Prestin马达蛋白表达在耳蜗外毛细胞(ohc)哺乳动物内耳。的electromotility ohc由prestin所需负责的耳蜗放大在成年动物正常听力。产后的表达prestin ohc和活动可能导致听力的成熟啮齿动物。然而,时间和空间的表达在耳蜗prestin发展不是很透彻了。在目前的研究中,我们审查的表达和功能prestin ohc的顶端,中间,和基底的cochleae产后老鼠。Prestin首次出现在产后6天(P6)基底,P7在中间,票数顶端的耳蜗。表达水平逐渐增加在接下来的几天里,好为所有三个部分达到成熟的水平。相比之下,当然对不同频率听觉脑干反应的发展,我们的数据显示,prestin表达式与听力同步发展。目前的研究表明,听力的发病时间可能需要prestin的表达,是由成熟ohc的函数。
一个bstract>哺乳动物的听觉特征是难以置信的敏感性和精致的频率选择性。然而,在许多物种包括啮齿动物,出生后的听觉功能开发。在老鼠身上,动作电位不能获得从初级听觉皮层的神经元在产后前几天10到11 (P10-P11) [
耳蜗的形态和功能的发展已被广泛研究。内毛细胞(包含ihc)和外毛细胞(ohc)是两种类型的哺乳动物耳蜗感觉细胞。ohc声音振动转换成电信号和改变他们的细胞长度在声波频率(
听觉脑干反应(核)可能全球神经反应的一个重要表现声音刺激和体内通常被认为是与听觉功能。因此,在本研究中,我们研究了ABR的发展和在产后prestin老鼠的表达。我们的研究结果表明,prestin配合时间的表达和功能上的发展。
成人(2到3个月大)Sprague-Dawley老鼠和老鼠幼崽从出生后第0天(P0)好被用于这项研究。动物们保持12小时光/ 12小时黑暗时间表和免费的水和一个标准的饮食。所有的研究都是依照中国执行防止虐待动物行为和权限是来自南方医科大学实验动物中心。
实验进行鼠崽P0-P14成年老鼠。简而言之,每个动物麻醉的腹腔内注射戊巴比妥钠(22毫克/公斤幼崽和成年人30毫克/公斤)。然后,动物被放在一个表在一个隔音室防振。动物的体温维持在37.5°C和加热垫在ABR录音。一个皮下的电极针放置在头骨顶点。地面被左腹外侧的外耳廓,和参考腹外侧向右外部耳廓。校准刺激生成使用TDT SigGenRP软件(Tucker-Davis技术)。语气破裂(1上升/下降女士3 ms高原)各种频率(1、2、4、8、16、24、32 kHz)和强度(0 - 90分贝每隔5 dB)提出了使用校准TDT ES1扬声器位于50厘米远离动物。frequency-amplitude扫描是计算机控制(TDT系统3、Tucker-Davis技术),并在一个随机序列。每个frequency-amplitude组合重复了256次的速度10脉冲/秒。 The ABR signals were filtered (100–1000 Hz), amplified and averaged using TDT hardware (TDT System 3, Tucker-Davis Technologies), and recorded using BioSigRP software (Tucker-Davis Technologies). Hearing thresholds were determined by visual inspection of ABR waveforms and defined as the minimum intensity at which averaged waveforms could be distinguished. Data were stored for offline analysis. The entire recording for one animal spanned about 40 minutes.
颞骨的幼崽和成人Sprague-Dawley老鼠孤立和媒体放在l - 15(表达载体,卡尔斯巴德,CA)。螺旋器被隔离和代表基底均匀切成三块,中间,顶端。组织与4%多聚甲醛固定在0.1 PBS (pH值7.4)25°C 2小时。用PBS洗净后,组织孵化在阻止溶液BSA在PBS山羊血清(10%和1%)与0.3% Triton x - 100在室温下20分钟,然后孵化与主要抗体prestin糖(1:200年,圣克鲁斯生物技术公司,圣克鲁斯,CA)一夜之间在4°C。后主要抗体与PBS完全冲毁,Alexa的组织样本孵化萤石488 -共轭二次抗体(1:600;表达载体,卡尔斯巴德,CA)阻止溶液在室温下1 h。静纤毛的对比染色使用phalloidin执行用四甲基异硫氰酸罗丹明标记(TRITC-phalloidin, 1: 200;σ,圣路易斯,密苏里州,美国)在室温下20分钟。在PBS清洗三次后,样本安装滑动和盖玻片之间使用延长不变色试剂(表达载体,卡尔斯巴德,CA)。荧光图像得到用尼康显微镜(日本尼康,A1 +)使用20或40 x的目标。
如我们之前所述执行免疫印迹研究[
动物麻醉的有限公司2吸入和斩首。耳蜗迅速远离颞骨,放置在培养皿中满是冰冷的莱博维茨的l - 15媒体(表达载体,卡尔斯巴德,CA)。螺旋器被隔离的顶端的耳蜗,经历了温和的酶和胶原酶消化5分钟(2毫克/毫升胶原酶IV,σ,圣路易斯,密苏里州)。温柔的移液后,细胞被转移到一个小塑料箱装满enzyme-free l - 15介质(~ 1.5毫升)补充10毫米玫瑰(pH值7.35和300 mOsm)。当时室放置在舞台上的尼康倒置显微镜(Eclipse Ti-S、尼康、日本),摄像机(DS-Fi1c、尼康、日本)。Healthy-appearing孤立ohc被选为电生理实验。细胞表现出任何收缩、肿胀或损害被排除在膜片箝记录。非线性电容(缴送工作)是衡量我们之前的出版物中描述(
ohc被孤立于螺旋器如上所述。在短暂的,螺旋器迅速从耳蜗和均匀切成三块冰冷的l - 15的媒介。温和的酶消化后5分钟(2毫克/毫升胶原酶IV,σ,圣路易斯,密苏里州),组织被转移到一个小塑料箱装满enzyme-free l - 15中(pH值7.35,300 mOsm)。温和的磨碎头发细胞分离的组织,100年<我t一个l我c>
μ我t一个l我c>L汉密尔顿注射器和25 G针。通过使用这种技术,相当大量的孤立的毛细胞可以获得。包含毛细胞的室放置在舞台上的尼康倒置显微镜(Eclipse Ti-S、尼康、日本)配备一台摄像机(DS-Fi1c、尼康、日本)。因为他们的形态,在大多数准备,包含ihc, ohc很容易辨认。通常,ohc显示大axis-diameter比率,而包含ihc颈部紧(
结果提出了均值±SD。学生的<我t一个l我c>
t我t一个l我c>以及用于检查的意义区别不同产后获得的数据。意义被定义为<我nl我ne- - - - - -formula>
一个BR波形记录从老鼠幼崽在不同产后年龄从天0 (P0)好。在出生后的前几天,没有观察到信号上,不管声音刺激的频率和类型的声波刺激利用(语气破裂,点击,或噪音)。上的高频音破裂早在P6检测到。反应只是找刺激的频率高于20 kHz相对高强度(阈值> 75分贝;5 6的动物)。快速变化发生在接下来的三天,,通过票数,ABR可容易地确定所有频率测试。图
因为ABR波形我代表响应引起的耳蜗,我们的数据表明,耳蜗功能开发P6和好之间的关系。ohc的electromotility导致耳蜗响应的重要原因。我们的结果表明,在此期间,ohc很可能参与了对声音的反应刺激耳蜗放大器。ohc的electromotility prestin电动机产生的蛋白质,这是位于外膜。调查的密度和位置prestin发展中ohc immunolabeling prestin的执行和图片收集沿着耳蜗的共焦显微镜。图
共焦图像在ohc prestin表达各种产后。Prestin免疫反应性测量的三个部分(基底,中间,和顶端)沿着耳蜗。P5和P7顶端,头发束与rhodamine-phalloidin标记(红色),头发的细胞核与DAPI染色(蓝色),prestin是用绿色标记。三个不同的焦平面图像的头发束(ohc的顶端表面来表示),上部侧壁的,核被合并。没有在P0-P5 prestin荧光(绿色)。为了更好地说明的表达prestin ohc的侧壁上,只显示后P7绿色通道。Prestin表达时空上的进展。比例尺代表20<我t一个l我c> μ我t一个l我c>m。
为了量化prestin的观察表达水平变化在开发期间,我们测量了immunoband prestin强度在顶端ohc产后不同年龄段使用西方墨点法。由代表immunobands图如图所示
表达prestin在大鼠耳蜗的发展。(一)代表prestin和GAPDH immunobands从西方的屁股被发现在81 kD和36 kD。GAPDH是用作内部控制。(b)的相对表达prestin (GAPDH所有规范化)在不同产后。比较上面所示的酒吧相关列。数据来自四个独立的实验,用平均数±标准差表示。<我nl我ne- - - - - -formula>
两个基本电生理属性通常用于探测的功能prestin表达哺乳动物ohc:缴送工作和electromotility。缴送工作和electromotility完全耦合的哺乳动物
缴送工作从顶端上凸轮轴测量各种产后年龄。(一)意味着NLC-voltage反应被安装了玻耳兹曼函数(颜色编码重线)。缴送工作规范化,<我nl我ne- - - - - -formula>
因为electromotility发生沿纵轴上凸轮轴,人们普遍认为OHC长度对耳蜗放大至关重要。与相同prestin表达水平和活动,时间越长,ohc能产生更重要的能动性,因此进行耳蜗的放大。我们测量ohc孤立的细胞长度从不同段沿底膜。图
OHC长度变化的函数产后的一天。绘制每个数据点的平均值和SD至少50上凸轮轴。恒星显示细胞达到成人的最早的一天长度(<我nl我ne- - - - - -formula>
在这项研究中,我们使用ABR衡量听力灵敏度在发展中老鼠幼崽。ABR是一个复合诱发电位的声学响应中提取出来的不同阶段以及听觉系统的提升途径。人们普遍认为ABR波形的峰值与不同的时间延迟是由不同的脑干核(
然而,耳蜗的发病机制负责响应和确定耳蜗功能的成熟时间尚不清楚。显然,大量的形态和功能变化发生在耳蜗的发展。在大鼠,耳蜗的结构是在出生后早期阶段形成的;耳中耳发育良好,是开放的听证会开始前(
耳蜗放大赋予极高的灵敏度,我们听到一个巨大的强度范围(
在目前的研究中,我们没有直接测量ohc的能动性。缴送工作和electromotility完全耦合在哺乳动物上凸轮轴(
除了表达水平和功能活动,ohc的细胞长度绝对是一个重要因素,影响整体运动性ohc级。如图
总之,我们的结果表明,该表达式模式ohc prestin和nfl功能的听觉脑干反应的发展同步。这个发现表明prestin的表达和功能发展可能确定听到老鼠的发病。
作者宣称没有利益冲突。
这项工作是由973项目支持(2014 cb943002)和中国国家自然科学基金(31271179,31271179)。
一个ck>