文摘
围产期窒息(PA)影响突触功能和组织形态。在之前的工作中,我们显示神经元和突触的变化鼠neostriatum受到缺氧导致长期ubi-protein积累。由于f -肌动蛋白是高度集中在树突棘,修改的组织可能与缺氧引起的变化在中枢神经系统(CNS)。在目前的研究中,我们调查PA的肌动蛋白细胞骨架的影响海马突触后密度(PSD)在四个月大的老鼠。PSD显示增加厚度和泛素化的水平。相关fluorescence-electron显微镜光致氧化表现出减少的F-actin-stained刺海马兴奋性突触受到PA。虽然免疫印迹分析也显示出轻微的减少β肌动蛋白在PSD PA的动物,并没有显著的差异。综上所述,这些数据表明,长期的肌动蛋白细胞骨架可能作用PSD的改变,将是一个由PA传播现象。
1。介绍
树突棘是小突起,作为突触后网站的中枢神经系统的兴奋性突触的90%。不同种类的基础上,阐述了树突棘的形状和肌动蛋白含量在成年老鼠的大脑。蘑菇树突棘茎分化和清醒的头脑,粗短的刺厚,没有脖子,和薄的刺一样长,没有脖子(1]。蘑菇树突棘有丰富的肌动蛋白细胞骨架网络(1,2),这是高度管制通过蛋白质稳定肌动蛋白单体(G-actin),如胸腺素或分析,arp2/3, Rho-GTPase激酶contractin或防止肌动蛋白的聚合和几个聚合物转换成小片段如cofilin和gelsolin [3]。
已经提出几个函数为他们一直与树突棘突触可塑性的机制,学习和记忆(4- - - - - -7),和蛋白质易位(8]。树突棘的功能下降是突触丢失的结果在神经退行性疾病和脑的侮辱9]。此外,过程,如失去树突棘,树突修剪,和损失的突触蛋白神经元死亡之前在许多神经退行性疾病(10- - - - - -12]。此外,ubiquitin-proteasome通路的激活和受损的功能被认为是导致许多神经退行性疾病(13]。因此,脊柱疾病可能参与不同的大脑侮辱包括缺氧缺血(14- - - - - -17]。围产期窒息(PA)是一种严重的临床并发症死亡率和发病率高(18]。爸爸后,大约有45%的新生儿死亡和永久性神经功能障碍25%包括脑瘫、智力障碍和发育迟缓,学习障碍,视觉和听觉问题,不同的问题在学校准备(19- - - - - -24]。
在之前的工作中,我们观察到一些改变在纹状体和海马区域PA,树突棘的ubiquitinization水平高,反应性胶质增生,改变树突微管组织,在组织细胞骨架和修改(17,25,26]。鉴于许多报告支持这样一个观点,树突棘是主要的站点在脑缺血受损(25,27),我们旨在研究树突棘数量变化是否引起的传播特性。为了这个目的,我们研究树突棘的修改地层radiatum的CA1海马区。
2。材料和方法
2.1。动物
所有程序涉及动物机构批准的动物保健和使用委员会布宜诺斯艾利斯大学(医学院),根据指南的原则进行的护理和使用实验动物(NIH出版物。80 - 23,1996年修订)。Sprague-Dawley怀孕的雌性老鼠在十五日被放置在单独的笼子和维护一个12:12 h光/暗周期控制温度(21±2°C)和湿度(65±5%)环境。动物获得食物(上贴chow)和自来水随意。一群动物()作为代孕母亲,另一组()是分配给程序。
2.2。材料
Eosin-phalloidin和Phalloidin-Alexa568年从英杰公司购买(卡尔斯巴德,CA)。二次抗体得到了鼠标从杰克逊ImmunoResearch实验室(西树林,PA)。多聚甲醛,EM年级戊二醛、钠甲次砷酸盐和Durcopan ACM树脂从电子显微镜获得科学(宾夕法尼亚州华盛顿堡);特殊涌出了组织文化板块获得MatTek(亚什兰,MA)。β肌动蛋白抗体购自Sigma-Aldrich(猫没有。A5441)。
2.3。感应的窒息
十个足月怀孕的大鼠在妊娠期天22麻醉(28),迅速斩首,子宫角通过腹部切口和放置在一个孤立在37°C水浴19分钟(subsevere PA:足月怀孕的老鼠)[25,26,29日- - - - - -31日]。我们使用19分钟,PA的最长时间,因为超过20分钟导致生存率低于3% (25]。窒息后,子宫角迅速打开,小狗被移除,羊水打扫干净了,小狗被执行触觉刺激刺激呼吸的医疗擦拭几分钟直到正常呼吸。脐带的结扎,和动物离开恢复1小时加热灯下。当他们的生理条件改善,他们给代孕母亲通常在过去24小时内交付。不同组的幼崽的明显标志和混合与代孕母亲的正常窝(控制动物(CTL),左原状)。我们和每一个代孕母亲保持10窝小狗。
2.4。Post-Asphyctic过程
每组4个月大的雄性老鼠(6)。短暂,与正常大鼠心脏灌注了林格氏35°C随后深麻醉下固定剂(含50毫克/公斤氯胺酮,1毫克/公斤rhompun和5毫克/公斤acetopromazine无菌生理盐水)。对于光学显微镜分析,老鼠灌注4%甲醛(现由多聚甲醛)0.1磷酸盐缓冲剂,pH值7.2。大脑被2额外的小时和固定在同一个解决方案在4°C。然后,部分是嵌入在Durcupan ACM树脂。删除后的大脑头骨,这是在2 h后缀相同的固定剂。冠状或sagital部分(50 - 80μ米)是用Vibratome(莱卡)。其中的一些部分被沾染了甲酚紫根据Capani中描述的程序等。32]。
2.5。光致氧化
Vibratome部分洗了50 mM glycine-PBS含有0.5%冷水鱼明胶阻止非特异性结合。30分钟后清洗,部分被孵化瓶,伊红phalloidin的0.05% - 0.5%的溶液中冷水鱼明胶/ 50 mM glycine-PBS 2 h在4°C。光显微镜研究phalloidin Alexa的共轭488年也被使用,因为其优越的荧光量子产率相比,伊红。消极的控制,eosin-phalloidin省略。组织部分沾eosin-phalloidin被安装在glass-welled组织培养菜(垫Tek公司)用表面进行预处理。片是2%戊二醛固定为2 - 5分钟0.1甲次砷酸盐缓冲,缓冲几分钟冲洗,放置在50 mM甘氨酸和氰化钾在甲次砷酸盐缓冲一个额外的5分钟,以减少非特异性染色。光致氧化进行上述蔡司Axiovert,配备75 w氙弧光源。样本沉浸在一个解决方案的2.8毫米diaminobenzidine 0.1钠甲次砷酸盐在4°C都洋溢着纯O2最后的pH值7.4,然后使用氙灯辐照下传统的这项工作。6 - 8分钟后,产品开始出现褐色反应的荧光。这个过程被停止停止激励(1]。
2.6。电子显微镜的过程
光致氧化后,组织部分在0.1钠甲次砷酸盐冲洗几次四氧化锇和孵化30分钟1% 0.1钠甲次砷酸盐,pH值7.2。几个洗后重蒸馏的H2啊,在一个提升乙醇脱水的部分系列,flat-embedded Durcopan ACM树脂,聚合为24小时60°C。串行薄片(80 - 100 nm)削减了Reichert Ultracut E超微切片机用玻璃刀和检查使用JEOL 100 cx电子显微镜在80 - 100 keV。一套薄片是poststained结合醋酸双氧铀及柠檬酸铅。E-PTA染色,部分在一个提升系列乙醇脱水至100%,染色1 h和1% PTA彩色由溶解0.1 g的PTA在10毫升的100%乙醇和四滴95%的乙醇33]。然后,部分是嵌入在Durcupan ACM树脂。
2.7。共焦的形态学分析数据
免疫反应性的物质的体积分数phalloidin韦贝尔估计使用点估算方法(345000年)和一个网格限定μ米2在海马体。总面积75000μ米2在每只动物评估。比例的活性面积估计使用图像1.41 J程序(图片0美国国家卫生研究院)。电子显微镜分析抽样,程序都改编自哈里斯et al。35)和Capani et al。1]。进行分析,刺从采样地层radiatumCA1海马区。所有的突触蘑菇树突棘的特点(头部大于颈部)被用于这项研究因为蘑菇树突棘是独特的f -肌动蛋白阳性刺(1]。随机字段包含至少一个突触的神经纤维网拍摄在10000 x放大和分析总放大倍数30000 x。我们分析了643个控制638刺刺和组织受到PA。
2.8。定量分析E-PTA材料
CA1海马标本被选为定量分析基于E-PTA染色的质量和超微结构的保护程度,确定从常规染色材料相同的动物。从控件(分析的样本)和19分钟PA动物()。组织部分在100纳米的厚度减少检查和拍照在8300 x 80 keV放大蔡司109电子显微镜。对于每一个动物,五显微图来自海马。如上所述,每个负面被数字化成PC电脑。使用NIH图像1.6,PSDs首次手动概述,然后最大厚度,最小厚度,长度,并确定每个PSD的总面积。所有突触的突触后密度,intracleft线,和突触前电网清晰可见选择进行分析。选择标准分析了30至50 PSDs /动物海马。
2.9。树突棘的定量分析
进行分析,刺从海马体被取样。所有的突触有蘑菇的特点类型树突棘(头部大于颈部)被用于这项研究因为蘑菇是独特的f -肌动蛋白阳性刺刺(1]。随机字段包含至少一个突触的神经纤维网拍摄在10000 x放大和分析总放大倍数30000 x。我们分析了643个控制638刺刺和组织缺氧。
2.10。PSDs的亚细胞分离和制备
生化分馏进行如前所述的•萨拉切诺提出等人使用目的在于保护整个背海马(17)(细胞毒性t淋巴细胞,;巴勒斯坦权力机构)。Dounce匀浆(H)颗粒的冰冷TEVP缓冲区(10毫米Tris-HCl, pH值7.4,5毫米氟化钠,Na3VO4 1毫米,1毫米EDTA, EGTA和1毫米,1.25μ10 g / mL抑肽素μ2.5 g / mL亮抑酶肽,μg / mL aproptionin, 0.5毫米PMSF)包含320毫米蔗糖在1000×g离心去除核和大碎片(P1)。上层清液(S1)离心机在10.000 g×10分钟获得原油synaptosomal分数(P2),随后是细胞溶解hypoosmotically和离心机在45.000 g×90分钟获得颗粒synaptosomal膜分数(LP1)。每次离心后,生成的颗粒与冰冷的冲洗简要TEVP缓冲,以免在后续部分可能的交叉污染。蛋白质浓度由布拉德福德估计技术。
2.11。免疫印迹
免疫印迹分析使用LP1分数10% sds - page分离。样本包含50μ克蛋白质从每一组应用于每一个车道。蛋白质电泳后,被转移到聚乙二烯二氟化物(PVDF)膜如前所述36- - - - - -38]。细胞膜主要抗体反被孵化β肌动蛋白(σ1:1000)在一夜之间在4°C。适当的洗涤程序之后,他们孵化与辣根peroxidase-conjugated anti-mouse二级抗体在室温下2小时。这些墨迹了一种ECL检测设备(Amersham)。电影进行扫描,光密度的蛋白质乐队是量化使用凝胶Pro分析仪软件3.1.00.00(美国媒体控制论)。我们使用glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶(GAPDH)负荷控制(17,39- - - - - -41]。
2.12。统计分析
结果表示为±SEM的手段。学生的以及。一个概率在5%或更少被认为是重要的。统计分析使用windows的GraphPad Prism 5.03统计软件包(GraphPad软件公司、圣地亚哥、钙、美国)。
3所示。结果与讨论
3.1。海马切片的显微分析部分
核由甲苯基紫染色形态学的研究表明PA动物存在明显核凝结后4个月CTL动物伤害地层radiatumCA1海马区部分(图1)。统计分析显示,海马CA1区锥体神经元的改变,表现出丰富的致密的原子核在asphyctic动物相比(表来控制动物1)。然后,我们使用神经核(NeuN) immunolabeling决定细胞的性质呈现凝聚核(图1)。统计分析显示无显著差异的数量NeuN + asphyctic动物的细胞核在CA1海马区控制。当我们NeuN标记的细胞分布分析,是确定asphyctic动物有显著提高不正常NeuN +核的数目和数量明显降低正常NeuN +核在CA1海马区与细胞毒性t淋巴细胞(表1)。为了确定这些细胞的形态,我们进行了常规电镜研究。形态分析表明,大多数细胞呈现凝聚核证据黑暗细胞质罕见的液泡和压实,肥厚性核仁,核与节日的形状,和一个扭曲的核膜,对应神经元变性(25,32,42,43)(图1)。
3.2。修改与E-PTA海马PSD染色
Osmium-lead-citrated染色显示没有明显的改变地层radiatumCA1海马区部分从4 CTL和PA老鼠(图2)。突触前终端、突触前囊泡和组织超微结构PSD完好无损(图2)。另一方面,E-PTA免疫染色显示明显改变突触的老鼠受到PA(图3)。爸爸后,PSD的厚度增加而控制(图3)。还有一般增量E-PTA-stained材料PSD的考评的动物相比,控制。执行的统计分析证实了这些变化。学生分析对PSD的面积和长度和PSD的最小和最大厚度显著()。事后测试显示,意味着PSD面积明显大而CTL集团()(表2)。这些矛盾锇和E-PTA染色可能归因于这样一个事实:一般重金属染色掩盖了发生在突触修改帖子asphyctic组织。此外,它可能E-PTA污渍PSD比osmium-uranium-lead方法不同的组件。已经知道PSDs沾E-PTA短,可能要比那些沾osmium-heavy金属方法(44]。E-PTA优先污渍蛋白(s)富含碱性氨基酸残基,其中包括赖氨酸、精氨酸和组氨酸,如胶原蛋白或组蛋白45]。相比之下,传统的重金属染色污渍广泛类型的脂质和细胞骨架和胞质元素(44]。因为标记染色不同的组件,这也许可以解释为什么E-PTA染色检测更有效比重型metal-stained PSDs改变部分。
符合其他的研究在不同的缺血模型(27,33,43和使用这种长期PA模型1),我们没有观察到任何改变海马材料的亚细胞组织沾osmium-heavy金属。然而,我们观察到显著增加在subsevere PA E-PTA-stained材料。虽然没有太多的数据可用在PA(细胞死亡的机制25,30.),这些发现表明,厚度的增加可能与异常蛋白质的降解可能之前死亡神经元触发机制。因此,我们假设一些早期的信号触发PSDs可能诱发神经末改变asphyctic后海马组织。
3.3。在海马PSDs Ubiquitin-Protein轭合物
因为我们和其他人证明E-PTA-stained总量可能是由异常蛋白质(25,33,46),我们执行immunoelectron显微镜后,程序之前被Capani et al。25为了发现泛素(图4)。我们观察到ubiquitinated PA的19分钟后突触蛋白地层radiatumCA1海马区域部分,而消极的控制,主要的抗体的问题却被忽略了,没有显示immunolabeling(数据没有显示)。我们很少发现泛素标记PSD的CTL的动物。考虑到这些结果,我们可以认为骨料asphyctic ubi-proteins存在于PSDs的动物,因为它在一些神经退行性疾病(47]。
尽管数据对细胞死亡机制在PA稀缺(25,30.),这些发现表明,PSD增厚可能与异常蛋白质的降解,可能在细胞死亡机制触发神经元。与这种观点一致,持续的泛素化在海马神经元的PSD(被发现46,48)短暂脑缺血后(43),这表明增加ubi-protein轭合物可能产生蛋白质损失。此外,破坏蛋白质可以在ROS产生的增量生产和calpain激活钙水平上升的后果后缺血侮辱(1,49,50]。另一方面,而其他热休克蛋白质可逆附着在变性蛋白质,帮助重新折叠或重组,ubiquitin-conjugated蛋白质是由26 S蛋白酶体降解[47]。PA侮辱激活泛素通路,从而可能影响神经元生存通过受损的蛋白质积累。因为神经元没有删除它的能力,ubi-protein积累导致神经元死亡。
3.4。f -肌动蛋白的变化引起的海马树突棘
大脑分触发器的早期增加谷氨酸在细胞外空间在突触水平(51]。高水平的树突棘谷氨酸产生一连串的事件,导致细胞死亡25,31日,33,43,48,52- - - - - -55]。由于树突棘的结构和功能是动态受不同的细胞通路作用于肌动蛋白细胞骨架,我们使用光和电子显微镜技术,以前用于我们的实验室1,56)和其他(4,8]研究f -肌动蛋白引起的修改PA。通过共焦显微镜分析,我们发现使用Phalloidin-Alexa树突棘由点状的染色568年。PA动物显示点状的减少染色对细胞毒性t淋巴细胞(图组5前)()。的形态学分析证实了这些数据。由于f -肌动蛋白主要集中在蘑菇树突棘(1),这种衰减与树突棘的f -肌动蛋白包含紧密相关。
电子显微镜分析脊柱人口photooxidated样本证实了共焦显微镜的观察。当我们分析不同的树突棘的数量,我们只观察到蘑菇树突棘的数量,控制动物,唯一F-actin-positive刺考评的19分钟后明显下降()(图5底)。相比之下,突触没有任何明显的退化的迹象asphyxic老鼠。孤立的突触体(LP1)分数使用反被免疫印迹分析β肌动蛋白抗体和量化数据5和6)。统计分析显示,平均光密度无显著差异的f -肌动蛋白乐队(= n)从宾夕法尼亚州和对照组。然而,PA动物显示数量的减少β肌动蛋白对动物细胞毒性t淋巴细胞()。这两个在活的有机体内和在体外研究显示高的浓度β在树突棘肌动蛋白参与突触在成人大脑的组织(57- - - - - -60]。虽然我们观察到的数量减少刺f -肌动蛋白阳性的PA动物,维护β肌动蛋白浓度在synaptosomal分数可能代表观察到的细胞骨架支持树突棘的结构保持稳定,因此,潜在的形态可塑性突触连接的情况下,自适应改变是足够的60]。符合这个角度来看,中断receptor-scaffold蛋白质NMDAR-PSD 95,这取决于肌动蛋白聚合作用,可以防止缺血后细胞死亡(61年]。
肌动蛋白细胞骨架是高度受几个肌动蛋白结合蛋白(ABP) [3]。许多abp一直参与在缺血神经元死亡的规定。脊柱形态学变化与一些ABP如gelsolin息息相关。几项研究使用不同模型的神经元细胞死亡证明,内生gelsolin凋亡特性相关的细胞骨架的动态行为。Gelsolin-null神经元有较高的细胞死亡和一个快速和持续的Ca2 +水平后葡萄糖/缺氧,以及增强胞质Ca2 +水平在神经终端在体外去极化(52]。Gelsolin也减少缺血梗塞大小后,防止神经元死亡(62年]。此外,组蛋白乙酰化作用引起的增量upregulation gelsolin,显著降低的水平肌动蛋白丝和小鼠的脑缺血后细胞死亡63年]。尽管最近的一项研究Gisselsson et al。15]表明肌动蛋白解聚作用阻止神经元死亡,我们假设的减少β肌动蛋白在synaptosomal分数也可以与细胞死亡后观察PA侮辱,这个过程是与异常ubi-protein增量。
此外,我们小组曾观察学习;参考和工作空间记忆障碍的莫里斯在3个月大鼠水迷宫,出生后立即受到急性窒息,使用hypoxic-ischemia模型描述了在目前的手稿(31日]。众所周知,这些空间的性能测试被中断后海马损伤(64年]。此外,赤字在小说的探索环境中观察。因此,突触修改asphyctic动物中观察到可能与先前所描述的行为缺陷我们组(31日]。
4所示。结论
这些发现表明,过多的蛋白质泛素化在海马PSD, 4个月后subsevere PA侮辱,似乎增量相关蛋白质积累。尽管这个增量,我们观察到的减少β肌动蛋白这表明PA是肌动蛋白细胞骨架破坏。此外,的数量β肌动蛋白在PA动物与蘑菇形的树突棘的数量递减。虽然还需要进一步的研究来确定ubi-protein积累PSD的角色,我们可以推测,PSD的改变可能参与的生成一个异常的生化途径导致长期修改PA动物的大脑中,我们描述了在先前的文献[25]。同意这个观点,阿尔茨海默病有一个肌动蛋白细胞骨架与PSD有害的行动,导致树突棘障碍和突触变性(65年]。
确认
这项研究受到了UBATYC 20020090100118也是20020090100118。作者还要感谢荷兰国际集团(Ing)。Elisa玛丽亚Bocanegra,荷兰国际集团(Ing)。罗伯特·弗朗西斯科Domizio从IHEM-CONICET Cuyo国立大学。g . e .•萨拉切诺提出奖学金持有人从目的在于保护国家(阿根廷)。