文摘

岛叶皮质(IC)与重要功能与疼痛和情绪。据最近报道,在大脑中神经可塑性,包括集成电路可以诱导神经损伤,可能导致慢性疼痛。连续活性激酶蛋白激酶ζ(11ζ),一直保持长期势差。这个研究来确定PKM的角色ζ集成电路中可能参与神经性疼痛的调制。机械触诱发痛试验和免疫组织化学(zif268包含IHC),一个活动依赖性转录因子所需的神经可塑性,神经损伤后进行。后ζ-pseudosubstrate抑制肽(ZIP PKM的选择性抑制剂ζ)注入,机械触诱发痛PKM的试验和免疫印迹ζ,phospho-PKMζ(p-PKMζ),GluR1和GluR2被观察到。包含IHC证明zif268 IC神经损伤后表达明显增加。机械触诱发痛明显减少了ZIP显微镜下注射到IC。镇痛效应持续了12个小时。此外,GluR1的水平,GluR2, p-PKMζ在邮政显微镜下注射后下降。这些结果表明,周围神经损伤引起的神经可塑性与PKM有关ζ而邮政缓解慢性疼痛有潜在的应用。

1。介绍

神经创伤性神经可塑性在中枢神经系统(CNS)的一个重要机制在慢性疼痛1- - - - - -4]。长期势差(LTP),被认为是学习和记忆的神经基质,是一个潜在的突触可塑性机制(5,6]。此外,一些研究报道,LTP是诱导脊髓和大脑皮层的急性和慢性疼痛状态(7- - - - - -9]。因此,相信学习/记忆之间是一种常见的机制和慢性疼痛10]。

蛋白激酶米ζ(11ζ)是一个关键分子所需的维护后期LTP (L-LTP) [11,12]。它是一个非典型的PKC,其中包括11ζ,PKCζ,PKC ,PKCλ。因为11ζ只有PKC的催化域ζ,它可以持续激活(13]。ζ-pseudosubstrate抑制肽(ZIP) PKM的选择性抑制剂ζ,能扭转LTP维护和块L-LTP感应(14,15]。此外,邮政也可以扭转多种类型的记忆,如空间信息、恐惧、上瘾,和条件性味觉厌恶(CTA)内存15- - - - - -19]。几项研究已经报道,11ζ有关的痛苦记忆可以抹去在脊髓和大脑9,20.,21]。

岛叶皮质(IC)是一个可以的大脑区域,特别是有关情感方面的痛苦(22- - - - - -25]。临床和动物实验表明,IC的病变引起疼痛说示不能和可以扭转神经性疼痛状态26- - - - - -28]。门冬氨酸receptor-dependent塑料后神经损伤和PKM的变化ζ介导CTA记忆已报告在集成电路(16,29日]。然而,没有研究发表在即早期基因(IEG)表达对LTP和11ζ相关的可塑性机制在神经损伤后的集成电路。

Zif268,也称为早期生长反应蛋白1 (EGR-1),需要整合L-LTP在海马体和脊髓30.,31日]。为了确定是否有可能性的LTP感应IC神经损伤后,zif268进行免疫组化染色。此外,为了揭示是否11ζ集成电路中的信号参与维护神经性疼痛,PKM的表达水平ζ和phospho-PKMζ(p-PKMζ)测量IC邮政注入后,和镇痛效果以下邮政注入IC观察。

2。材料和方法

2.1。实验动物

实验协议在本研究符合国家健康研究所的指导方针和被批准的机构延世大学动物保健和使用委员会的卫生系统。成年男性Sprague-Dawley老鼠(Koatec、平泽市、韩国,250 - 280克)。老鼠被允许向殖民地的空间容纳7天后到来,被安置在塑料笼子。老鼠维持下一个12小时的光/暗周期与食物颗粒和水随意。

2.2。管子和神经性手术

插管注入,老鼠与戊巴比妥钠麻醉(50毫克/公斤,i.p)。28-gauge引导套管是双边植入IC(美联社:+ 1.0毫米,ML:±4.7毫米,和DV:−5.8毫米)立体定位框架。老鼠被允许恢复插管注入后7天。神经性疼痛的手术后进行恢复。Cannula-implanted老鼠与戊巴比妥钠麻醉(50毫克/公斤,i.p。)和左坐骨神经的分支被暴露。胫骨和腓肠神经紧密的结扎和4 - 0黑丝切断,而腓总神经被完好无损32]。同样的程序应用于sham-operated组没有神经损伤。伤口缝合肌肉和皮肤层。

2.3。行为测试机械触诱发痛

为了观察神经性疼痛的发展,机械触诱发痛测试是由一个实验者失明之前实验神经损伤,术后天(PODs) 1和3。老鼠放在一个金属网支撑长方形的透明圆顶。动物是约定俗成的测试条件测试开始前15分钟。退出阈值评估应用程序的电动·冯·弗雷灯丝(意大利瓦雷泽,尤格Basile)刺激的敏感地区nerve-injured后爪。这个测量是进行8乘以每隔2 - 3分钟。机械力的后爪的戒断反应发生时记录。积极对机械刺激的反应包括舔,突然撤军,咬的同侧的爪子。

2.4。邮政显微镜下注射入岛叶皮质和镇痛试验

ZIP显微镜下注射对POD 3。汉密尔顿注射器和PE-10油管与注射套管用于显微镜下注射。盐水(0.9%氯化钠)或10 nmol /μL ZIP (Tocris生物科学、明尼阿波利斯,美国)稀释在盐水注入到IC双边,0.5μL每一面。注射后,注射套管被保持在他们的地位至少1分钟。行为测试之前执行ZIP注入和30分钟和1,2,4,8、12、24、48小时后显微镜下注射。

2.5。免疫荧光双重染色

双重免疫荧光染色,老鼠深麻醉灌注聚氨酯和transcardially盐水其次是4%多聚甲醛在0.1钠磷酸盐缓冲剂(铅、pH值6.8)。大脑被撤头骨和后缀有4%多聚甲醛在4°C PB过夜。postfixation后,大脑块转移到磷酸盐(PBS, pH值7.4)含30%蔗糖为24小时。大脑样本覆盖cryosection化合物(徕卡冰冻切片复合FSC 22日,位于德国),被冻结在−70°C冷冻箱。样本组织被削减的日冕部分30μ525厚度在低温恒温器(嗯,热科学、沃尔瑟姆,妈,美国)。部分幻灯片然后洗3次1 x Tris-buffered盐水(TBS)含0.025% Triton x - 100。洗涤后,部分幻灯片在10%正常山羊血清(美国向量实验室,伯林盖姆,CA) 1%的牛血清白蛋白(BSA、热科学)在TBS 1小时在室温下。一夜之间,部分被孵化的兔单克隆抗体anti-zif268(1: 200年,圣克鲁斯生物技术、圣克鲁斯,CA,美国)和小鼠单克隆抗体anti-NeuN (Abcam 1: 200年,剑桥,英国)稀释10%正常山羊血清TBS含有1% BSA在4°C。部分被冲洗2 * 1 x Tween-20 TBS + 1%。洗2 * 10分钟后,部分被孵化在二级抗体是山羊anti-rabbit Alexa萤石488(1:200年,Abcam)和山羊anti-mouse Alexa萤石647(1:200年,Abcam),稀释10%正常山羊血清TBS含有1% BSA在室温下1小时。最后,幻灯片洗2次,1 x TBS含有0.025% Triton x - 100和安装在Vectashield安装媒体(向量实验室)。

2.6。免疫组织化学

计算的人口zif268-positive细胞,nickel-enhanced 3 3′-diaminobenzidine (DAB)免疫染色进行舱3。简单地说,老鼠大脑切片准备使用相同的步骤进行免疫荧光染色。zif268染色,部分幻灯片冲洗5次1 x PBS和孵化甲醇0.3% H2O215分钟抑制内源性过氧化物酶活性。洗部分幻灯片5次后,部分与PBS含有1%正常孵化马血清(向量实验室)30分钟,然后孵化一夜之间在4°C Triton x - 100 0.3%, 2%正常马血清(向量实验室),兔单克隆抗体anti-zif268(1: 4000年,圣克鲁斯生物技术)。部分被冲洗5次1 x PBS和孵化30分钟一个普遍的生物素化的anti-mouse /兔二次抗体(1:50,向量实验室)。部分幻灯片然后再洗,孵化与PBS包含30分钟avidin-biotinylated辣根过氧化物酶复合物(1:50,向量实验室)。洗5次15分钟后,部分被孵化5分钟解决方案包含0.1%的民建联和0.1%硫酸镍铵在1 H x PBS和0.01%2O2。最后,部分被洗去制止民建联反应,连续脱水在50岁,70年,95年,100%的乙醇,清除在二甲苯,和盖玻片Permount(费舍尔科学,沃尔瑟姆,妈,美国)。

量化zif268-positive细胞IC, 8代表从每个大脑部分集成电路的选择。各个部分的间隔是300年μm。因此,8小节将介绍前后的范围(2.1毫米)的集成电路IC。Zif268-positive细胞被确定参照Paxinos和华生的脑图谱33]。所有zif268-labeled细胞光场显微镜图像(×20目的,奥林巴斯BX40,奥林巴斯,东京,日本)是手工计算。实验者蒙蔽了治疗同侧和对侧的条件数的zif268-labeled细胞。

2.7。西方墨点法

收集岛皮质,动物与安氟醚麻醉和斩首。同侧和对侧的的吻侧岛皮质很快被孤立和转入冷冻箱。提取样本存储在−70°C。蛋白质提取,样品被声波降解法均质裂解缓冲(Proprep,基因内区生物技术公司,凭借、韩国)包含磷酸酶抑制剂(PhosStop,罗氏,潘茨堡,德国)。样本在22250 g离心10分钟4°C和收集上层清液,和总蛋白浓度的溶菌产物进行评估与分光光度计(nd - 1000, NanoDrop Technologies Inc。威尔明顿,美国)。10μL脑组织提取的蛋白质变性/好,运行在10% Bis-Tris凝胶(美国Bio-Rad大力神,CA) PKM的检测ζ,p-PKMζ、GluR1 GluR2。蛋白质被转移到聚乙二烯二氟化物(PVDF)膜(通用电气医疗集团,白金汉郡,英国)。膜被封锁在5%脱脂牛奶在TBS Tween-20 1小时孵化主要抗体在一夜之间摇摆平台上在4°C。主要抗体PKMζ(1:2000、细胞信号技术、贝弗利,妈,美国),p-PKMζ(1:2000年,细胞信号技术),GluR1(微孔1:2000年,泰梅库拉,妈,美国),GluR2(1: 2000年,Abcam)和GAPDH(1: 10000年,Ab前沿,首尔,韩国),用作加载控制,用于免疫印迹。第二天,膜被孵化在适当的二次抗体2小时和辣根过氧化物酶活动可视化使用化学发光底物(ECL '免疫印迹检测试剂,通用电气医疗集团)和处理本地分配系统(LAS) (ImageQuant拉斯维加斯4000迷你,通用电气医疗集团)。的强度PKM的乐队ζ、GluR1 GluR2 GAPDH强度归一化。p-PKM乐队的强度ζ规范化PKM的强度ζ。

2.8。统计分析

未配对 以及对于事后比较用于双官能团的比较而双向方差分析与反复的措施被用来分析行为测试。西方的屁股和包含IHC使用一个未配对比较 以及。所有数据被表示为均值±SEM。一个 被认为具有统计显著性值小于0.05。

3所示。结果

3.1。神经性疼痛的发展

受伤的两个主要分支(腓神经和胫神经)坐骨神经引起的机械触诱发痛在豆荚(图1和31)。重复测量双向方差分析表明影响集团( , )、豆荚( , ),和小组之间的互动和豆荚( , )。nerve-injured集团降低吊舱的机械阈值1 ( , ,未配对 以及)和POD 3 ( , ,未配对 以及)相对于虚假的集团( )。


图1
神经损伤后发展的机械触诱发痛。豆荚1和3,老鼠开发重要的神经性疼痛而虚假的集团( )。
3.2。免疫荧光双标记Zif268 NeuN

确认与zif268 co-labeled NeuN IC,双重标签zif268 NeuN执行。nerve-injured集团的代表图像数据所示2 (d),2 (e),2 (f),那些虚假的集团的数据所示2(一个),2 (b),2 (c)。Zif268免疫反应性(绿色)集成电路(图中可观察到2(一个)和2 (d))。NeuN神经元标记(红色),观察到IC(数据2 (b)和2 (e))。Colocalization zif268(绿色)和NeuN(红色)检测IC(数字2 (c)和2 (f))。如图2,与NeuN-positive zif268-positive细胞与细胞。这个结果表明zif268 IC神经元中表达。Nerve-injured老鼠有更多zif268-positive细胞(图2 (d)比虚假的组大鼠(图)2(一个))。NeuN-positive细胞的数量在IC nerve-injured之间(图相似2 (e)(图)和sham-operated组2 (b))。zif268和NeuN表达的合并数据表明,该集成电路与神经性疼痛(数字有关系2 (c)和2 (f))。

(一)
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(c)
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(f)
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图2
zif268表达的荧光图像的IC nerve-injured和虚假的团体。虚假的组(a)显示小zif268-positive细胞的表达,与nerve-injured组。(b) NeuN,神经元标记(红色),表示虚假的组。(c) Colocalization zif268(绿色)和NeuN(红色)是观察到的骗局。(d) nerve-injured组zif268表达式(绿色)的分布密度比虚假的组。(e)和(b)一样,NeuN nerve-injured组中表达。(f) (c), colocalization zif268的(绿色)和NeuN(红色)是观察nerve-injured组。规模的酒吧,50μm。
3.3。免疫组织化学的Zif268岛叶皮质

Zif268-positive细胞被发现的IC nerve-injured老鼠(数字3(一个)和3 (b))。此外,zif268免疫组织化学进行了量化zif268-positive nerve-injured和虚假的组织细胞。结果表明,nerve-injured zif268-positive细胞组的数量显著增加而虚假的集团( , ,未配对 以及;图3 (c))。

(一)
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(b)
(b)
(c)
(c)
图3
Zif268-positive IC。(a) Zif268-positive细胞细胞的IC sham-operated老鼠。(b) Zif268-positive细胞的IC nerve-injured老鼠。(c)的比较nerve-injured zif268-positive细胞和虚假的团体。Zif268-positive细胞显著增加神经损伤后的集成电路( )。细胞计数表达每一节。
3.4。邮政注入岛叶皮质

图4(一)显示了IC的注射部位。ZIP注入到IC减少机械触诱发痛逐渐POD 3。重复测量双向方差分析表明影响集团( , )、时间( , )和集团之间的相互作用和时间( , )。时间的机械触诱发痛ZIP-injected组( )舱3显示邮政的镇痛效果持续12小时后注射( ,未配对 以及;图4 (b)),镇痛测量相对于saline-injected集团( )。然而,在24和48小时内注射后,邮政没有显著的影响( ,未配对 以及)。

(一)
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(b)
(b)
图4
减少机械触诱发痛压缩后显微镜下注射到IC。(a)邮政注射部位的识别。ZIP是microinjected IC。(b)爪子撤军阈值在豆荚机械刺激3显微注射后大鼠的邮政编码。nerve-injured和虚假的团体之间的显著差异被发现时注入(分从30分钟到12小时后 )。箭头指示ZIP或生理盐水注射的时间点。
3.5。对PKM的影响ζ和p-PKMζ邮政显微镜下注射入岛叶皮质的表情

确定邮政的角色,IC穿孔ZIP注射后3小时。总PKMζZIP-injected组( )没有改变( ,未配对 以及;图5(一个))在豆荚3相对于saline-injected集团( )。然而,p-PKM的表达水平ζ表达下调了邮政注入的IC圆荚体3 ( ,未配对 以及;图5 (b))。

(一)
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(b)
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图5
表达水平的11ζ和p-PKMζ压缩后显微镜下注射到IC圆荚体3。(一)PKM的表达水平ζ归一化到GAPDH水平。在PKM没有显著差别ζ水平之间的生理盐水注射和邮政注射组( )。p-PKM (b)表达水平ζ归一化到11ζ的水平。ZIP注射后,p-PKMζ水平明显下降( )。
3.6。邮政的显微镜下注射到岛叶皮质GluR1和GluR2水平

我们推测,邮政的影响可能有助于抑制AMPA受体。因此,AMPA受体亚单位的表达水平GluR1和GluR2测量ZIP显微镜下注射后3仓。结果显示减少GluR1和GluR2水平( ,未配对 以及;数据6(一)和6 (b)、职责)ZIP-injected组( ),相对于saline-injected集团( )。

(一)
(一)
(b)
(b)
图6
GluR1表达水平和GluR2压缩后显微镜下注射到IC圆荚体3。(a)表达水平的GluR1规范化GAPDH水平。GluR1水平有显著区别生理盐水注射和邮政注射组。显微镜下注射压缩后,GluR1水平明显下降( )。(b)表达水平的GluR2规范化GAPDH水平。ZIP注射后,GluR2水平明显下降( )。

4所示。讨论

IC在口译过程中发挥作用的情感方面的痛苦的边缘系统领域(22]。几项研究已经报道,塑料IC在周围神经损伤后诱导的变化(29日,34]。因此,我们专注于塑料改变集成电路及其神经损伤后疼痛调制以了解慢性疼痛的机制。最近的报告表明,大脑神经损伤后功能变化可能是由LTP (2,9]。PKMζ扮演一个关键的角色在维持LTP, PKM的抑制ζ可以逆转慢性疼痛状态,可以消除建立记忆(12,18]。因此,本研究以确定执行相关的塑料改变LTP的形成,维护神经损伤后,IC在疼痛调制的作用。我们的研究表明,11ζ在IC可导致神经创伤性可塑性导致神经性疼痛的维护状态。

Zif268是一个著名的标志与LTP和神经可塑性(30.]。在海马体,L-LTP阶段需要的表达ieg如zif268和activity-regulated cytoskeletal-associated蛋白质(弧)35,36]。在海马体(LTP-inducing刺激增加zif268表达水平37]。此外,zif268基因敲除小鼠显示缺乏L-LTP和长期记忆受损30.]。c-Fos神经元激活标记,表示高度神经损伤后脊髓和前扣带皮层(ACC) (9]。表达c-Fos集成电路中增加了压力诱导痛觉过敏(38]。然而,由于zif268更与LTP和可塑性更大程度比c-Fos [39),改变zif268表达水平在神经损伤后的IC评估免疫组织化学研究。曾有一些报道说,zif268引起疼痛的刺激(39,40]。然而,没有报告zif268表达相关神经创伤性可塑性的IC。我们的研究结果表明,神经损伤后zif268-positive细胞数量的增加,这是有关神经创伤性LTP的IC。

动物与集成电路显示病变逆转神经性或炎性疼痛行为(27,28]。患者病变IC没有显示适当的对疼痛的反应,但所有其他感觉和认知功能仍然完好无损26]。此外,痛苦的刺激激活集成电路,集成电路的直接刺激可以唤起感觉痛苦,表明IC pronociceptive和参与疼痛感的解释(23,41,42]。

PKMζ是一个关键分子维持L-LTP和抑制11吗ζ可以擦掉了LTP (12,18]。尽管PKM的功能ζ据报道在一些有争议的研究(43- - - - - -45),最近的研究表明,非典型PKCs PKM补偿ζ维护本构PKM LTP的角色ζ基因敲除小鼠(46]。事实上,许多研究已经报道,邮政总局到脊髓能扭转炎性疼痛,但不是神经性疼痛(20.,21,47,48]。相反,邮政注入ACC逆转神经性疼痛状态,但镇痛效果消失后24小时内注入压缩(9]。根据这份报告,邮政注入IC的影响在本研究调查。邮政的影响持续了12个小时后注射到IC。我们的研究表明,神经损伤诱发塑性PKM有关ζ在集成电路和集成电路有一个疼痛调制函数。有趣的是,缓解疼痛的效果并不是永久的。这一现象被观察到在其他报告利用神经性疼痛模型。这可能是由于重建强直性LTP的外围传入驱动(9,48]。

PKMζ由福尔马林选择性地调节脊髓中,辣椒素,和神经损伤21,48]。ACC, 11ζ和p-PKMζ增加后神经损伤(9]。PKMζ由磷酸化激活,可以通过邮政(抑制18]。水平的提高p-PKMζ在ACC导致神经性疼痛9]。同样,增加p-PKM的水平ζ在脊髓导致formalin-induced疼痛47]。综上所述,我们假设upregulation p-PKMζ可能导致神经性疼痛州和邮政可以缓解神经性疼痛。事实上,p-PKM水平下降ζ观察后邮政注入。然而,PKM的表达水平ζ邮政注入后并没有改变。相比之下,鞘内注入压缩不减少p-PKMζ福尔马林模型大鼠的脊髓水平(47]。虽然我们的研究结果与这些研究不一致,我们的结果表明,p-PKM的功能ζ在集成电路不同于脊髓,和这些结果符合这些发现对ACC (9]。

一些报告表明,贩卖GluR2亚基的AMPA受体在海马体PKM有关ζ(12,49]。此外,恐惧记忆是由PKM维护ζ介导GluR2-dependent AMPA受体贩卖杏仁核(50]。其他报告表明GluR1亚基的AMPA受体参与cocaine-induced可塑性的分子机械的伏隔核(NAc) [51,52]。PKMζ介导LTP表达可以诱导N-ethylmaleimide-sensitive因素/ GluR2-dependent贩卖海马体(49]。有趣的是,我们的结果表明,GluR1和GluR2邮政注入水平表达下调的神经性疼痛模型大鼠。与此一致的是,GluR1水平下降后邮政注入神经性疼痛模型的ACC (9]。其他报告显示激活metabotropic GluR1 (mGluR1)需要岛L-LTP感应(53]。此外,邮政总局到南京汽车核心可以废除长期药物奖赏记忆影响GluR2-containing AMPA受体(54]。综上所述,我们认为PKMζ保持长期的疼痛反应塑料IC的变化通过GluR1和GluR2 AMPA受体的子单元。

5。结论

在这项研究中,我们证明了PKM之间有相关性ζ集成电路和神经可塑性,这或许可以解释慢性疼痛的机制。PKMζ似乎调解这种可塑性通过调节包含GluR1和GluR2 AMPA受体。此外,疼痛调制PKM IC相关的函数ζ是通过邮政管理局透露的。药物靶向抑制IC的可塑性可能因此出现慢性神经性疼痛治疗的策略。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

作者的贡献

Jeongsoo汉和Minjee Kwon同样这项工作。

承认

这项工作是由韩国国家研究基金会成立的科学,ICT和未来规划(nrf - 2014 r1a2a2a04004407)。