文摘

淀粉样蛋白-β肽或β是关键球员在阿尔茨海默病淀粉样级连反应假说。一个β似乎触发细胞死亡,还生产(双边带)的双链断裂老化和老年痴呆症。All-trans维甲酸(RA),维生素a的一个衍生物,已经以其对淀粉样蛋白级联神经保护作用。例如,它减少了生产的β肽及其oligomerisation。我们调查了在目前的工作可能意味着RA受体(RAR)的修复β全身的双边带。我们表明,类风湿性关节炎,以及RAR兴奋剂Am80,但不是AGN 193109拮抗剂,修复β全身的双边带SH-SY5Y细胞和星形细胞以及小鼠皮层组织岁年轻的老鼠。nonhomologous端加入通路和共济失调毛细血管,突变激酶被证明参与RA-mediated双边带SH-SY5Y细胞修复。我们的数据表明,类风湿性关节炎,除了增加皮层细胞生存能力的年轻岁甚至老鼠,也可能导致目标DNA修复基因的重要细胞或突触的维护。这一现象仍将功能点时β增加和RA减少可能导致病理状态。

1。介绍

DNA损伤,如DNA(双边带),单或双链断裂是发生在衰老(1,2)以及阿尔茨海默病(AD) [2- - - - - -6]。最近双边带产生的β或淀粉样蛋白-β肽(7,8)通过氧化应激(9]。此外,β肽不仅增加神经脆弱(如细胞凋亡)依赖dna的蛋白激酶(dna - pk)缺陷小鼠,Nonhomologous端加入的一个关键酶(NHEJ)通路参与双边带修复(10),而且可以减少这种酶的活性(11,12]。因此,细胞外β缩氨酸引发双边带生产和损害双边带修复。

然而,如果众多的因素是形成或水平的提高做出贡献β肽,如主要的年龄,apoE4等位基因、胆固醇油腻的食物或糖皮质激素应激激素地塞米松,其他的因素,如apoE2等位基因和生长因子脑源性神经营养因子,神经保护(13,14)或参与“适应性细胞反应”(15]。其中,有些人甚至减少DNA损伤。这是谷氨酰胺,降低etoposide-induced损害的情况下(16的NAD)和变弱β全身的DNA损伤(8]。

在这项研究中我们特别感兴趣的all-trans维甲酸(RA) (17- - - - - -20.],维生素a的一个衍生物[21]。RA是参与开发,神经元分化(22通过RAR],脊椎形成α受体(23),细胞生长在抗癌疗法(被捕24老化[],和记忆下降25- - - - - -27]。维生素A和RA的神经保护作用在广告和关系β淀粉样蛋白cascade-not DNA DSBs-has深层研究,例如,(28]。首先,RA显示增加,通过其RARα受体,主要的表达α分泌酶,ADAM10 (Disintegrin和金属蛋白酶domain-containing蛋白10),减少生产的β肽(29日]。这一效应是由RA-responsive元素上游的ADAM10编码区(30.,31日]。RA可以抑制γ分泌酶活动通过细胞外信号调节激酶的活化,ERK1/2 [32]。其次,维生素A及其衍生物出现抑制βoligomerisation在体外,一个β沉积,τ磷酸化在AD小鼠模型(33]。第三,RARα删除一个信号β斑块和诱发β寡聚物通过Neprilysin间隙和胰岛素降解酶(34]。相反,一个β增加在大脑血管RAR吗α降低大鼠的大脑皮层上维护一年retinoid-deficient饮食(35]。最后,在APP / PS1 double-transgenic RA治疗后小鼠β存款,上市(淀粉样前体蛋白c端内部域),τ磷酸化,和胶质反应减少,而空间学习提高(36]。

RAR主要参与者在RA的神经保护作用。RA通过绑定允许RAR / RXR形成的形成和更换辅阻遏物,如HDAC(组蛋白脱乙酰酶)、辅活化因子,如海关与边境保护局(CREB-binding蛋白质)。海关与边境保护局的组蛋白乙酰转移酶活性37)和下调DNA甲基转移酶(24导致RA-dependent转录。事实上,RA hypomethylates推动者,比如RAR之一β2 -甲基转移酶的改变基因转录(24]。

根据这些数据,我们想知道,由于当地染色体放松,DNA修复蛋白(2),如催化亚基的dna - pk和共济失调毛细血管,突变激酶(ATM),可以在染色体网站招募RA-dependent基因表达在这些网站,如果双边带可以修好。我们已经调查了RA及其受体(RAR)是否参与,没有预防的β合成,βoligomerisation斑块移除,已经显示,但在修复的β全身的双边带。我们给我们的知识的这种情况确实是通过研究神经元和星形细胞系以及从年轻和年老小鼠皮层组织。此外,我们检查了修复机制和影响细胞的生存能力,在寻找有效治疗早期广告。

2。材料和方法

2.1。老鼠、组织样本和解剖

雄性C57BL / 6 j小鼠(Janvier、Le Genest-St-Isle、法国)牺牲在4个月(年轻人)和16个月(岁成年人)。大脑被迅速删除,皮质双目显微镜下解剖,加权和均质(约5秒Polytron装置,VWR国际)在neurobasal介质(Gibco生命技术)。均质组织立即被处理如下所述。动物是依照联邦瑞士兽医法规和批准。

2.2。文化神经SH-SY5Y细胞和星形DI过渡委员会1细胞

人类SH-SY5Y细胞(欧洲的动物细胞培养、英国)是通常生长在包含5%的37°C孵化器有限公司2/ 95%湿润空气rpmi - 1640 (Gibco生命技术)为10% FCS (Bioconcept、瑞士),2毫米谷酰胺(Gibco生命技术)100国际单位/毫升青霉素G和100μg / mL链霉素(表达载体)。细胞每5到6天减半。为此,汇合的细胞被释放在DPBS(150毫米氯化钠,氯化钾3毫米,1.5毫米KH2阿宝4,7.9毫米Na2HPO4h·22啊,和0.1毫米EDTA;pH值7.4),在1000转离心5分钟,resuspended rpmi - 1640和10% FCS在所需的稀释。

DI过渡委员会1细胞系(38,39)是生长在DMEM培养基(σ)补充10% FCS包含5%的37°C孵化器有限公司2湿润的空气/ 95%。融合性的细胞被释放在胰蛋白酶溶液(0.25%),在1100转离心5分钟,在DMEM 10% FCS resuspended所需的稀释。

细胞被拍到与一个倒置相差显微镜(蔡司Telaval 31)使用照片相机(490年徕卡DFC)与FireCam分析师软件(莱卡)。

2.3。组织和细胞治疗

细胞治疗,前两天实验,中有10% FCS与1% FCS媒介所取代。培养细胞和均质皮质组织(见前)治疗20μM单体的β1-42肽(恩佐生命科学),第一个30分钟,然后有或没有5μM RA (Sigma-Aldrich) 30多分钟,导致四个2×30分钟的组合疗法(Ø-Ø;一个β1-42-Ø;Ø-RA;一个β1-42ra)。其他疗法进行了20μ米一个β42-1,20μ米一个β1-40(恩佐生命科学),10μM RARα/β受体激动剂Am80(圣克鲁斯生物技术),1-50μM RARα/β/γ拮抗剂AGN 193109 (Labforce), 50μM caspase-3抑制剂z-VAD-FMK(圣克鲁斯生物技术)40),3μM HDAC抑制剂trichostatin (TSA;σ)[41),10μM抑制剂的共济失调毛细血管,突变激酶或ATM KU 55933 (KU;Labforce), 150年μM抑制剂二催化亚基的dna - pkν7026(ν;Calbiochem),结合RA和/或一个β1-4230分钟或24小时。所有的治疗方法都进行了一式三份包含5%的37°C孵化器有限公司2和95%的湿润空气。

2.4。中性单细胞凝胶电泳(彗星试验)

双边带测量SH-SY5Y细胞,DI过渡委员会1在均质皮层组织细胞,使用Trevigen彗星AssayTM工具包(AMS生物技术、英国)以下修改。治疗后,细胞在冰冷的Ca resuspended2 +和毫克2 +免费PBS的浓度为1.0 - 1.5×105细胞/毫升。相同数量的细胞分离皮层组织resuspended在同一个解决方案的20毫米EDTA和处理的细胞培养。一个整除的50μL细胞增加了500人μL 1%的熔融低熔点的琼脂糖(美国FMC BioProduct Seaplaque)保持在42°C。50毫升水中立即被彗星幻灯片上传播生物技术(AMS),这是在4°C的环境在黑暗中10分钟加速琼脂糖胶凝,然后转移到prechilled溶解溶液生物技术(AMS) 60分钟在4°C。随后,中性的下滑是孵化电泳缓冲(500毫米三基地,1.5醋酸钠,pH值9.0)在4°C 30分钟。双边带的电泳分离26 V 45分钟。然后,幻灯片是在70%乙醇室温浸泡30分钟,风干。DNA染色10分钟与100年在室温下μL SYBR绿色染料(Gibco生命技术)稀释1:1000年的水,然后用蒸馏水冲洗。至少30细胞彗星每治疗立即拍照使用奥林巴斯数码相机连接到一个奥林巴斯BX51荧光显微镜数字化(rel Axio愿景。4.6)。

2.5。在琼脂糖凝胶电泳分析双边带

可视化的平均尾长度对细胞群,10μL SH-SY5Y细胞(1×105细胞/毫升)和5μL裂解缓冲生物技术(AMS)在4°C,然后5分钟1.5μL三EDTA增加了10倍。整个样本加载到一个槽的议员1%琼脂糖凝胶(罗氏生命科学)。1 kb梯(英杰公司)被用作标记大小。电泳跑40分钟66 mV。琼脂糖凝胶是由溴化乙锭染色(10毫克/毫升)和分析以gs - 700成像密度计(Bio-Rad)。与分子信号强度测量分析软件(Bio-Rad)。

2.6。免疫细胞化学

皮质的4 - ( 雄性老鼠)和16个月C57BL / 6 j ( )机械分离和固定在4%多聚甲醛在室温下30分钟PBS盖玻片使用100%酒精。与PBS冲洗3×5分钟后,细胞被孵化1 h30与主抗体在PBS稀释。鼠单克隆抗体anti-bIII-tubulin(σ),稀释1:1000年在PBS,和鼠标单克隆anti-glial纤丝的酸性蛋白抗体(GFAP、σ),稀释1:500年。与PBS冲洗5分钟后,盖玻片是孵化1 h在室温下与二级anti-mouse IgG抗体耦合AlexaFluor 488(分子探针/表达载体),稀释1:1000年的Dapi (1.0μg / mL,σ)和PBS冲洗3×5分钟,然后安装在玻片固定Fluorsave (Calbiochem)。

朝九晚十二的照片应用细胞,对应于34 - 69细胞,被为每个鼠标使用蔡司Axioskop 2 +显微镜(卡尔蔡司、Feldbach、瑞士)配备数字化,数字化Axiocam相机。

2.7。细胞生存能力分析

评估细胞的可行性SH-SY5Y细胞和DI过渡委员会120000细胞/是生长在1毫升rpmi - 1640为10% FCS 6 - 8天,前两天的实验中,媒介与1% FCS rpmi - 1640所取代。皮层组织,1毫克新鲜均质组织在1毫升resuspended相同的媒介。细胞治疗在30分钟5μM RA和/或20μ米一个β1-42单体或3.3μL洋地黄皂苷(CellTiter-Glo发光细胞生存能力分析,Promega)作为一个积极的控制降低细胞生存能力。100年μL细胞悬液的动摇与100 2分钟μL CellTiter-Glo试剂准备根据制造商(CellTiter-Glo发光细胞生存能力分析,Promega)诱导细胞溶解和释放细胞ATP含量、代谢活动的指标。10分钟后在室温下孵化,发光(相对光单位)是记录光度计(GloMax 20/20, Promega)。中没有细胞或组织样本导致背景发光。

2.8。Caspase-Glo

评估caspase-3 caspase-7激活,SH-SY5Y细胞生长在FCS 1毫升rpmi - 1640和10%。实验前两天,媒介与1% FCS rpmi - 1640所取代。细胞治疗或没有在30分钟或24小时20μ米一个β1-42,50μM z-VAD(在DMSO,默克)或100海里staurosporine (Sigma-Aldrich)。100年μL细胞悬液的混合与100 2分钟μL Caspase-Glo 3/7试剂准备根据制造商(Caspase-Glo 3/7化验,Promega)诱导的细胞裂解和裂解caspase-3 / caspase-7 luminogenic衬底。在室温下1 h30孵化后,发光是记录光度计(GloMax 20/20, Promega)。没有细胞的控制也被使用。

2.9。统计分析

彗星试验,意思是彗星尾巴长度的值为每个条件相比单向方差分析(方差分析)来建立各种治疗方法的影响。当整体在统计上有显著差异的治疗效果是通过方差分析,比较子组中意味着Bonferroni调整后了。并行,非参数克鲁斯卡尔-沃利斯检验是用来比较彗星尾巴的形状分布也与Bonferroni调整子组进行比较。克鲁斯卡尔-沃利斯分析时特别合适的措施的数量小(小于15每组)或当不是高斯分布(不对称箱线图)。水平的意义 。与占据13.1软件进行分析(美国TX Stat Corp ., 2013)。

3所示。结果

3.1。视黄酸维修β全身的双边带SH-SY5Y和DI过渡委员会1细胞

证明RA可以修复β全身的双边带,SH-SY5H细胞和星形DI过渡委员会1细胞治疗β1-42半个小时前RA的添加与否也30分钟。RA的存在导致短尾巴长度与未经处理的细胞溶解细胞(数字1(一)和1 (b))。彗星的尾巴长度均值显著更高β对待SH-SY5Y细胞以及DI过渡委员会1细胞相比,所有其他治疗(数字1 (c)和1 (d))。这些结果证实了由一个独立的实验显示在琼脂糖凝胶彗星尾巴从细胞核加载到凝胶的插槽。短的DNA fragments-between约0.85 kb和3.0 kb-were生成时更频繁β是现在和减少的数量在RA的存在(图1 (e))。凋亡的碎片 ×无法检测到180个基点,这表明细胞凋亡没有激活在这些30分钟的治疗方法。量化的信号强度的凝胶的槽显示双边带RA后添加时几乎减少了一半β(图1 (f))。

(一)
(一)
(b)
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(c)
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图1
RA修理一β全身的双边带SH-SY5Y和星形DI过渡委员会1细胞。(一)代表的照片彗星尾巴长度不同的SH-SY5Y细胞或(b) DI过渡委员会1细胞后30分钟RA (5μ米)和/或30分钟β(20μ米)的治疗方法。Ø=没有治疗30分钟;酒吧规模:200μm。(c)框块意味着彗星尾巴的长度SH-SY5Y细胞(细胞的数量来衡量: DI过渡委员会)和(d)1细胞( )。方差分析与Bonferroni调整: ;ns =不显著。(e)琼脂糖凝胶电泳显示约1×10的彗星的尾巴3每口井的细胞溶解SH-SY5Y细胞治疗RA (5μ米)和/或一个β(20μ米)。每个治疗进行了两次。使用1 kb梯(表达载体)。DNA (f)的图形表示的意思是光强度为每个重复治疗(e)。这表明RA减少的数量β全身的双边带和证实图(c)。1 kb的DNA强度测量约20 kb的DNA。
3.2。视黄酸维修β1-42全身的双边带通过RAR浓度的方式α/β在SH-SY5Y细胞

我们证明了双边带感应特别的一个β1-42肽而不是由非病理性β1-40形式或控制与逆向序列肽β42-1,所有治疗进行与20 30分钟μ米一个β肽(图2(一个))。与DI过渡委员会得到相似的结果1细胞。此外,剂量反应曲线(图2 (b))表明RA维修双边带最有效浓度之间的1μ米和50μ在5米,最大效率的峰值μ为0.5米,而没有影响μ或500μm .使用细胞可行性分析,我们发现治疗0.5μM RA(101.3±15.3%)和1μM RA(103.8±8.6)导致类似的生存能力比未经处理的细胞(100±10%)。然而,生存能力增加5点μM RA (135.8±30.8%), 10μM RA (152±12.7%), 50μM RA(126±30.2),但在500年下降μRA (27.1±2.1) ( )。

(一)
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(c)
(d)
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图2
控制实验的影响β和RA意味着SH-SY5Y细胞彗星尾巴的长度。(一)箱线图的意思是彗星尾巴的长度根据30分钟治疗用β 1-42和控制多肽β 42-1或者一个β 1-40(20μ米一个β;细胞的数量来衡量: )。(b)的箱线图的意思是彗星尾巴的长度取决于30分钟各种RA的治疗浓度( )。(c)的箱线图的意思是彗星尾巴长度根据与20 30分钟的治疗方法μ米一个β 1-42,5μM RA, 10μM RARα/β受体激动剂Am80,其溶剂DMSO (1% v / v)、展示类似的特定效果的RA和SH-SY5Y Am80的细胞( )。(d)的箱线图的意思是彗星尾巴长度根据RARα/β/γ193109(1-50拮抗剂AGNμAGN) 5的存在与否μ类风湿性关节炎( )。由于RA的减少意味着尾长度为废除AGN的存在。方差分析与Bonferroni调整: ;ns =不显著;Ø=没有治疗30分钟。

此外,我们证明了在RAR SH-SY5Y细胞α/β兴奋剂Am80使用的浓度为10μM RA(图相比有相同的影响2 (c))。同时显著降低β全身的双边带。此外,没有观察到显著差异Am80与RA SH-SY5Y细胞表明RARα/β受体是足以调解双边带修复活动,因此排除其他可能的受体的参与,如PPARβ/δ(42]。最后,添加1μM RARα/β/γ拮抗剂AGN 193109 - 5μM RA明显受损的双边带的减少由于RA治疗。这种影响甚至增加AGN(50的浓度更高μM比1μ米),清楚地表明绑定RA的RAR需要修复双边带(图2 (d))。

3.3。视黄酸维修β全身的双边带大脑皮层的年轻,年龄在C57BL / 6 j小鼠

RA添加后半个小时β1-42治疗也可以修复双边带细胞来自年轻的小鼠皮层( 岁)和C57BL / 6 j小鼠( )。RA的存在导致短尾巴长度与未经处理的细胞溶解细胞和细胞治疗RA(数据3(一个)和3 (b))。彗星的尾巴长度均值显著更高β皮层细胞治疗相比,所有其他条件年轻和年老的老鼠(数字3 (c)和3 (d))。然而,意味着彗星尾巴的长度之间的差异β治疗和其他条件是不太重要的年龄比较年轻的老鼠可能是由于降低了新陈代谢。事实上,之间的差别β和一个β+ RA治疗统计所有3中不同的年轻的老鼠,但老鼠只在2岁3。我们进一步展示了通过免疫细胞化学(图3 (e))细胞彗星试验分析了存在于神经元集中年龄段(68%)以及星形胶质细胞(26%)和神经元,星形胶质细胞的比例/(0.38)相似,在文献中报道(43)(图3 (f))。

(一)
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图3
RA修理一β全身的双边带C57BL / 6 j小鼠的大脑皮层。(一)代表的照片彗星尾巴长度不同的皮层细胞来自年轻(4个月; 老鼠)或(b)岁(16个月; )30分钟后小鼠RA (5μ米)和/或30分钟β(20μ米)在体外治疗方法。Ø=没有治疗30分钟;酒吧规模:200μm。(c)框块意味着彗星尾巴的长度3年轻(细胞的数量来衡量: )和(d) 3岁小鼠( )。统计分析与Bonferroni调整(方差分析)显示显著差异在所有3年轻老鼠( ),而只有2 3 ( 从3岁小鼠)或1 ( )达到统计学意义;ns =不显著。(e) Immunofluorescent皮层细胞的照片年轻老鼠沾反βIII-tubulin标记神经元,anti-GFAP标签星形胶质细胞,作为核DAPI标记。类似的研究战争与他的皮层细胞进行年龄老鼠。(f)比例的神经元、星形胶质细胞和其他细胞皮层的年轻( )和老年小鼠( )。为每个老鼠细胞的数量分析: 。 :比较神经元和星形胶质细胞。
3.4。组蛋白脱乙酰酶抑制剂Trichostatin和/或维甲酸诱导双边带修复通过dna - pk和ATM SH-SY5Y细胞

确定风湿性关节炎的作用方式通过其受体RAR, SH-SY5Y细胞治疗组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂trichostatin (TSA)。我们观察到,TSA下降意味着产生的尾长βRA(图一样有效4(一))。此外,双边带明显减少与TSA +细胞治疗RA与RA治疗的细胞相比,暗示可能协同作用的化学物质,他们的行为在不同的网站相同的受体复杂(37]。

(一)
(一)
(b)
(b)
图4
修复途径的β全身的双边带。(a)的箱线图的意思是彗星尾巴的长度SH-SY5Y细胞(细胞的数量来衡量: 与RA(5) 30分钟后治疗μ米),HDAC抑制剂TSA (3μ米),β(20μ米)展示HDAC的参与。(b)的意思是彗星尾巴的箱线图SH-SY5Y细胞的长度( 与RA(5) 30分钟后治疗μ米),β(20μ55933 M),骨(ATM抑制剂,10μ7026 M),ν(dna - pk的抑制剂,150μ米)的ATM和dna - pk。方差分析与Bonferroni调整: ;ns =不显著;Ø=没有治疗30分钟。

此外,抑制RA的修复活动被证明是介导通过使用自动取款机ATM抑制剂KU 55933年和7026年通过dna - pk使用dna - pk抑制剂ν(图4 (b))。自动取款机抑制剂诱导尽可能多的双边带dna - pk的抑制剂或β治疗。在RA,抑制两种途径,但不是唯一,产生类似的双边带的数量β治疗。因此,ATM和dna - pk的蛋白激酶需要礼物,所以RA能够修复双边带SH-SY5Y细胞。

3.5。的影响β细胞凋亡和RA对细胞的生存能力

SH-SY5Y细胞治疗β和/或z-VAD caspase-3抑制剂。Staurosporine作为积极控制凋亡细胞死亡。只有最后一个化合物导致细胞死亡后24 h,但不是30分钟治疗后(图5(一个))。然而,在这些细胞,caspase-3 30分钟后已经活跃了z-VAD治疗(图5 (b))。Staurosporine激活caspase-3和caspase-7后24 h后30分钟甚至更比未经处理的细胞。但是,还没有达到统计学意义比较控制治疗staurosporine治疗,即使意义倾向增加24小时( )相比,30分钟( )。30分钟后,还存在已经激活细胞死亡却没有观察到,而24 h后细胞死亡,还不能进一步激活。一颗彗星试验在相同条件下(图进行5 (c))透露,意思是彗星尾长不是z-VAD减弱的存在β30分钟后相比β治疗。在这种情况下,双边带并不是由于caspase-3激活。24小时后,意味着彗星尾长被z-VAD在存在显著降低β表明由于激活caspase-3双边带的生产。总的来说,一个β全身的双边带proapoptotic出现不相关事件后30分钟的治疗。

(一)
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图5
一个β对凋亡级联的影响,双边带、以及细胞生存能力的caspase-3抑制剂z-VAD或RA。(a)的照片相衬显微镜SH-SY5Y细胞治疗20μ米一个β和/或50μM z-VAD没有显示细胞死亡,而治疗100海里staurosporine导致凋亡细胞死亡24 h后,不经过30分钟。比例尺= 200μm。(b)措施caspase-3 / caspase-7 (CaspaseGlo试验)后30分钟和24小时的治疗β和/或z-VAD或staurosporine (STA)。还被激活在控制细胞培养(Ø=没有治疗)和存在β经过30分钟和24小时但未能诱导细胞死亡。还存在的无意义的增加30分钟和24小时之间导致细胞死亡(A)。(c)的箱线图意味着彗星尾巴长度治疗后β和/或z-VAD显示β全身的双边带在SH-SY5Y并不与凋亡相关的双边带30分钟后,而他们与凋亡相关的双边带在24小时(细胞的数量测量: )。(d)措施的可行性(Glomax试验)的病患DI过渡委员会1细胞治疗与RA 30分钟(5μ米)和/或一个β(20μ米)或洋地黄皂苷(3.3毫米)( )。与SH-SY5Y细胞观察到相似的结果,也就是说,没有生存能力尽管RA和/或变更β治疗方法。(e)措施的可行性(Glomax试验)的细胞皮质组织的年轻(深灰色;4个月; )和老年小鼠(浅灰色;16个月; 治疗风湿性关节炎和/或后)β在30分钟或洋地黄皂苷。生存能力不显著降低风湿性关节炎的存在。方差分析与Bonferroni调整: ;ns =不显著;Ø=没有治疗30分钟。

此外,细胞生存能力的量化测量细胞内ATP相比,洋地黄皂苷细胞细胞溶解。30分钟后β治疗RA的存在与否,DI过渡委员会1细胞生存能力下降和增加,而它的后续洋地黄皂苷治疗(图5 (d))。一个相同的观察是为SH-SY5H细胞(没有显示)。细胞4-month-young皮层组织显示1 h后生存能力远高于细胞组织(图16个月5 (e)),这意味着更高的后者组织的脆弱性在体外条件。30分钟后整体生存能力下降β治疗由于年轻的组织(细胞内ATP下降 )。然而,这种减少是RA添加时不那么重要β年轻的和老皮质组织( )。我们观察到约53%的生存能力的增加约59%的青年组织和旧的组织,这表明在实验条件下RA增强生存能力在双边带正在修理。

4所示。讨论

我们主要观察RA是参与β全身的双边带修复神经元和星形细胞系以及皮层组织,可能在大脑皮层神经元和星形胶质细胞,甚至在年轻和年长老鼠。真正的RA后双边带生产的β1-42治疗可以修复双边带。这是由两个独立的显示方法:彗星试验和凝胶电泳SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞。因此,根据这些数据,风湿性关节炎及其受体(RAR)不仅涉及的预防β合成,βoligomerisation,除斑,已经显示(29日,32- - - - - -34,36),但也在β全身的双边带修复。

4.1。一个β1-42引发双边带与病理的潜力

我们选择成长SH-SY5Y DI过渡委员会1细胞在FCS 1%而不是10% FCS的存在。在这两种情况下,一个β前条件诱导更多的双边带,但细胞更分化的皮层组织。谷酰胺也增加了,因为它已经知道防止双边带的形成(16),只有RA的效果进行测试。谷酰胺也同样增加了均质皮质组织但B27补充被避免,因为它包含了类风湿性关节炎。有趣的是观察,只有最病态的形式β,一个β1-42在两个SH-SY5Y诱导双边带和DI过渡委员会1细胞,这表明一个β1-42全身的双边带可能在阿兹海默症病理中发挥作用。还值得注意的是这一事实β1-42治疗似乎效率较低导致双边带在老年人比年轻小鼠皮层组织。这不能由于的状态β对应于单体和低聚物的混合物在这两种情况下(44而是组织的状态,如较低的老年人新陈代谢皮层组织。

4.2。RA抵消影响双边带生产

RA可以减少双边带在SH-SY5Y细胞浓度的方式。5μM RA似乎适合减少双边带和增加细胞生存能力,也就是说,ATP浓度,而未经处理的细胞。导致更高或更低RA浓度不变双边带水平相比,控制细胞,而增加RA浓度只有减少细胞的可行性。RA的变化效果根据它的浓度是兼容的观察神经元活动时低,内生RA合成是本地激活为了维持神经元的结构(稳态突触可塑性),相反RA合成减少神经元活动增加时(20.]。必须注意到,RA治疗后的双边带水平并不始终低于背景双边带未经处理的样品的水平。这种现象可能是由于内源性RA水平的变化与细胞分化或部门。此外,类风湿性关节炎是减少一个β全身的双边带RARα/β受体通过Am80受体激动剂和拮抗剂AGN 193109。RA的受体激动剂作为有效减少双边带、RA通过另一个受体的影响,例如,RXR-PPARβ/δ(42),排除SH-SY5Y细胞出现。HDAC抑制剂TSA的观察,使脱抑制视黄酸反应Element-dependent基因表达,导致类似的减少β全身是说彗星尾长RA加强RAR的修复的作用β全身的双边带。补偿可能发生通过双边带修复相关基因的表达或直接通过染色质decondensation RA-dependent基因表达允许访问的网站蛋白质参与双边带修复。其中一个蛋白质的dna - pk NHEJ修复途径。然而,其抑制剂ν7026年,用于150年的浓度μ米,只有部分的修复β全身的双边带相比,RA的治疗。ν是排除在外的浓度效应的剂量反应曲线表明,意思是彗星尾巴长度达到一个最大尺寸在150年到250年μ在50到100 Mν,显著降低μν(数据未显示)。ATM抑制剂,KU 55933,导致同样的部分修复β全身的双边带。我们在SH-SY5Y显示细胞的dna - pk和ATM,已知补充(45,46),使完整的抵消RA对双边带生产的影响。

4.3。自适应细胞反应由于RA-Mediated双边带修复:DSB-PRAE假说

我们观察到,短期(而不是长期)治疗β不是减少细胞生存能力或导致细胞死亡和caspase-3被激活在同一水平的β或与1% FCS SH-SY5Y成长。事实上,即使staurosporine被诱导神经突结果在短期内诱导细胞死亡和凋亡之前长期的DNA片段(47]。我们也没有观察到凋亡的碎片 30分钟后×180个基点β治疗,表明细胞凋亡在这些条件下尚未激活。然而,在那个时候,双边带是由一个感应β在长期内,如果没有修复,他们可能是有害的48]。此外,短时间内,RA可以修复双边带甚至出现皮质增加生存能力的年轻,在较小程度上的老老鼠。RA是修复双边带Am80和trichostatin和他们改变记忆49,50RA)显示一个类似的角色。而我们的假设β生产双边带、风湿性关节炎导致目标子集的容易出错的修复DNA RA-dependent基因表达的地区,特别是参与神经元或突触维护(23]。选择性的DNA修复的过程可能导致神经状态适应代谢变化发生在衰老。这种现象的“双边带生产和repair-dependent适应性基因表达”(DSB-PRAE假说)仍将病理阈值达到的功能β增加和RA与衰老和减少响应可能解释了双边带在记忆的作用7]。

总之,我们发现RA维修β全身的双边带在大脑皮层的神经细胞。我们的数据是赞成增加神经可行性和RA的角色也可能提供神经适应性反应。然而,这应该是证明特别是广告小鼠模型。此外,我们的数据表明,一个更好的知识的机制β全身的双边带目标病理可能提供额外的手段β全身的变化,不仅损害了β淀粉样蛋白级联,但修复它的一些后果。

利益冲突

作者声明没有实际或潜在的利益冲突。

作者的贡献

Emmanuelle Gruz-Gibelli, Natacha干酪桶,Clelia Allioux,马林,和弗朗索瓦丝Piotton进行了实验;吉纳维芙Leuba导致了项目的设计和论文的写作;统计数据是由弗朗索瓦·r·赫曼;阿尔芒Savioz领导的工作。

承认

财务和物质支持机构。