重复3个小时母亲分离诱发类似抑郁的行为和影响的表达C57BL / 6 n小鼠海马Plasticity-Related蛋白质

文摘

不利的早期生活经历会影响日后的行为。孕产妇分离(MS)已经在动物模型中进行了广泛的调查在成人阶段的研究旨在探索女士女士的机制负面影响C57BL / 6 n小鼠,特别是在早期阶段女士所造成的影响。早期生活逆境尤其可以改变塑性功能。确定不良早期生活经历导致大脑海马可塑性的变化,我们建立了一个女士的范例。在这个研究中,老鼠接受温和(15分钟,MS15)或长时间(180分钟,MS180)孕产妇分离从产后第二天到出生后21天。老鼠接受了强迫游泳测试,尾巴暂停测试,分别和开放的现场试验。之后,老鼠在产后一天牺牲了31确定女士在生命早期阶段的影响。结果暗示女士诱发类似抑郁的行为和影响可能部分通过干扰海马GSK-3介导的β分子信号通路,通过减少一些plasticity-related蛋白质的水平。

1。介绍

在哺乳动物中,不良生活事件,发生在早期神经发展可以改变正常的大脑成长和压力弱点在成年期(1]。急性或慢性压力时期,尤其是在儿童和青少年时期,诱发情感和情感性精神障碍的发病,如抑郁和焦虑(2]。任何压力的时间和持续时间的经验,发生在新生儿或青少年时期可能需要促进适当的神经组织;这些参数也可以加剧长期行为变化的脆弱性3]。通常我们的研究旨在评估的机制新生儿和青少年之间的关系紧张经历可能会影响压力反应和C57BL / 6 n小鼠大脑可塑性。

我们在雄性小鼠诱导女士,一个建立模型的不良早期生活经历。考虑抑郁症,研究人员假设结构可塑性和神经营养因子是必要的调解行为反应,例如,女士神经丝轻链(NF-L)是一个可靠的标志结构可塑性;这个标志表示在分子水平上神经元损伤。NF-L也是一个亚基的神经纤维细丝(NFs)。NFs是特异性神经元细胞骨架纤维中最成熟的神经元。NFs提供结构支持神经元和突触;NFs还维护和控制神经细胞骨架可塑性通过调节神经突产物,轴突口径,轴突运输(4]。除了NF-L,脑源性神经营养因子(BDNF)是一种神经可塑性的关键调节器。BDNF强烈影响突触发生,脊椎形成(5),神经元生存(6),长期势差,神经元兴奋性(7),和成人海马神经发生8]。几个基因的转录,如脑源性神经营养因子,刺激通过激活营地的磷酸化反应元件结合蛋白(分子)(Ser133) [9]。被视为一个关键分子核蛋白质与抑郁症和抗抑郁药物治疗(10]。

的转导途径和上游信号分子CREB-BDNF是复杂的;在这些分子中,糖原合成酶激酶3 (GSK-3)是一个新近报道抑制性信号分子(11- - - - - -13]。这个激酶最初确定为葡萄糖代谢的关键酶。GSK-3广泛影响力的酶,这种酶被认为是影响各种各样的生物功能,因为这种酶调节一大群转录因子和转录调节器(14]。GSK-3由心境稳定剂可以直接抑制锂(15];这个结果表明GSK-3可能与情绪障碍的病理生理学有关。此外,GSK-3存在于两个紧密相关的亚型,即GSK-3α和GSK-3β。持续活跃GSK-3β是一个重要的调节蛋白参与许多neuroplasticity-associated胞内信号通路(16]。在我们的研究中,海马plasticity-related MS-induced类似抑郁的行为和一些蛋白质在雄性C57BL / 6 n小鼠观察;被调查的对女士的影响模型。底层机制也是GSK-3的基础上确定β分子信号通路。

2。材料和方法

2.1。实验动物

怀孕的C57BL / 6 n小鼠获得南京大学实验动物中心的中国医学。四个在家里的老鼠被安置在组笼子的树脂玻璃(35厘米×15厘米×10厘米)与锯末床上用品。标准的暗光下的动物是维护周期(灯6点至18:00)在室温下°C。老鼠可以免费获得食物和水。在实验之前,老鼠习惯于每天处理后一周交货。所有动物的治疗方法是按照住宿和照顾动物的指导方针由中国制定公约保护脊椎动物用于实验和其他科学目的。所有的努力都是尽量减少动物痛苦和减少用于实验的动物数量。

2.2。实验设计

老鼠出生在产后第一天(PD1),分别从PD2 PD21女士(MS发生当鼠标移动到一个笼子里);老鼠搬到孵化器(30 - 32°C)。MS180由每日分离的窝大坝和雄3 h (09:00-12:00 h),而MS15参与每日15分钟的短暂分离(09:00-09:15 h),如图1。

2.3。行为测试

行为进行了测试与DigBehav JLBehv-FSG-4隔音盒动物行为视频分析系统(上海Jiliang软件科技有限公司,上海,中国。DigBehav可以自动记录和分析动物运动提供总不动次置和结核菌素。增加类似抑郁的行为推断出时间固定在这些测试。置方法类似于被Porsolt et al。17]。考虑到我们的实验老鼠的年轻时代,更短的身体长度,和优化我们的preexperiment,老鼠分别放置在10厘米深的水环境温度(°C)在2000毫升玻璃烧杯和被允许游泳5分钟。另外,我们老鼠的强度较弱而成人的。考虑到上述,适应时间缩短为1分钟。静止的时间被记录在最后4分钟的测试。描述的测试方法类似于Steru et al。18]。置后,老鼠被允许休息24小时。每个鼠标然后挂在架子上的边缘在58厘米以上隔音盒子的底部,用胶带把约1厘米的尾巴。动物们被允许挂6分钟,和静止的时间被记录在最后4分钟的测试。

2.4。实时聚合酶链反应分析

从侧海马组织总RNA提取使用试剂盒试剂(cwbio cw0580)。互补脱氧核糖核酸合成了2μ使用RevertAid g总RNA的转录合成第一链cDNA工具包(Fermentas K1622)。定量实时PCR进行使用SYBR绿色主人混合(Fermentas K0222) StepOne实时PCR系统(美国ABI)。引物的序列是BDNF转发:5′-GGTCACAGCGGCAGATAAAAAGAC-3′,相反:5′-TTGGGTAGTTCGGCATTGCGAG-3′;NF-L转发:5′-GTTCAAGAGCCGCTTCACCG-3′,相反:5′-CCAGGGTCTTAGCCTTGAGCAG-3′;GAPDH转发:5′-TGAAGGTCGGAGTCAACGGATTTGGT-3′,逆转:5′-CATGTGGGCCATGAGGTCCACCAC-3′。使用以下热循环条件:初始变性在95°C 10分钟,其次是40周期在95°C的变性15秒然后退火和延伸,在60°C 1分钟。只有一个序列的扩增被每个反应的解离曲线验证。所有实验进行了一式三份,平均阈值周期(Ct)值是极端的Ct值的样本。GFAP的mRNA表达计算相对于房子保持基因GFAP使用方法,。

2.5。免疫印迹分析

侧海马组织样本均质在4°C 0.5毫升的包含50 mM Tris-HCl裂解缓冲,0.1%十二烷基硫酸钠(SDS), 1% Nonidet-P40 (NP-40σ),1毫米EDTA, 150毫米氯化钠,1毫米phenylmethylsulfonyl氟化物(σ),氟化钠1毫米,1毫米Na₃签证官₄,1μgmL⁻¹抑肽酶(σ),1μgmL⁻¹亮抑酶肽(σ)(pH值7.5)。整除的澄清均相液体,含有75μ克的蛋白质,在95°C变性5分钟的一个示例包含1% SDS的缓冲区,1%二硫苏糖醇(σ),10毫米Tris-HCl, 10%的甘油,1毫米EDTA (pH值8.0)。样品蛋白质被12% SDS-polyacrylamide凝胶电泳分离和转移到聚偏二氟乙烯膜(Bio-Rad)。主要抗体用于研究蛋白质表达的变化包括兔多克隆抗体anti-BDNF(1: 200年,Abcam ab6201),鼠标单克隆抗体anti-NF-L(1: 500年,表达载体,13 - 0400),兔单克隆anti-CREB(细胞信号1:1000年,9197年代),兔单克隆phospho-CREB (Ser133)(细胞信号1:1000年,9198年代),兔子单克隆anti-GSK-3β(1:1000、细胞信号、9315年代),兔子单克隆anti-phospho-GSK-3β(Ser9)(细胞信号1:1000年,9323年代),和鼠标单克隆抗-β肌动蛋白(σ1:2000年,A1978)。二次抗体包括辣根过氧化物酶共轭山羊anti-mouse免疫球蛋白g(1: 4000年,GenScript)和山羊anti-rabbit免疫球蛋白g(1: 4000年,GenScript)。通过增强化学发光免疫印迹检测(Bio-Rad XRS +)和分析使用ImageLab 5.0。脑源性神经营养因子的值,NF-L分子,GSK-3β对的数量水平正常化β肌动蛋白获得相同的样本。的phospho-GSK-3β/ GSK-3β和phospho-CREB /分子计算来反映GSK-3的活动β和分子。三个每个动物蛋白质样品检查为每个目标蛋白质。

2.6。统计分析

数据被表示为均值±SEM表明许多实验和分析使用社会科学统计软件包的计算机程序(版本20.0)。结果的统计学意义决定使用单向方差分析,其次是图基的事后测试。显著性水平是设定在对所有统计比较。

3所示。结果

3.1。母亲的分离对体重的影响

后代体重评估PND2、PND7 PND14 PND21, PND28。观察不同重量PND14 (,),PND21 (,)和PND28 (,),在MS180,体重轻于控制和MS15因为PND14 PND28(表1)。

3.2。母亲的分离对小鼠不动时间的影响测试

结核菌素(,),各组之间静止时间明显不同。多重比较试验显示,MS180诱导静止时间与对照组相比显著增加和MS15组结核菌素()。MS15和对照组无显著差异()(图2)。

3.3。母亲的分离对小鼠不动时间的影响置

置(,),各组之间静止时间明显不同。多重比较试验显示,MS180诱导静止时间较正常组显著增加浮置板轨道(和MS15)。MS15和对照组无显著差异()(图3)。

3.4。影响孕产妇分离在鼠标距离开放的现场试验

在开放的现场试验(,),结果显示(图组之间没有统计学意义4)。

3.5。孕产妇分离减少了海马BDNF的mRNA水平和C57BL / 6 n NF-L老鼠

的相对目标基因mRNA水平组如图5。方差分析测试显示出显著影响组织的海马BDNF的mRNA水平(,)和NF-L (,)。事后比较显示MS180显著降低海马BDNF和NF-L mRNA水平与对照组相比,MS15 ()。

3.6。孕产妇分离GSK-3的海马蛋白质含量降低β抑制磷酸化,激活分子,BDNF, NF-L

图6表明GSK-3的海马蛋白质水平βMS180组显著高于对照组和MS15集团(,)。phospho-GSK-3的比率β(Ser9)和GSK-3β明显不同的组(,)。相比之下,海马蛋白质分子的表达没有明显不同的组(,)。事后比较显示,phospho-CREB的比率(Ser133) MS180组低于对照组和MS15集团(,)。海马脑源性神经营养因子的蛋白质含量和NF-L MS180组明显低于对照组和MS15集团(,)。

4所示。讨论

先前的研究显示,感应敏锐地或亚急性女士正常小鼠引发类似抑郁的影响(19- - - - - -22]。然而,以前的研究集中在成人阶段的变化很少有研究证明女士女士的影响改变小鼠的早期阶段,尽管老鼠的生命早期阶段的关键时期神经系统的发展。因此,应该进行进一步的研究来探索女士在生命早期阶段的影响。

我们的研究表明,MS180显著降低浮置板轨道和/或静止时间的测试。抑郁症影响自发运动活动(23];因此,减少可能占MS-induced萧条不动时间。行为的研究结果与以前的研究中所描述的是一致的,该检查的效果不过,女士的老鼠在我们的研究中被监测产后31天,不是一般的年龄超过八周。

符合之前的发现,我们的研究结果证实,MS180诱导类似抑郁的行为和小鼠的海马损伤。这些结果是基于行为的增加静止时间测试和BDNF的表达,在海马体NF-L。此外,MS180明显诱导这些类似抑郁的影响;相比之下,MS15没有显著影响脑源性神经营养因子和NF-L蛋白质水平和行为测试结果。考虑到MS15并未显著降低脑源性神经营养因子或NF-L表达式在正常小鼠的海马,我们的结论是,女士诱导类似抑郁行为的结果降低了这些plasticity-related蛋白的表达;因此,神经可塑性可能抑制。

Neuroplasticity-related信号通路可能参与抑郁症的病理生理学机制(24,25]。在我们的研究中,这个问题被调查的参与解决CREB-BDNF海马的信号通路。海马脑源性神经营养因子表达的差别,对这些已经证明在各种动物抑郁模型和抑郁症患者;几类抗抑郁药物的慢性治疗增加了BDNF表达(26]。作为上游转录激活脑源性神经营养因子的镇定,海马表达分子却降低了在实验动物暴露于特定的压力(27,28]。降低分子的表达也被观察到在抑郁症患者29日,30.]。我们的研究结果表明,MS180规范化BDNF的表达下调海马mRNA和蛋白水平;MS180也减少了活化分子的C57BL / 6小鼠模型。这一结果进一步证实了长期女士的类似抑郁的影响;这个结果也表明MS180类似抑郁的影响可能是由于抑制CREB-BDNF在海马体。此外,MS15没有引起任何显著的抑郁行为测试的活动。MS15也无法影响的mRNA表达BDNF蛋白表达的phospho-CREB在海马体(Ser133)。因此,短期女士没有诱发抑郁症;相比之下,长期女士可能会导致抑郁。

之前的研究在不利的早期生活经历对中枢神经系统的影响集中在BDNF因为这个分子的独特作用在中枢神经系统。然而,很少有研究调查的机制影响女士BDNF的上游信号通路。我们的研究集中在GSK-3β另一种CREB-BDNF上游信号分子,因为GSK-3β参与各种信号系统(14),可能是与情绪障碍(11]。

GSK-3β和phospho-GSK-3β(Ser9)也在这个研究调查。我们的研究结果表明,MS180增加了GSK-3β表达和降低其抑制磷酸化。与先前的研究一致的抑郁大鼠和病人(31日,32),我们的研究结果进一步证实,GSK-3不足β抑制是抑郁的一个风险因素。在我们的研究中,MS180显著下调GSK-3的抑制磷酸化β在我们的模型;因此,MS180可能激活GSK-3β。我们所知,本研究是第一次调查的影响小鼠的早期阶段和女士检查海马GSK-3β在这个鼠标模型和活动水平。这项研究也是第一次揭示GSK-3女士的影响β在这个模型中。GSK-3β参与几个胞内信号通路参与神经保护(16]。我们的研究结果表明,GSK-3β分子信号通路可能导致一些plasticity-related蛋白质的表达降低海马;这个途径也可能诱发类似抑郁的症状。此外,MS-induced GSK-3的活动β分子信号通路可能是抑郁症的机制。

5。结论

海马的结构可塑性对不利的早期生活经历至关重要。在MS模型中,MS180诱导类似抑郁的行为和减少一些plasticity-related蛋白质的表达。MS180也抑制了CREB-BDNF海马的信号通路。此外,MS180 GSK-3抑制磷酸化的下降β;因此,CREB-BDNF信号通路抑制。因此,这种抑制作用可能占MS180的类似抑郁的活动。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

作者的贡献

桃之夭扁,丽丽杨和王Zhongli贡献同样的纸。

确认

这项研究是由中国国家自然科学基金资助(81373843,81473791)和NJUCM的青年科学基金项目(13 xzr32)。

引用

1. r·g·亨特和b·s·麦克尤恩”压力和焦虑在整个寿命:结构可塑性和表观遗传调控,”表观基因组学,5卷,不。2、177 - 194年,2013页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
2. n r·纽金特a . r . Tyrka l·l·卡彭特和l . h .价格,“基因-环境交互作用:早期生活压力和抑郁和焦虑障碍的风险,”精神药理学(柏林),卷214,不。1,第196 - 175页,2011。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
3. s . j . Russo j . w . Murrough M.-H。汉、d·s·恰尼和e . j .是个“坚韧的神经生物学,”自然神经科学,15卷,不。11日,第1484 - 1475页,2012年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
4. w . K.-H。Chan j . t . Yabe a . f . Pimenta d·奥尔蒂斯和t·b·谢伊,”神经纤维细丝可以进行轴突运输和细胞骨架不连续的方式合并,“细胞活性和细胞骨架,卷62,不。3、166 - 179年,2005页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
5. 吉井a和m . Constantine-Paton突触的突触后BDNF-TrkB信号成熟,可塑性和疾病,”发育神经生物学,卷70,不。5,304 - 322年,2010页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
6. r·h·利普斯基和a . m . Marini”,脑源性神经营养因子在神经细胞生存和行为相关的可塑性,”纽约科学院上卷,1122年,第143 - 130页,2007年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
7. l . Minichiello TrkB信号通路在LTP和学习,“神经系统科学自然评论,10卷,不。12日,第860 - 850页,2009年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
8. h·d·施密特和r s Duman“成人海马神经发生神经营养因子的作用,抗抑郁治疗和动物模型则行为,”行为药理学,18卷,不。5 - 6,391 - 418年,2007页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
9. a·c·孔蒂j·f·克莱恩,a·达尔维Lucki,和j·a . Blendy”阵营反应元件结合蛋白基本upregulation脑源性神经营养因子的转录,但不抗抑郁药物的行为或内分泌反应,”神经科学杂志》上,22卷,不。8,3262 - 3268年,2002页。视图:谷歌学术搜索
10. j . a . Blendy”分子在性抑郁症和抗抑郁药物治疗的作用,“生物精神病学卷,59号12日,第1150 - 1144页,2006年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
11. 李x和r . s . Jope”,是糖原合成酶激酶3中央调制器在情绪调节,”神经精神药理学,35卷,不。11日,第2154 - 2143页,2010年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
12. j . w . Tullai j . Chen m·e·谢弗e . Kamenetsky s Kasif g·m·库珀,“糖原合成酶激酶3压制环腺苷酸反应元件结合蛋白(分子)目标立即早期基因在静止细胞,”《生物化学》杂志上,卷282,不。13日,9482 - 9491年,2007页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
13. c·a·格里姆斯和r s Jope DNA结合活性分子抑制了糖原合成酶激酶3β,促进锂,”神经化学杂志,卷78,不。6,1219 - 1232年,2001页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
14. r s Jope g . v . w . Johnson,“糖原合酶激酶3的魅力和忧郁,“生化科学趋势卷,29号2、95 - 102年,2004页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
15. p·s·克莱因和d·A·梅尔顿”的分子机制发展锂的影响,“美国国家科学院院刊》上的美利坚合众国,卷93,不。16,8455 - 8459年,1996页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
16. 答:和田“锂和神经精神疗法:通过糖原合酶激酶3神经可塑性β,β连环蛋白和生成瀑布”,药理科学杂志》,卷110,不。1,14-28,2009页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
17. r·d·Porsolt m . Le Pichon和m . Jalfre“抗抑郁药治疗抑郁症:一种新的动物模型敏感,”自然,卷266,不。5604年,第732 - 730页,1977年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
18. l . Steru r . Chermat, b .蒂埃里·西蒙“尾巴悬挂测试:在小鼠体内抗抑郁药物筛选的新方法,”精神药理学(柏林),卷85,不。3、367 - 370年,1985页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
19. s . Penasco诉梅拉,j . a . Lopez-Moreno m·威韦罗曾和e·m·马可“早期母爱剥夺提高自愿饮酒引起的接触压力事件在以后的生活中,“神经可塑性文章ID 342761卷,2015年,10页,2015。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
20. l s和p·d·帕特尔,“母性行为和后代弹性孕产妇c57bl / 6小鼠分离,“激素和行为,卷63,不。3、411 - 417年,2013页。视图:谷歌学术搜索
21. m . Nishi n . Horii-Hayashi t Sasagawa, w . Matsunaga”早期生活压力对大脑活动的影响:影响从母体分离模型在啮齿动物,”一般和比较内分泌学,卷181,不。1,第309 - 306页,2013。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
22. L.-T。黄”时艰难的生活压力影响癫痫发生发展中海马和质数:细胞、分子、和表观遗传机制,“分子神经科学前沿第八条,卷。7日,2014年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
23. e·d·乔治·k·a·Bordner h . m . Elwafi和a . a .四门“孕产妇与早期断奶分离:一种新的小鼠模型的早期生活忽视,”BMC神经科学第123条,卷。11日,2010年。视图:谷歌学术搜索
24. s . b . Yoo俊男。金,金j.y. et al .,“青春期氟西汀raphe-hippocampus轴中的血清素激活的活动也增加了类似抑郁的行为在经验丰富的新生儿母亲分离雌性老鼠,”心理神经内分泌学,38卷,不。6,777 - 788年,2013页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
25. r·维达尔,f . Pilar-Cuellar Dos et al .,“新的战略发展的抗抑郁药:对神经可塑性的调节途径,”当前的药物设计,17卷,不。5,521 - 533年,2011页。视图:谷歌学术搜索
26. e . Castren诉Voikar, t . Rantamaki“抑郁症、神经营养因子的作用”当前舆论药理学,7卷,不。1、21页,2007页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
27. j·阿方索·l·r·弗里克·d·m·Silberman m . l .帕伦博,a . m .赫纳罗和a·c·Frasch”调节海马基因表达是守恒的两个物种承受不同的压力和抗抑郁治疗,”生物精神病学卷,59号3、244 - 251年,2006页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
28. l .歌曲,w·格瓦拉,w . Min-Wei y村上,k .松本,“空间学习和记忆障碍的习得性无助和慢性温和应激引起的,”药理生物化学和行为,卷83,不。2、186 - 193年,2006页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
29. I.-C。赖,C.-J。在香港,S.-J。蔡,”阵营反应元件结合蛋白的表达在抑郁症和抗抑郁药物治疗后,“Neuropsychobiology,48卷,不。4、182 - 185年,2003页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
30. 山田,m .山本h .小泽·里德和t .齐藤,“减少循环AMP-responsive元素结合蛋白的磷酸化后期重度抑郁症患者前额皮质的,”《神经传输,卷110,不。6,671 - 680年,2003页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
31. r·席尔瓦a . r . Mesquita j . Bessa et al .,“锂块应激则行为的变化和海马细胞的命运:glycogen-synthase-kinase-3beta的角色,”神经科学,卷152,不。3、656 - 669年,2008页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
32. d·h·哦,y . c .公园和s h·金”,增加糖原合成酶激酶3βmRNA水平重度抑郁症患者的海马:使用斯坦利神经病理学协会综合数据库的一项研究中,“精神病学调查,7卷,不。3、202 - 207年,2010页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索

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