞轴之间的夹角是识别OHCs和ihc的另一个重要标志。使用摄像机捕捉到看似健康的独立OHCs的图像。离线测量ohc细胞长度。

2.7。统计分析

结果以平均值±标准差表示。学生的t-检验用于检验不同出生后年龄数据间差异的显著性。意义被定义为．使用Excel和OriginPro程序进行计算、数据拟合和绘图。

3.结果

记录从出生后0天(P0)到P14天各年龄段大鼠的ABR波形。在出生后的头几天，没有观察到ABR信号，无论声音刺激的频率和声学刺激的类型(音调爆发，点击，或噪音)。早在P6时就可检测到高频音突发的ABR。只有在频率高于20 kHz且强度相对较高的刺激(阈值> 75 dB SPL;6只动物中的5只)。在随后的三天中，ABR发生了迅速的变化，通过P9, ABR可以很容易地识别所有测试频率。数字1(一)显示了典型的ABR录音，音调爆发在1,16和32千赫频率，从老鼠幼鼠在P9。因为I波是最一致和最稳健的分量，它被用来估计ABR阈值(图1(一)箭头)。不同出生后年龄的音调刺激阈值如图所示1 (b)．从P9到P14, ABR阈值随年龄的增加而逐渐降低，但不同频率的ABR阈值受影响程度不同。对于高于24khz的频率，6只动物中有5只早在P6时就出现了ABR反应。P6、P7、P9、P11和P14对32 kHz音调反应的平均阈值(±SD)为，，，,dB声压级(图1 (c))， P14的阈值与成年动物无显著差异(分贝,，t以及)。7只动物中有7只在P7时首次观察到中频(4 - 16khz) abr。P7、P9、P11和P14对16khz音调反应的平均阈值(±SD)为，，,dB声压级(图1 (c))．成人门槛(dB SPL)明显低于P14时(，t以及)。低频率(<2 kHz)的abr直到P9出现。P9、P11和P14对1khz音调反应的平均阈值(±SD)为，,dB声压级(图1 (c))，而P14的阈值与成人没有差异(分贝,，t以及)。我们的数据显示，在大多数频率测试中，P14的ABR阈值接近成人水平。图中的箭头1 (c)表示不同频率ABR出现的第一天。

因为ABR的波形I代表耳蜗的反应，我们的数据显示，耳蜗功能在P6和P14之间发展。OHCs的电性对耳蜗反应有重要作用。我们的结果表明，在此期间，ohc很可能作为耳蜗放大器参与声音刺激的反应。OHCs的电动势是由位于侧膜上的运动蛋白prestin产生的。为了研究prestin在发展中的OHCs中的密度和位置，我们进行了prestin的免疫标记，并在共聚焦显微镜下沿耳蜗长度采集图像。数字2共聚焦显微镜显示P5 ~ P14大鼠幼鼠耳蜗顶端、中部和基底圈的OHCs。对于P5和P7的顶旋，毛束的罗丹明-phalloidin染色显示了确定顶表面的ohc。细胞核DAPI染色显示为OHCs的底部区域。如图所示2， P5时沿整个耳蜗OHCs均未检测到prestin。在位于耳蜗基底部的OHCs中，prestin首先在P6到P7处表达，并在接下来的一周中持续增加。Prestin的表达在空间和时间上都有进展，基底OHCs比顶端OHCs早4天表达。通过P14，在所有三个片段中都观察到强大的环状荧光。

为了量化在发育过程中观察到的prestin表达水平的变化，我们使用western blotting方法测量了不同出生后年龄的顶端ohc中prestin的免疫带强度。如图所示的代表性免疫带3(一个)， prestin的表达呈年龄依赖性增加。数字3 (b)展示从标准化后的四个独立实验到GAPDH，内部对照蛋白的平均值（±SD）表达水平。在出生后的前五天中，普生素的表达仍然很低，并且在P9和P14之间发生普生素强度最突出的增加。虽然P14后普生素水平略有增加，但在P14和成年的水平之间没有观察到显着差异。

prestin在哺乳动物ohc中表达的两个基本电生理特性通常被用来研究其功能:NLC和电动力。在哺乳动物中NLC和电性是完全耦合的[21，23，24］.由于NLC可以在实验上方便而准确地测量，因此在下面的实验中，它被用作评价prestin功能发展的一种分析方法。在成年啮齿动物的OHCs中，NLC对膜电位呈钟形依赖，峰值约为−70 mV [21］.如图所示4，我们比较了从P6到P14顶端OHCs记录的NLC与成人OHCs。为了消除不同细胞大小的影响，NLC的大小被标准化为(表示热含量的表面积)。数字4(一)结果显示，在P6时，9个ohc中有4个首次检测到NLC反应，强度非常小(图)4(一),黑色线)。从P9测量的所有热含量中记录了强大的NLC反应，并且在研究的整个发展时期中这种反应都在增加。在P14时，NLC达到了与成人相当的水平。用双态玻尔兹曼函数拟合曲线得到的参数如图所示4 (b)- - - - - -4 (e)．很明显在早期发育阶段(P6)相对较低(−mV);然而，在九年级以上的孩子，增加到成人水平(−mV,图4 (b))．缴送工作/和都与移动电荷密度或激活的prestin量相关。这些值越大，表示在电压刺激过程中移位的电荷越多。如图所示4（c）和4 (d),缴送工作/和在P6和P14之间增加，这些值在P14达到到期。电压灵敏度或价态，，在所有年龄段都保持稳定(图4 (e)，，t以及)。

由于电动势沿OHC的纵轴发生，因此OHC长度对耳蜗放大至关重要。在prestin表达水平和活性相同的情况下，OHCs越长，产生的运动性越明显，因此可以进行更大的耳蜗放大。我们测量了沿着基底膜从不同的节段分离的OHCs的细胞长度。数字5结果表明，热含量持续增加，从P0到P14呈s形上升。在此期间，基底热含量有轻微变化，而顶端热含量持续增长，直到大约P11。基底、中部和顶端的OHCs分别在P5、P8和P11达到成虫长度(图中星号表示)5)，顶端热含量比中部和基底热含量成熟晚。

4.讨论

在本研究中，我们使用ABR来测量发育中的幼鼠的听力敏感度。ABR是一种复合诱发电位，由听觉系统沿上行通路不同阶段的声学反应衍生而来。一般认为ABR波形的不同延迟峰是由不同的脑干核产生的[25］.耳蜗的反应和听神经的反应分别主要负责I峰和II峰。峰III至峰V(在一些研究中观察到多达7个峰)代表来自耳蜗核和其他脑干核更高水平的反应。与成年动物的记录相比，我们的数据显示P14以下幼犬的ABR波形具有一些特殊的特征。在刺激开始后的最初8毫秒内，只有3到4个明显的波被识别出来，如图所示1．峰值I的潜伏期与之前发表的成年人的例子非常相似(例如， ms in P9 pups versus成人为32千赫，90分贝声压级音调)[26］.因此，我们的结果表明，在发育大鼠中，高水平听核的声学反应是缺失的。虽然我们没有研究中央听觉系统单个核核的反应发育，但我们的结果表明，中央听觉神经元的功能成熟比耳蜗晚，耳蜗信号输入是听觉系统发育所必需的。这一假设得到了最近的证据的支持，这些证据来自于皮层听觉神经元的活体膜片钳记录。在P12前，兴奋性和抑制性突触输入不协调且暂时失衡;因此，在听力发作前很少记录动作电位[3.，6］.这些结果表明，耳蜗反应的发生早于听觉皮层突触的细化。我们的结果还表明，早在P6-P9时ABR反应就可以检测到，尽管不同频率的时间线不同(图)1)．

然而，耳蜗反应的发生机制和耳蜗功能成熟时间的确定机制尚不清楚。很明显，在耳蜗发育过程中发生了大量的形态和功能变化。大鼠的耳蜗结构在出生后的早期就形成了;中耳发育良好，耳道在听力发作前已打开[27- - - - - -29].毛细胞和支持细胞的分化以及螺旋神经节神经元的神经支配在胚胎期完成[13，30.- - - - - -35］.毛束的形态发育和机电转导的功能成熟在出生后第6天之前完成[13，28，29，36，37］.因为根据我们的ABR波形分析，耳蜗反应在P6-P9开始出现，所以上述过程不太可能决定耳蜗反应的开始。在大鼠中，皮质神经元对声音刺激的动作电位在P10-P11处首次被记录。只有对相对高强度的刺激才有反应。在随后的3天发生了迅速的变化，P14时，听觉皮层显示出成人样的兴奋反应。最显著的变化是40-50 dB阈值降低[1，2］.听力敏感度的这种戏剧性变化暗示了在这一时期调节听力系统敏感度的机制的参与。

耳蜗放大使我们的听力具有极高的灵敏度，强度范围非常大[38］.哺乳动物耳蜗放大归因于ohc, ohc可以根据与声波同步的膜电位变化而改变细胞长度[7］.这种被称为电动力的活动是由OHC侧膜中独特的运动蛋白prestin提供动力的[11］.我们的研究表明，prestin首先在P6表达(图2)，在P14时达到成体表达水平(图)3.和4)．这一时期与耳蜗功能开始时密切相关(图)1)．在大鼠和小鼠两种物种中研究了prestin的发育表达模式[14，39］.Belyantseva等人报道，prestin表达开始于出生后0天，并在与电动力相一致的时间进程中逐渐增加[14］.我们的结果似乎与这些数据不一致。prestin在耳蜗内不同位置(基转、中转和根尖转)OHCs中的表达并不同步，在P9基转、P10-P11中间转和P12根尖转达到成熟水平(图)2和3.)．我们的结果得到了其他物种ohc功能测量的支持。在小鼠和沙鼠中，OHCs的NLC和电动势在P6时首次检测到，在P12-P15时达到成年水平[12，39］.然而，在大鼠的发育过程中，prestin的表达和ohc的电动势是同步的。

在本研究中，我们没有直接测量OHCs的运动。哺乳动物热盐中NLC和电性完全耦合[21，23，24]，前者可以准确评价[16- - - - - -19］.我们的NLC测量显示，对于顶端OHCs, prestin的功能首次出现在P9，并在P14达到成熟水平(图)4)．这一结果与小鼠所记录的数据一致[39］.这种功能测量也与我们的免疫荧光染色和western blot结果一致(图)2和3.)．因此，我们提出，听觉中枢神经系统的发育，表现为ABR反应敏感性的增加，发生在ohc运动蛋白prestin的功能成熟。

OHCs的表达水平和功能活性之外，细胞长度肯定是影响OHCs整体运动大小的重要因素。如图所示5，达到成熟细胞长度的时间分别是基础，中间和顶端OHCs的P5，P8和P11。这些时间点比普生表达的那些时间点更早。因此，我们得出结论，细胞长度发展不太可能限制因子来确定耳蜗功能的开始时间。很好地确定了耳蜗的基底段对高频刺激作出响应，而更多顶端部分被调谐到低频。我们的数据显示，普雷斯汀的空间和时间表达模式和听觉脑干反应的发展是非常一致的。普雷斯汀的表达和功能发展更可能在听证的成熟方面发挥关键作用。

5.结论

总之，我们的结果表明，prestin的表达模式和OHCs的NLC功能与听性脑干反应的发展是同步的。这一发现提示prestin的表达和功能发育可能决定了大鼠听力的开始。

竞争利益

两位作者宣称他们没有相互竞争的利益。

致谢

973计划资助项目(no . 2014CB943002);国家自然科学基金资助项目(no . 31271179, no . 31500841)。关键词:岩石力学，数值模拟，数值模拟

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