厌食症降低大鼠海马GFAP+细胞密度

摘要

神经性厌食症是一种主要在年轻女性中观察到的进食障碍。该障碍的神经生物学尚不清楚，但最近磁共振成像显示厌食症患者的海马体积减少。脱水性厌食症（DIA）是一种模拟该疾病核心特征的小鼠模型，包括因自愿减少食物摄入而导致的严重体重减轻。大脑的能量供应由星形胶质细胞介导，但其密度是否因厌食而受损尚不清楚。因此，本研究的目的是估计hDIA模型中的海马（CA1、CA2、CA3和齿状回）。我们的结果表明，除CA1外，海马所有区域的GFAP+细胞密度均显著降低（~20%）。有趣的是，DIA显著降低了CA2中的GFAP+细胞/细胞核比率(−23%）和齿状回(−48%)。GFAP+细胞密度的降低与GFAP蛋白的低表达一致。此外，厌食症增加了中间丝波形蛋白和巢蛋白的表达。因此，厌食症使CA2和齿状回中反应性星形胶质细胞的数量增加了两倍以上。我们得出结论，厌食症降低了hippocampal GFAP+细胞密度增加，波形蛋白和巢蛋白表达增加。

1.介绍

神经性厌食症是一种饮食失调，其特征是过度限制热量摄入，导致严重的体重减轻、骨质疏松和闭经[1]．神经性厌食症通常发生在青春期和青春期，90-95%的病例发生在女性[2]．

由于其复杂性，神经性厌食症的神经生物学尚不清楚，但磁共振成像研究显示海马体积减少[3.- - - - - -6]．海马体参与空间学习、认知和焦虑调节[7]．在厌食症患者和实验模型中已经报道了这些认知功能的改变。小鼠厌食症模型，如脱水诱导的厌食症(DIA)或基于活动的厌食症(ABA)，模拟在厌食症患者中观察到的典型体重减轻和食物摄入量减少[1，2，8- - - - - -13]．厌食症患者海马体积较小可能反映了细胞水平上的结构变化。在ABA模型中，海马的变化包括齿状回细胞增殖减少和CA1放射状层树突分支减少[1，11，12]．过度的体育活动会改变食物的摄入，从而导致营养和电解质的不平衡。因此，海马功能和结构的改变可能是减少热量摄入的结果，这损害了大脑的能量供应。星形胶质细胞是中枢神经系统的主要细胞群之一，在为神经元提供能量方面发挥着关键作用;因此，我们检测了海马星形胶质细胞密度和中间丝表达是否受到厌食的影响。

2.材料和方法

２.１.动物和住房

UNAM de Neurobiología研究所的动物护理和实验室动物使用委员会批准了所有的实验协议。根据《国家实验室动物护理和使用健康指南》处理动物。Wistar雌性大鼠(160 ~ 190 g)单独饲养，光照周期为12小时/12小时，温度可控，有食物和水随意．

２.２.Dehydration-Induced厌食症

协议按照前面描述的方式执行[8，13，14]．简单地说，两个独立的实验系列，12只动物被放置在单独的笼子里;对于每个系列，动物被随机挑选成3组，每组4只。第一组得到水和食物随意(控制)。DIA组接受2.5% NaCl溶液作为他们唯一的饮用液体，并且不受限制地获取食物。强迫食物限制组(FFR)是一个阳性对照，以区分饥饿和脱水效应，接受自来水随意DIA动物摄入的食物量相同。实验方案进行了五天，每个实验组每天中午记录体重和固体食物摄入量。FFR组摄入的食物量与DIA动物摄入的食物量相同（见补充图）可在网上找到补充资料http://dx.doi.org/10.1155/2016/2426413）.

2．3.组织学

用过量的戊巴比妥钠(100 mg/Kg)深度麻醉大鼠，经心脏灌注100 mL生理盐水，然后250 mL 4%冷冻多聚甲醛磷酸盐缓冲盐水(pH 7.4)。大脑被移除，放置一夜，然后转移到一系列的蔗糖溶液中(10%到30%)。冠状部分(30μm)包括背海马在冷冻切片机上获得，收集，并在−20℃下保存在冷冻保护剂溶液(30%乙二醇/20%甘油PBS)中[13]．

２.４.Immunohistofluorescence

在漂浮切片上进行胶质纤维酸性蛋白(GFAP)免疫反应[13]．简单地说，冠状切片在PBS缓冲液中冲洗3次，用3%的过氧化氢处理10分钟，然后在PBS中冲洗3次，在1.0%硼氢化钠中孵育6-8分钟以减少游离醛。切片在封闭液(5%马血清白蛋白/1% Triton X-100 PBS)中孵育1小时。切片用兔抗gfap多克隆抗体(稀释1:1000,DakoCytomation, Fort Collins, CO, USA;4°C)。洗涤后用Alexa 594 (1:50 0, Invitrogen)偶联山羊抗兔二抗检测一抗。切片用4 '，6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)进行反染色，并用Vectashield H-1000 (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA)进行固定。

使用数码相机(Photometrics Cool Snap FX，美国)和尼康显微镜(Nikon Eclipse E600，东京，日本)拍摄包含海马的冠状切片，并使用IMAGE J version 1.41 (NIH, Bethesda MD，美国)进行分析。使用Zeiss LSM 780元共聚焦显微镜(Zeiss, Göttingen, Germany)拍摄Alexa 594(激发/发射波长590/617 nm)和DAPI(激发/发射波长350/460 nm)共聚焦图像(图1）.

2．5．细胞计数

对GFAP免疫标记的细胞进行计数，并与海马每个亚区（CA1、CA2、CA3和齿状回（DG））的DAPI标记的细胞核数量进行对比。从每组6–8只动物中选择的三个组织切片中的每个切片中总共有2-3个放射区用于细胞计数和分析n:指每个实验组所有动物的所有组织切片所使用的总射光场。100 × 100的测试方格μ米(0.01毫米²)用来估算与星形胶质细胞相对应的dapi染色细胞核(相当于细胞总数)和gfap标记细胞的数量，手动和使用Cell Profiler [13，15]．只有在分析区域的平面上显示其躯体的突起细胞被计数，并估计其密度(每毫米数)²).在每个分析的海马亚区内随机选择6到8个区域，通过测试方格网的渐进位移进行计数。星形胶质细胞/细胞核比率通过将GFAP+细胞数除以用DAPI标记的细胞核总数来计算。GFAP+细胞被鉴定为静息型（具有长、薄、分枝的小突起）或反应型（突起回缩至比躯体直径短的长度）[16]．计算所有实验组反应性星形胶质细胞的数量，并与对照组归一化。

将每个治疗和区域对应的所有数据汇总，并以平均值的平均值±标准误差（SEM）表示。使用单向方差分析，然后使用Origin 7.0软件进行Bonferroni后测，对数据进行统计分析。被认为具有统计学意义。

2.6。免疫印迹

海马体如前所述被解剖[17]．每个实验组(对照组、DIA和FFR)的3只大鼠的海马均用蛋白酶抑制剂(Sigma-Aldrich，美国)在冰冷裂解缓冲液(200 mM甘氨酸、150 mM NaCl、50 mM EGTA、50 mM EDTA和300 mM蔗糖)中均质。匀浆在10,000 ×g 4℃下离心15分钟，取上清液，−80℃保存。用Bradford 's方法估算每个蛋白样品的浓度[18]．等量的蛋白质(30μg)经10%聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)测定。蛋白质通过电泳转移到PVDF膜上;然后用5%脱脂奶粉在TBS-T中封闭膜，室温下封闭3 h。(a)兔抗gfap多克隆抗体(稀释倍数:2000,DakoCytomation, Fort Collins, CO, USA);(b)兔抗波形蛋白(稀释1:2500,Cell Signaling, Danvers, MA, USA);(c)小鼠抗巢蛋白单克隆抗体(稀释倍数:5000,BD Biosciences, San José， CA, USA);和(d)多克隆山羊抗肌动蛋白(稀释1:2500,Santacruz, Dallas, TX, USA)。冲洗膜，用山羊抗兔碱性磷酸酶偶联抗体(稀释1:2500;Santacruz、达拉斯、TX);山羊抗小鼠碱性磷酸酶偶联抗体(稀释1:2500; Santacruz, Dallas, TX); or rabbit anti-goat alkaline phosphatase conjugated antibody (dilution 1 : 2500; Santacruz, Dallas, TX). Then the membrane was washed with TBS-T and the alkaline phosphatase activity was detected with BCIP/NBT AP-conjugate substrate reaction Kit (Bio-Rad, USA). The intensity of each band was measured using Image Lab 3.0 software.

3.结果

在以下海马区域:CA1, CA2, CA3和齿状回(DG)，估算DIA和FFR对核和星形胶质细胞密度的影响(图)1）.所有的观察包括放射状层和放射状层，星形胶质细胞优先位于放射状层和放射状层，而DG则在门区进行观察(图)1）.

３．１．厌食对CA1 GFAP+细胞密度无影响

海马CA1区核密度在对照组(核/毫米²；)、印度(核/毫米²；)，和FFR组(核/毫米²；） ()(图1和表1)此外，对照组与对照组之间星形胶质细胞密度没有明显变化(核/毫米²；)、印度(核/毫米²；)，和FFR组(核/毫米²；） ()(图2和表1）.我们还通过估算总核中GFAP+细胞来确定星形胶质细胞/核的比例。对照组星形胶质细胞/细胞核比值为（)，而DIA组和FFR组差异无统计学意义(；和；；)(图2和表1）.

３.２．厌食症降低了钙离子中GFAP+细胞密度

对照组的CA2核密度相似(核/毫米²；)、印度(核/毫米²；)，和FFR组(核/毫米²；） ()(图3.；表格1）.对照组的星形胶质细胞密度(星形胶质细胞/毫米²；)的直径显著降低(星形胶质细胞/毫米²；)及FFR组别(星形胶质细胞/毫米²；） ()(图3.；表格1）.相应地，对照组的星形胶质细胞/细胞核比率(；)的DIA也显著降低(；)及FFR组别(；） ()(图3.；表格1）.

３．３．厌食症降低CA3中GFAP+细胞密度

CA3的核密度在对照(核/毫米²；)、印度(核/毫米²；)，和FFR组(核/毫米²；） ()(图4；表格1）.而对照组的星形细胞密度(星形胶质细胞/毫米²；)的直径显著降低(星形胶质细胞/毫米²；)及FFR组别(星形胶质细胞/毫米²；） ()(图4；表格1).然而，对照组的星形胶质细胞/细胞核比率(；)的脑直径没有明显降低(；)及FFR组别(；） ()(图4；表格1）.

3．4．厌食症降低DG中GFAP+细胞密度

在对照组中，齿状回的核密度没有显著差异(核/毫米²；)、印度(核/毫米²；)，和FFR组(核/毫米²；） ()(图5；表格1）.对照组星形细胞密度(星形胶质细胞/毫米²；)的直径显著降低(星形胶质细胞/毫米²；)及FFR组别(星形胶质细胞/毫米²；） ()(图5；表格1）.相应地，对照组的星形胶质细胞/细胞核比率(；)的直径显著降低(；)及FFR组别(；） ()(图5；表格1）.

3.4.1。中间丝表达受厌食症影响

Western blot检测对照组、DIA和FFR实验组星形胶质细胞中间丝的表达(图)6）.DIA显著降低GFAP的表达(；；)及FFR (；；)与归一化控制相比;DIA组与FFR组间无显著差异()(数据6(一)和6 (b))波形蛋白和巢蛋白的表达观察到相反的效果。波形蛋白的表达显著增加(；；)及FFR (；；)，与归一化控制相比;DIA组与FFR组间无显著差异()(数据6(一)和6 (b)）.最后，通过DIA显著增加nestin的表达(；；)及FFR (；；)与归一化控制相比;DIA组与FFR组间无显著差异()(数据6(一)和6 (b)）.

3.4.2。第3天后，厌食症降低GFAP的表达

我们的结果显示，海马中GFAP+细胞密度的降低与该蛋白的低表达相关。然而，GFAP的表达可能在5天前就受到影响。因此，在对照组、DIA或FFR实验组1、3 d后，用Western blot检测GFAP的表达(图)7(一)和7 (b)）.结果显示，在第一天的DIA治疗后GFAP的表达未受影响()及FFR ()，与规范化控制(）.然而，GFAP表达在DIA治疗第3天后显著降低()及FFR ()，与规范化控制()(数据7(一)和7 (b)）.

3．5．厌食症增加反应性星形胶质细胞

反应性星形胶质细胞在CA2和DG中估计，因为星形胶质细胞核比率在这些区域显著降低。反应性星形胶质细胞定义为突起短于体细胞直径的GFAP+细胞[16]．对所有实验组的反应性星形胶质细胞的数量进行估计，并与各自的对照组进行归一化(见第一部分)2.5）.在CA2中，反应性星形胶质细胞增加（；)及（；)，而齿状回反应性星形胶质细胞增多（；)及（；)的FFR(图8）.

4.讨论

神经性厌食症在女性青少年中很常见，是精神疾病中死亡率最高的疾病之一(10-20%)，甚至超过抑郁症[19- - - - - -21]．在青春期，由于影响海马体的激素突然上升，情绪波动和焦虑是很常见的[11，12，22]．此外，在基于活动的厌食症模型(ABA)中，已经观察到海马的结构和功能改变，并伴有类似焦虑的行为[1，11，12，23]然而，厌食症对星形胶质细胞密度的影响几乎没有被研究过。事实上，先前对大鼠胼胝体的研究表明，ABA模型的细胞增殖减少，而DIA模型的星形胶质细胞密度区域性降低[1，13]．ABA研究还报告了齿状回海马细胞增殖减少[1]．

本研究结果显示，厌食症降低CA2、CA3和DG星形胶质细胞密度，而CA1星形胶质细胞密度无明显变化。因此，厌食症突变小鼠(焦虑感和焦虑感)海马齿状回和CA3区c-Fos表达较低，而CA1区c-Fos表达无明显差异[24]．另一方面，GFAP+细胞密度降低导致GFAP蛋白表达减少。星形胶质细胞表达三种中间丝蛋白:GFAP、波形蛋白和巢蛋白[25]．巢蛋白和波形蛋白是未成熟星形胶质细胞的主要中间丝，而成熟和成年星形胶质细胞含有波形蛋白和GFAP [25]．有趣的是，厌食症增加了波形蛋白和巢蛋白的表达，类似于损伤后的反应性星形胶质细胞[26，27]．因此，在厌食症中，GFAP+细胞可能被波形蛋白+/巢蛋白+细胞所替代。为了支持这一假设，在实验海马损伤后观察到nestin再表达[25，28，29还有人类病理学，如多发性硬化症[30.]．此外，反应性星形胶质细胞在厌食和强制食物限制下增加，表明GFAP+细胞对严重的热量限制有反应[31]．另一个需要考虑的因素是，遭受厌食症或慢性压力的雌性动物停止卵巢周期，停止接触可能影响形态和星形细胞密度的激素[32，33]．此外，在ABA模型中海马胶质发生减少，而不是神经发生减少[1]．因此，星形胶质细胞具有不同程度的分化和成熟，即使在成人的大脑中，它们也可以在这些状态之间切换[26]同样，星形胶质细胞分泌胶质传递素和生长因子，如BDNF，这是突触可塑性、突触发生和神经发生所必需的[34，35]．因此，GFAP+细胞密度的降低可能会影响d-丝氨酸的海马胶质传递，d-丝氨酸是神经元nmda介导的传递和长期增强所必需的胶质递质[34]．成人海马树突的长期突触可塑性也需要BDNF等生长因子[35];然而，在ABA模型中，树突分枝减少，特别是在放射状层[11，12]因此，我们的结果显示，厌食症可降低GFAP+细胞密度和GFAP表达。在抑郁症大鼠模型中也有类似的结果，GFAP表达降低[36]．因此，我们推断GFAP+细胞和中间丝的表达受到厌食症的影响。我们的结果增加了关于厌食症小鼠模型海马结构变化的新信息。

相互竞争的利益

两位作者宣称他们没有相互竞争的利益。

致谢

作者感谢P. De Gortari博士(instituto Nacional De Psiquiatría, México)向他们介绍了DIA模型。作者感谢M. Macedo-Mendoza、M. E. Ramos-Aguilar、E. N. Hernández-Ríos、A. Castilla、L. Casanova、A. E. Espino和M. García-Servín提供的技术支持。作者感谢D. Pless博士审阅了这篇论文。作者感谢G. Ramírez-Rodríguez博士(Instituto Nacional de Psiquiatría, México)捐赠了用于这项研究的巢蛋白和波形蛋白抗体。Janina Krüger是DAAD-RISE项目支持的实习学生。Durairaj Ragu Varman是dgpa - unam资助的博士后研究员。这项工作得到了来自“Apoyo a Proyectos de Investigación e Innovación Tecnológica de la UNAM”(PAPIIT-UNAM: IN200913和IN201915)、Ataúlfo Martínez-Torres和Daniel Reyes-Haro的资助。

补充材料

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