同步辐射X射线相衬层析成像可视化微血管变化在小鼠的脑缺血损伤后

抽象的

脑微血管造影在脑血管疾病的可塑性研究中具有重要意义。使用传统的造影剂μ.CT和μ.MRI方法对血管进行成像对比。本研究的目的是建立一种同步辐射x线相位对比断层成像(SRXPCT)方法，以高分辨率(~3.7)成像完整的小鼠大脑(微)血管μ.M)没有造影剂。提出了一种利用气-组织界面密度差增强脑血管相位对比度的制备方案。开发并优化了CT成像系统，获得成年雄性C57BL/6小鼠的三维脑血管图。进一步应用SRXPCT方法研究小鼠大脑微血管的变化(经短暂性大脑中动脉闭塞(tMCAO)再灌注14天。脑微血管三维重建显示，小血管(半径< 7.4)的分支半径比(损伤后与损伤前)μ.M)损伤组明显小于假手术组(）.这一结果揭示了脑卒中后恢复过程中活跃的血管生成。SRXPCT作为一种高分辨率、无造影剂的方法，在脑血管疾病的功能可塑性研究中具有较高的潜力。

1.简介

鼠类模型已广泛应用于脑血管疾病的可塑性研究，如动静脉畸形、缺血性或出血性卒中、血管痉挛等。获得完整的脑血管系统是进一步了解脑血管疾病的前提。传统x射线血管造影、磁共振血管造影(MRA)和正电子发射断层成像(PET)可以提供人类和动物的血管信息，但空间分辨率有限[1- - - - - -7]．光学成像方法(共聚焦或双光子显微镜)提供了足够的空间分辨率，但对大脑深部应用的穿透深度有限[8，9]．血管腐蚀铸造法可以更详细地检查血管形态，包括部分但不是全部的大脑微血管[10，11]．最近,μ.CT (12),μ.核磁共振成像(13]，以获得高分辨率(~30μ.M)小动物的脑血管体外使用造影剂。以上方法都需要使用造影剂来增强血管造影，在造影剂灌注不足的情况下，可能导致重建不良。此外，造影剂不能用于有出血症状的脑。因此脑血管疾病的研究需要一种具有足够穿透深度和成像分辨率的无造影剂血管成像方法。

在x射线成像中，除了吸收对比度外，相位对比度[14，15]也被用于生物组织成像[16]．通常，X射线PCI提供相移比吸收的较高〜1000倍的横截面。例如，在在活的有机体内在x射线相衬成像(PCI)中，空气-组织界面提供足够的相衬[17，18]．此外，气体-组织界面也比血液-组织界面提供更好的相位对比度，因此被用于肾脏解剖成像[19,耳朵20.，大脑[21]．以往的研究表明，气体的种类并不影响图像的对比度[22];因此,这两个公司₂可以使用煤气和空气。在脑微血管的形态学研究中，气体组织界面也可用于高分辨率无标记成像。但需要建立足够的脑组织标本制备方法，以保持脑组织完整血管的原始形态，同时创造稳定的气-组织界面。

传统x射线PCI采用干涉法和晶体分析仪获取相位信息[23]．在没有干涉测量的情况下，内联x射线PCI法也可以检索相位信息，并被用于各种研究[24- - - - - -26]．同步辐射具有强度高、相干性好、散度小等优点，是x射线PCI的理想光源。它可以大大提高脑血管成像的分辨率和灵敏度。先前的研究已经显示同步辐射对脑部血管的成像潜力[27- - - - - -29]．在这里，在这项研究中，我们聚焦在相位对比度和高分辨率，其改善同步辐射成像的小鼠脑血管系统的能力。我们开发了一个内联同步辐射X射线相衬层析成像（SRXPCT）方法在体外高分辨率脑血管成像。在上海同步辐射装置（SSRF）的BL13W1束线上构建并优化了SRXPCT成像装置。提出了一种特殊的样品制备方案，以维持完整的脑血管系统，并利用空气-组织界面实现血管系统的高相位对比度。最后，应用所提出的SRXPCT方法研究了短暂性大脑中动脉闭塞（tMCAO）模型缺血损伤后小鼠脑内微血管的变化。

2.材料和方法

２.１.SRXPCT的成像设置

成像设置(图1)在SSRF的BL13W1波束上构建。输出x射线的能量范围为8kev ~ 72.5 KeV，束宽为10 mm × 10 mm(水平×垂直)，发散度为1.5 mrad × 0.2 mrad(水平×垂直)。SRXPCT的设置包括16kev单色仪、样品台和高分辨率CCD记录系统。采用硅双晶体单色仪(DCM)获得平行16kev x射线束。光源到标本台的距离固定为34米。成像实验前，对样品到探测器的距离进行了优化(图)2）.A microscope with 1 : 2 lens coupled to a 100 μ.m Yag:Ce闪烁体用于成像系统。CCD相机(pco.)2000, PCO AG, Kelheim, Germany)，像素大小为7.4μ.米×7.4μ.M用来记录原始相位图像(2048 × 2048像素)。记录图像的整体有效像素大小为3.7μ.米×3.7 μ.m.高分辨率成像曝光时间为200 ms。暗场图像平场图像样本成像之前被收集并在预处理（平场和暗场校正）用于获得校正的相位图像（1）.在校正的相位图像中，脑组织血管增强(图2(一个)，2 (b)，2 (c)，3(一个),3 (b)）.因此,

相位检索图像(图3 (c))可以由校正后的相位图像计算出来使用Paganin等人的方法[30.，31]．虽然相位检索图像呈现正常的脑解剖，但血管造影效果有限，尤其是对微血管的检查。因此，在本研究中，我们提出使用校正后的相位图像而不是相位检索图像，以获得CT重建的大脑血管。

2．2.优化SRXPCT

为了优化血管成像性能，对不同的样品-探测器距离(10 cm~110 cm)进行了测试和比较。可见性参数不同区域（矩形图表示2(一个)- - - - - -2 (c))，计算不同采样到检测器距离的校正相位图像(2）.在图2 (d)，在10 ~ 80 cm范围内，30 cm处脉管结构清晰可见，距离越远越清晰。但从60 cm到80 cm的成像质量无明显改善。因此，样品与检测器的最佳距离为60 cm~80 cm。因此, 在哪里能见度参数是和吗和是在校正相位图像所选择的区域中的最大和最小值。

2．3.CT重建

CT重建时，样本阶段旋转180°，间隔0.12°，共获得1500个投影，像素大小为2048 × 2048，动态范围为16位。用琼脂糖凝胶将大脑样本嵌入Eppendorf管中。然后将试管直接固定在样品台上，使其在旋转中保持固定。断层扫描总曝光时间为5分钟(每次投影曝光时间为200 ms)，辐射剂量约为2 Gy。采用改进的滤波反投影重建算法，基于校正后的相位图像直接重建脑样本CT切片[32交互式数据语言(idl7.0)编写。然后基于基于脊的三维扩展方法对脑血管进行分割[33[Matlab 7.10.0 (MathWorks, Inc.， Miami, FL)。在重建的三维CT数据中，基于局部强度最大值检测脊线。脉管系统建模为非对称高斯函数，其参数构成脊描述子。然后，利用这些局部信息对脊线进行聚类，最终确定阈值并进行脑血管分割。采用ImageJ软件(NIH, USA)对整个或部分脑血管进行三维体绘制。

２.４.tMCAO动物模型

成年雄性C57BL/6小鼠()，体重25~30克，随机分为假手术组()及脑损伤组(）.在这项研究中所用的实验方案经上海交通大学的机构动物护理和使用委员会。瞬态大脑中动脉闭塞（tMCAO）进行基于我们以往的研究[34]．In the surgery, mice were anesthetized with ketamine/xylazine (100 mg/10 mg/kg, Sigma) intraperitoneally. Body temperature was maintained at(RWD Life Science，深圳，中国)。分离左颈总动脉(CCA)和颈外、颈内动脉(ECA和ICA)后，从ECA残端轻轻插入硅酮涂层6-0缝线(Covidien, Mansfield, MA)至ICA，并在大脑中动脉(MCA)开口处停止。ICA/ECA分叉到MCA的距离约为 mm. Successful occlusion was confirmed by Laser Doppler Flowmetry (Moor Instruments, Devon, UK). Reperfusion started 90 min after MCAO with suture withdrawal. Mice in the sham group underwent the same procedure except for inserting the suture into the ICA. After 14 days of reperfusion [35]，所有小鼠脑脉管系统的SRXPCT成像制备。

2．5．脑标本制备

再灌注后第14天，再次使用氯胺酮/甲苯噻嗪（100%）麻醉小鼠 mg/10 mg/kg，Sigma）。在麻醉下，开胸手术，将钝针轻轻插入心脏跳动的左心室。然后将针与三通阀连接，三通阀进一步与生理盐水容器和4%多聚甲醛（PFA）容器连接。0.9%生理盐水（37°C）在100℃时由跳动的心脏在脉管系统中灌注 mmHg，直到右心房流出液无色。在生理盐水灌注结束时，将阀门切换至4%PFA缓冲液以固定脑血管壁。然后，处死动物，取出脑样本并在4°C下固定在PFA缓冲液中过夜。然后用100%乙醇将固定的脑脱水2小时4小时以保持样本形态正常。最后，通过24小时干燥程序，乙醇蒸发并空气占据完整的脑血管。样本制备后，所有脑样本均通过我们的SRXPCT系统成像，并重建高分辨率3D血管。

3.结果

３．１．成像性能

数字3(一个)显示了由SRXPCT获得的整个正常小鼠大脑的校正相位图像。不同的大脑结构包括大脑皮层、脑室、基底神经节、丘脑和小脑。脑部血管造影足够高，可以进行血管提取。数据3 (b)和3 (c)显示放大后的相位对比度图像(图3 (b))及其相位检索图像(图3 (c))(图中红色矩形3(一个)(图中红色箭头所示)3 (b)和3 (c))的分支可以很容易地识别。可分辨血管的最小直径约为7.4μ.m。

３.２．CT重建

经过CT重建和血管分割，得到整个小鼠大脑的三维血管结构。数据4(一)- - - - - -4(左)给出了不同视点(图像之间15°旋转)的血管体绘制。血管的全貌对于大血管的显示是有用的。在微血管的研究中，感兴趣的大脑区域的三维视图更适合分析(图5和补充视频)。

作为一种无损的方法，SRXPCT可以提供具有详细血管网络的脑解剖三维切片(图)6）.对于脑血管疾病的研究，3D切片比传统方法如H&E染色的组织学切片具有更好的可视化效果(图)6）.

3．3.小鼠脑缺血损伤后微血管的变化

本研究采用SRXPCT方法，研究tMCAO模型缺血性损伤后小鼠脑微血管的变化。损伤组MCA闭塞90 min后再灌注14 d。术后第14天，损伤组和假手术组大鼠脑均制备SRXPCT。

在三维血管分割的基础上，采集血管直径和分支点。再灌注14天后，小鼠大脑从缺血损伤中恢复，血管生成和微血管改变[35]．为了研究这种脉管系统的变化，我们确定了分节脉管系统中的每个分支点，并计算了分支前和分支后的血管半径。因为对于一个分支点，分支后血管可能有不同的血管半径，所以我们使用平均半径作为分支后半径。因为我们对微血管的变化感兴趣，只有小的分支血管(分支前半径< 20μ.M)，在下一步进行总结和分析。我们定义了一个参数，半径比(定义为分支后血管半径与分支前血管半径之比)，定量分析微血管的变化。

数字7显示了半径比在对侧(a)和同侧(b)大脑进行tMCAO模型再灌注14天后。在未受损伤的对侧大脑中，差异无统计学意义假手术组和损伤组之间的差异(图7(一)).然而，对于损伤组的同侧大脑（损伤侧），桡骨比率血管半径< 7.4μ.米较假手术组显著较小（图7 (b)）.同时，有更大的分支血管(半径> 7.4μ.m)显示两组间差异无统计学意义(图7 (b)）.因为活性的血管生成在从行程导致微血管重建的恢复〔35，新生小分支血管可减小桡骨比这与我们的统计结果一致。三维渲染进一步证实梗死周围区域是桡骨比降低的主要部位对应于血管生成，这也是与以前的研究是一致的[36]．

4.讨论

在本研究中，我们建立了SRXPCT方法在体外完整啮齿类动物大脑(微)血管的高分辨率3D成像。利用脑标本的特殊制备方法，在完整的脑血管系统中获得了气-组织界面密度差的相位对比。应用这种新方法，在脑血管疾病的研究中，不需要使用x线造影剂来获得微血管的变化。

x射线相位反差成像方法通过x射线穿过非均匀折射率界面时的相位变化获得高成像反差。研究表明，肺非常适合x射线相衬成像的特征，因为它在呼气末由大约80%的空气组成，由薄的组织结构分隔[17，18]．脑血管没有空气-组织界面在活的有机体内．另一项研究表明，相位对比可用于在解剖结构的成像在体外未经固定的样本(生物新鲜样本)[37]．这种策略在脑血管成像方面也失败了。x射线波阵面在血流(血管腔内)与周围组织的各界面处折射。血管造影增强困难在活的有机体内状态或在体外没有固定状态。同时，气-组织界面在脑血管系统中的潜在应用也得到了应用在体外成像策略。然而，适当的脑标本灌注、固定和脱水技术对于维持脑血管的完整性和原始形态以及实现气-组织界面的相位对比至关重要。

关于SRXPCT的分辨率，成像像素分辨率为3.7μ.米×3.7 μ.M，允许识别10岁以下的大脑微血管μ.m。在我们的研究中，不同程度的血管进行了很好可视化。虽然与单/二像素宽度的半径的容器可在目前的研究被检测到，更高分辨率成像系统被强烈建议，并且可以提供甚至微血管毛细管网络的更多细节。更好地了解大脑血管结构及血管改变的将是脑部疾病的研究[有益10]．相比μ.CT方法，SRXPCT不需要使用造影剂。此外，SRXPCT还可以提供脑室和细胞核的形态信息。

目前的SRXPCT方法也有一定的局限性。铸造方法可作为本研究未采用的成像质量优化的金标准。虽然PCI图像的分辨率足以观察直径小于10的血管μ.但是，获得详细的血管生成过程，如血管萌芽，仍然具有挑战性。此外，还需要进行额外的实验，以获得卒中后微血管变化的连续观察。在现阶段，SRXPCT只能用于专门制备的小鼠脑样本。对于大样本，如大鼠脑，目前的SRXPCT技术也可以工作，但需要更大的FOV摄像机和更长的样品固定和脱水准备时间。这是一个巨大的挑战在活的有机体内SRXPCT，因为没有电流相位对比机制可以在在活的有机体内应用程序。

竞争利益

作者声明本论文的发表不存在利益冲突。

致谢

本研究由国家自然科学基金项目(61571284)资助。彭淼还获得了上海市教委、上海市教育发展基金会“陈光项目”的资助。作者还感谢杜国浩博士、谢宏兰博士和任玉琦博士的技术支持。

补充材料

工具书类

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