成年期氟西汀治疗不能改善行为障碍，可能对唐氏综合征Ts65Dn小鼠模型有不良影响

摘要

唐氏综合征是由21号染色体的三倍引起的，与神经认知表型有关，从严重的智力残疾到多种选择性神经心理缺陷，包括记忆障碍。在Ts65Dn小鼠唐氏综合征模型中，过度的gaba能神经传递导致海马回路局部过度抑制，抑制海马突触可塑性，导致认知障碍。用几种GABA处理_一种受体拮抗剂可增加Ts65Dn小鼠的可塑性，改善记忆障碍_一种然而，受体拮抗剂不适合临床应用。相反，选择性5 -羟色胺再摄取抑制剂氟西汀是一种广泛使用的抗抑郁药物，它还可以通过降低gaba能抑制来增强成年啮齿动物大脑的可塑性。由于这些原因，我们想知道，成年期开始的4周口服氟西汀治疗是否能恢复Ts65Dn小鼠的空间学习和记忆障碍。氟西汀不能显著改善Ts65Dn小鼠的行为损伤。相反，我们在氟西汀治疗的Ts65Dn小鼠中观察到了癫痫发作和死亡率，提高了这些不良治疗结果中药物×基因型相互作用的可能性。未来的研究应该在更大的动物队列中重新解决这一问题，并确定氟西汀治疗是否与唐氏综合征患者的不良治疗效果相关。

1.介绍

唐氏综合征是由21三体引起的，常与认知障碍有关。基于16号染色体(人类21号染色体的小鼠同源物)的部分三倍复制，已开发出一种小鼠模型(Ts65Dn)，显示行为异常，包括海马依赖性学习和记忆缺陷[1那2］.虽然关于唐氏综合征的神经生物学的大多数研究已经专注于神经发育，但最近的证据表明，成年脑中病理生理过程显着促进这种疾病中的认知障碍[3.-8.］.在Ts65Dn小鼠中，增强的抑制性突触传递抑制了海马突触可塑性的适当诱导，海马突触可塑性是学习和记忆形成的重要细胞机制[6.］.

引人注目的是，使用了各种不同的GABA_一种受体拮抗剂抑制成年Ts65Dn小鼠异常增加的抑制水平完全恢复他们的学习和记忆障碍，而不影响野生型对照[4.］.然而，这些有益的效果并不明显，只有急性给予加巴_一种受体拮抗剂，但只有在更长时间(2-3周)的治疗后才变得清晰[4.]。这种长期治疗足以导致认知功能的改善，持续时间远远超过实际治疗期[4.，表明治疗引发了持久的神经生物学变化。这样的结果让人想起那些在抑郁症患者的典型抗抑郁药物治疗中看到的结果。

这些非急性GABA的神经生物学基础_一种受体拮抗剂治疗引起的行为改变目前尚不清楚。然而，通过对大脑发育的简要回顾，可以对潜在的机制方面提供关键见解。在出生后的大脑发育过程中，抑制在调节关键时期的时间范围(即，感觉输入可以在很大程度上塑造大脑结构和功能的发育时间窗口)中起着重要的作用[9.那10］.逐渐增加的皮质抑制水平导致这些关键时期的关闭。因此，成熟的大脑不再具有如此高的可塑性。值得注意的是，一些实验操作发现，较低的抑制性突触传递恢复了成人大脑的高水平可塑性，类似于在关键时期发现的[11-13］.高水平的可塑性(关键期的特征)可能在成人中受到包括增强抑制在内的机制的积极抑制[14］.因此，通过降低抑制来增强成年大脑中可塑性的一种策略可以是去除这些约束14那15］.

从转译的角度来看，一种特别有趣的药理学操作报告称，通过广泛处方的抗抑郁药氟西汀的慢性治疗，成年大鼠视觉皮层的眼优势可塑性得以恢复，可能也通过减少抑制性突触传递[11］.Vetencourt等人使用脑内微透析显示氟西汀治疗动物视觉皮层细胞外GABA水平降低[11］.白质LTP，一种突触可塑性的形式，由于成熟的皮质内抑制，通常在成年大脑中缺失，但在氟西汀治疗的动物中存在[11］.氟西汀治疗后BDNF表达增加，皮质内BDNF注射足以导致单眼剥夺反应的眼优势转移[11］.为了测试氟西汀是否降低了抑制作用对眼优势可塑性伽马氨基丁酸的影响_一种氟西汀治疗小鼠的皮质内注射受体激动剂地西泮，完全阻断氟西汀对眼优势可塑性的影响[11］.

临床前GABA的翻译_一种在Ts65Dn小鼠中发现的受体拮抗剂[4.那8.]临床群体受到雇用的GABA没有雇用的事实受到阻碍_一种受体拮抗剂目前在临床中使用。加巴_一种受体拮抗剂具有狭窄的治疗窗口和严重的副作用，因此转化应用的潜力有限，因此需要寻找新的治疗方法。我们注意到，其他策略比GABA更安全_一种已经提出了受体拮抗剂，用于治疗唐氏综合征相关的认知障碍，包括GABA_一种受体α5-选择性逆激动剂和其他化合物[16-19］.

在这里，我们随访发现，慢性氟西汀治疗降低了抑制水平，增强了可塑性[11，提示慢性氟西汀给药可能对Ts65Dn小鼠的认知功能障碍有有益作用，类似于GABA_一种受体拮抗剂：选择性5-羟色胺再摄取抑制剂（SSRI）治疗，如氟西汀，影响5-羟色胺系统，对GABA能神经传递也有复杂影响[20.-23]包括突触前和突触后效应，可能包括由于细胞外5-羟色胺水平升高而抑制诱发抑制性突触后电位[23］.在海马体中，5 -羟色胺能系统被认为参与了从树突状区域到围体区域的抑制转移，这应该允许更大的树突状兴奋和突触可塑性[22］.

我们在唐氏综合征的Ts65Dn小鼠模型中测试了口服氟西汀治疗方案是否对认知障碍(莫里斯水迷宫中的空间学习)有治疗效果。氟西汀治疗Ts65Dn小鼠的行为障碍没有任何有益效果，但却出现了意料之外的副作用，包括治疗引起的癫痫发作和死亡，这些副作用似乎是基因型特异性的。

2.材料和方法

2．1.老鼠

C57BL/eJEiJ × C3Sn杂交产生实验动物。佛光。Pde6b+ B6EiC3Sn杂交野生型雄性F1。BLiA-Ts (17¹⁶）65dn / dnj女性（饲养员是从杰克逊实验室购买的）。使用1-1个配合方案，并用女性和她的垃圾在配合笼中留下雄性。断奶幼崽并在后期第21天获得了用于基因分型的尾部活组织检查。通过QPCR进行基因分型。实验动物以每笼2-4只小鼠组成的组。我们在12小时的光黑暗周期上保持动物。小鼠接受了水和食物随意.实验在周期的光照期内进行。用于实验的雄性和雌性动物在研究完成时的年龄在149到227天之间（各组的性别和年龄大致平衡）.所有实验均在不知道基因型和治疗的情况下进行。遵守当地和联邦有关动物福利的规定。

2.2.药理学

盐酸氟西汀(西格玛)以0.2 mg/mL的浓度通过饮水给动物注射，如前所述[11］.治疗4周后开始行为评估，治疗6周后处死。

２.３.水迷宫

最初，小鼠被处理了7天(大约2分钟/只/天)，以使动物适应研究者的接触和与任务相关的程序元素。在处理后，老鼠被训练在水迷宫的隐藏版本。在水迷宫的训练中，逃生平台被隐藏在水池的固定位置的水面下。池(Med Associates)直径1.2米，充满了不透明的水(温度:22-24°C)。使用自动跟踪系统(Ethovision XT, Noldus)记录动物的行为。在训练试验中，老鼠从七个随机分配的起始位置之一被放入池中。每只小鼠接受连续5天每天4次的训练试验。训练试验以两个连续试验的区块进行。因此，试验1和试验2、试验3和试验4之间的间隔时间约为1分钟，试验2和试验3之间的间隔时间约为90分钟。训练试验在小鼠爬上逃生平台或1分钟后完成，以先到者为准。 Animals were given 15 s posttrial interval on the escape platform after completion of training trials. To evaluate the accuracy with which the animals had learned the position of the escape platform, we performed a probe trial once training was completed. During the probe trial, we removed the escape platform from the pool, and animals were released into the pool from the starting position within the opposite quadrant (OQ). We determined the time that mice spent searching in the target quadrant (which previously contained the escape platform) or the other quadrants during the probe trial. Additionally, we analyzed the number of crossings of the exact target location (i.e., where the platform was during training) and compared it to crossings of analogous positions in the other quadrants. As an additional probe trial measure, we determined the average distance (proximity) to the target location and compared it to the average distance to corresponding locations in the other quadrants. To assess if the probe trial measures differed across genotypes and/or treatment groups, we performed a three-way ANOVA with genotype and treatment as between-subjects factors and quadrant as a within-subject factor. Additionally, to assess for spatial selectivity of searching during the probe trial, we performedT.- 将目标象限测量与其他象限的相应平均值进行比较。通过双向ANOVA进行培训期间的逃避延迟，与受试者之间的基因型和治疗。通过双向ANOVA分析训练期间的游泳速度和探针试验，与受试者之间的基因型和治疗。此外，通过双向ANOVA通过双向ANOVA进行探针试验期间行进的距离，以及受试者之间的基因型和治疗。

２.４.空旷的田野

小鼠被放置10分钟 在由丙烯酸制成的方形露天场地中的最小值（占地面积27.5 厘米×27.5 使用自动化系统（Ethovision XT，Noldus）记录和分析活动。在开阔场地的中心，将亮度设置为100勒克斯。

2.5。组织准备

小鼠麻醉后经心脏灌注0.9%生理盐水和4%多聚甲醛0.1 M磷酸盐缓冲液(pH 7.4)。大脑被提取出来，在4%多聚甲醛中过夜，然后转移到30%的蔗糖中。然后使用滑动切片机(徕卡)创建40微米冠状切片系列。切片保存在冷冻保护剂溶液(25%乙二醇，25%甘油，0.05 M磷酸盐缓冲液)中，温度为- 20℃。

2.6。免疫组织化学

上面提到的冠状截面系列的每六个第六部分（即第240部分 μ游离免疫组化。切片用TBS冲洗，在含0.6% H的溶液中孵育₂O.₂用3%驴血清和0.1% Triton X-100阻断TBS 30 min。切片在含有TBS、3%驴血清和0.1% Triton X-100的一抗溶液(兔抗胆碱乙酰转移酶(anti-ChAT)， Millipore, 1:10 0)中4°C孵育48 h。随后，切片在TBS中冲洗，在TBS中用3%驴血清和0.1% Triton X-100阻断，在室温下用二抗(生物素化驴抗兔IgG, Dianova, 1:50 0)孵育1小时。然后，切片用TBS洗涤，并在TBS (ABC Elite, Vector)中，在avitin-biotin -过氧化物酶复合物中孵育1小时。最后，用二氨基联苯胺(DAB, Roche)进行切片。切片被安装，风干，用一系列分级的乙醇脱水，然后用Permount安装。

2.7。立体学与图像分析

在240切片上对胆碱乙酰转移酶染色细胞进行细胞数量和细胞大小的体视学分析μM分开，覆盖了整个半球的额枕部。使用配备Stereo Investigator (MicroBrightField)的尼康Eclipse 90i显微镜进行分析。如前文所述，使用光学分分器方法无偏置定量分析基底前脑chat阳性神经元总数，包括腹侧斜带核(VDB)和内隔核(MSN) [24那25］.该方法允许对感兴趣区域(ROI)进行系统的随机抽样。概述ROI (MSN和VDB)的里程碑取自小鼠大脑图谱[26］.rois被手动标记，并且使用立体声调查器软件采用每个投资回报率的图片。使用90的采样网格 μm×90 μm系统地通过概述的ROI，我们计数chat阳性神经元，这些神经元要么在解剖计数框内(60μm×60μm）或触摸右/上边缘。在立体调查仪软件中使用核心探针在相同的部分系列上测定聊天免疫反应性神经元的细胞尺寸。使用从核延伸的六个射线标记细胞的边界，允许估计细胞表面积。

结果

为了测试成年期氟西汀治疗是否对Ts65Dn小鼠唐氏综合征模型相关的行为特征有有益的影响，我们在Ts65Dn小鼠和2N(二倍体)窝伴对照组(2N/vehicle:  小鼠；2N/氟西汀：  老鼠;TS65DN /车辆：  老鼠;TS65DN / Flyoxetine：  老鼠)。

在氟西汀或药物对照治疗1个月后测量体重(图)1；2 n、车辆:老鼠;2 n,氟西汀:老鼠;Ts65Dn、车辆:老鼠;Ts65Dn,氟西汀:老鼠)。以基因型和治疗为受试者间因素的双向方差分析显示，基因型的主效应显著(ANOVA基因型),)和处理(方差分析处理,)，但各因素之间无显著交互作用(,）.Flyoxetine治疗相对于TS65DN车辆控制（Fisher的PLSD TS65DN / Flyoxetine对TS65DN /车辆）减少了TS65dn小鼠体重的体重减少了体重  ）.氟西汀对2N同窝雌鼠的体重没有显著影响(Fisher 's PLSD 2N/vehicle vs 2N/氟西汀，）.

图1

用载体或氟西汀处理的TS65dn小鼠和野生型凋落物的体重（2N，车辆：  老鼠;2 n,氟西汀:老鼠;Ts65Dn、车辆:老鼠;Ts65Dn,氟西汀:老鼠)。双向ANOVA具有基因型和治疗的受试者因素显示出基因型的显着影响（ANOVA基因型那)和处理(方差分析处理那）.Posthoc分析显示，氟西汀处理的Ts65Dn小鼠体重明显低于药物处理的Ts65Dn小鼠(Fisher 's PLSD，）.氟西汀处理的2N对照组的体重与2N对照的体重没有显著差异(Fisher 's PLSD，）.图显示平均值±SEM。*表示比较的地方．n。表示比较的地方．

出乎意料的是，在大约6周的治疗期间，用氟西汀治疗的9个TS65dN小鼠中的4个中有4个（表1）.在载体处理的TS65dn小鼠（7只小鼠中有0个）和氟西汀处理的野生型动物（11只小鼠中有0）没有死亡。在载体处理的野生型组中，在治疗期间发现了8只小鼠中的1只小鼠（Fisher的确切试验，TS65DN / Flyoxetine组与来自其他组的折叠数据，  ）.

我们开始对氟西汀处理和载体处理的Ts65Dn小鼠及其各自的野生型对照组进行行为评估，方法是在开放的野外试验中测试一般的探索性活动(图)2；2 n、车辆:老鼠;2 n,氟西汀:老鼠;Ts65Dn、车辆:老鼠;Ts65Dn,氟西汀:老鼠)。将动物置于新的环境中，并记录活性水平。在开放场中行进的总距离没有基因型的影响（双向ANOVA，基因型和受试者之间的治疗：,）.统计分析显示，药物治疗对活性水平有显著影响(以基因型和治疗为受试者之间因素的双向方差分析:,）并提出可能的基因型×治疗相互作用（双向ANOVA，基因型和受试者之间的治疗：,）.氟西汀治疗的Ts65Dn小鼠的活动水平明显低于药物治疗的三体小鼠(Fisher 's PLSD，)相应的事后分析未显示治疗对野生型动物有显著影响（Fisher's PLSD，  ）.

图2

图中显示了Ts65Dn小鼠和使用氟西汀或vehicle (2N, vehicle:)治疗的野生型对照小鼠在开阔区域的总行走距离。老鼠;2 n,氟西汀:老鼠;Ts65Dn、车辆:老鼠;Ts65Dn,氟西汀:老鼠)。与受试者之间的基因型和治疗具有双向ANOVA，揭示了药物治疗对动态距离的显着影响（那)，并提出可能的基因型×处理交互作用(那）.Posthoc比较显示出相对于车辆处理的TS65DN动物（Fisher的PLSD）的氟西汀治疗的TS65DN小鼠的动态距离显着降低了气动距离  ）.相比之下，氟西汀对2N对照组的行走距离没有显著影响(Fisher 's PLSD 2N/氟西汀vs 2N/vehicle，）.图表显示平均值±SEM。*表示比较的地方．n。表示比较的地方．

为了确定氟西汀治疗是否能恢复Ts65Dn小鼠的空间学习和记忆缺陷，我们在隐藏平台型Morris水迷宫中测试了Ts65Dn小鼠和野生型同窝对照组（氟西汀治疗或载体治疗）（图3.；2 n、车辆:老鼠;2 n,氟西汀:老鼠;Ts65Dn、车辆:老鼠;Ts65Dn,氟西汀:老鼠)。连续5天，每天进行4次训练试验。在训练期间，所有组的逃跑潜伏期都降低了(图)3(一个))，尽管在Ts65Dn小鼠中有更有限的程度(vehicle和氟西汀治疗)。统计分析显示，与2N对照组相比，Ts65Dn小鼠中逃脱潜伏期较高的基因型具有显著的主效应(基因型和治疗作为受试者之间因素的双向方差分析:,）.治疗没有显著的主效应(双向方差分析:,)，且无基因型×治疗交互作用(双因素方差分析:,）.我们分析了所有训练阶段的游泳速度和探针试验，使用重复测量的双向方差分析，将基因型和治疗作为受试者之间的因素(图)3 (b)）.TS65DN小鼠相对于2N控制，游泳速度显着降低（重复测量双向ANOVA：,）.治疗对游泳速度没有显著影响(重复测量的双向方差分析:,）没有显着的基因型×治疗互动（重复测量双向ANOVA：,）.

(一)

(b)

(c)

(d)

(e)

(f)

(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)

图3

在莫里斯水迷宫隐藏版本中对Ts65Dn小鼠和2N对照组的评估结果（2N，载体：老鼠;2 n,氟西汀:老鼠;Ts65Dn、车辆:老鼠;TS65DN，Flyoxetine：老鼠)。(一)逃避延迟。(b)训练试验和探测试验时的游泳速度。(c) - (e)探测试验措施:(c)占据象限，(d)目标过境点，(e)目标距离，(f)总行驶距离。池象限:目标象限(TQ)、相邻右象限(AR)、对象限(OQ)和相邻左象限(AL)。图表显示平均值±SEM。Arunachal Pradesh，那*那n。．统计分析详见正文。

为了评估小鼠在训练期间学到了逃生平台位置的准确性，我们在完成培训后进行了一次探测试验（水箱中没有平台）（图3 (c)那3 (d),3 (e)).我们分析了几种探测试验措施，这些措施报告了搜索的空间选择性，因此表明了发生的空间学习程度。

首先，我们测量了在探针试验期间动物在目标象限（之前包含逃生平台）和其他象限的时间（图1）3 (c)）.象限占用数据的统计分析显示出显着的基因型×象限和治疗×象限相互作用（以对象的受试者因子和象限和象限的基因型和治疗的三元ANOVA：基因型×象限相互作用，F(3116) = 5.24;，处理×象限交互:F（3,116）= 5.48，  )，说明基因型和治疗对象限占比有显著影响。车辆处理的2N对照组在目标象限的时间明显多于其他象限(T.-测试，目标象限占用率与其他象限的平均占用率：  )，表示平台位置的内存。相比之下，在其他组中，目标象限的占用率与其他象限的平均占用率没有显著差异(T.-测试，目标象限占用率与其他象限的平均占用率：2N/氟西汀，  ；TS65DN /车辆，  ；TS65DN / Flyoxetine，  ）.

我们还记录了目标交叉的数量（即，在训练期间在训练期间定位的确切目标位置的交叉点），该探测试验是与其他象限的相应位置上的交叉数量进行比较（图3 (d)）.关于目标交叉，单因素方差分析得出了基因型的显著影响(将基因型和治疗作为受试者之间的因素，象限作为受试者内部因素的三因素方差分析:F(1,116) = 17.3,  ），反映TS65DN小鼠中的整体减少的交叉数，另外，可能的基因型×象限相互作用（在受试者之间是受试者因子因子之间的基因型和治疗的三元ANOVA：F(3116) = 2.25,）.为了进一步探讨用于搜索的空间选择性，我们询问动物是否比目标位置上的交叉显示得比在其他象限中的相应位置上方。氟西汀治疗的2N小鼠比其他位置显示出目标位置的跨线（T.-test，目标交叉与其他象限中相应位置的平均交叉:)，而其他组别则并非如此(T.-test，目标交叉口与其他象限中相应位置的平均交叉口:2N/车辆，；TS65DN /车辆，  ；TS65DN / Flyoxetine，  ）.

作为搜索空间选择性的第三个衡量标准，我们观察了与目标的接近程度（即到目标位置的平均距离，平台在训练期间位于该位置），并将其与到其他象限中相应位置的平均距离进行比较（图2）3 (e)）.以基因型和治疗为被试间因素，象限为被试内因素的三因素方差分析显示，基因型的主效应显著(F(1116) = 7.10,)，这反映了Ts65Dn小鼠到目标位置和其他象限相应位置的总体距离较大。该方差分析还显示了显著的基因型×象限交互作用(F（3,116）= 4.10，  )和显著处理×象限交互作用(F（3,116）= 5.25，  )，表明搜索模式受基因型和治疗的影响，因此，在Ts65Dn小鼠/氟西汀治疗的小鼠中，靶向优先搜索不明显或不存在。经过药物处理的2N只小鼠与目标的距离明显低于与其他位置的平均距离(T.测试，与目标的接近度与其他象限中相应位置的平均接近度:)，再次表示优先在这组目标的相对附近搜索。该比较结果对其他组无显著性影响(T.- 最低，目标过境与其他象限相当相应位置的平均交叉口：2N / Flyoxetine，  ；TS65DN /车辆，  ；TS65DN / Flyoxetine，  ）.正如TS65DN小鼠的较慢的游泳速度（见上文）所预期的（见上文），TS65DN小鼠在探针试验期间行进的总距离显着降低（图3 (f)；双向Anova具有基因型和治疗，受试者之间的因素：基因型效应，,；治疗效果，,，基因型×处理互作，,）.

总的来说，探针试验显示了空间选择性搜索的迹象，因此，在车辆治疗(见象限占据和接近目标)和氟西汀治疗(见目标交叉点)2N小鼠中成功的空间学习和记忆，但在Ts65Dn小鼠中没有，不管治疗组如何。这些数据显示了Ts65Dn小鼠在水迷宫中的明显行为异常，与已发表的数据一致[2那8.那27，并反映Ts65Dn小鼠的运动障碍(见游泳速度)和空间学习和记忆困难(见探针试验措施)。氟西汀治疗后，Ts65Dn小鼠的运动障碍和空间学习障碍均未得到改善。

在行为实验期间，我们偶然目睹了通过处理少量动物（共3只小鼠）引发的滋补克隆癫痫发作（表2）.所有观察到的癫痫发作都发生在氟西汀治疗的TS65DN小鼠中。在其他群体中未观察到癫痫发作（Fisher的确切测试，TS65DN / Flyoxetine Group与来自其他组的折叠数据，  ）.

唐氏综合症和阿尔茨海默病的神经病理学特征之一是基底前脑胆碱能神经元(BFCNs)的年龄依赖性丧失[24那28］.此前的研究指出，Ts65Dn衰老小鼠BFCN变性与记忆和学习异常之间存在相关性[24］.为了探究氟西汀是否能够改善或防止Ts65Dn小鼠早期BFCN变性，我们在氟西汀治疗的动物和对照剂中进行了胆碱乙酰转移酶(ChAT)抗体染色切片的无偏性体视学细胞计数。我们测定了胆碱能细胞的数量和大小(图4.)、内隔核(MSN)和腹侧斜带(VDB)。老鼠;2 n,氟西汀:老鼠;Ts65Dn、车辆:老鼠;Ts65Dn,氟西汀:老鼠)。

(一)

(b)

(一)
(b)

图4

μ F F F F F F 对Ts65Dn小鼠基底前脑胆碱能核中胆碱乙酰转移酶(ChAT-)阳性细胞进行体视学评估的结果显示，无论是氟西汀治疗还是载体治疗(2N，载体:老鼠;2 n,氟西汀:老鼠;Ts65Dn、车辆:老鼠;TS65DN，Flyoxetine：老鼠)。(a)前脑胆碱能基底核胆碱乙酰转移酶(ChAT-)阳性细胞的体视学计数。显示的是2N对照组和Ts65Dn小鼠接受vehicle或氟西汀治疗的代表性脑切片。比例尺= 50m.条形图显示了量化结果。在Ts65Dn小鼠和2N对照组之间，没有检测到胆碱能细胞数量的差异(将基因型和治疗作为受试者之间的因素进行双向方差分析:基因型效应，(27) = 0.04,；治疗效果，（1,27）= 0.61，  ；基因型×治疗互动，（1,27）= 0.49，  ）.图表显示平均值±SEM。（b）胆碱乙酰转移酶的细胞尺寸 - 来自TS65DN小鼠和2N对照的基础前脑胆碱能核中的氨基乙酰转移酶 - （聊天）阳性细胞。显示的是来自用载体或用氟氯胺处理的氟氯胺和氟西汀和TS65DN小鼠处理的各种液体小鼠的代表性聊天神经元。条形图描绘了聊天免疫反应细胞的细胞尺寸分布。欧共比略差小鼠的胆碱能神经元似乎大于TS65DN小鼠，但统计比较不显着（双向ANOVA与受试者之间的基因型和治疗的双向ANOVA：基因型效应，(27) = 2.2,）.氟西汀治疗对细胞大小没有显著影响，尽管在Ts65Dn小鼠中有增加细胞大小的趋势(基因型和治疗作为受试者之间的因素的双向方差分析:治疗效果，(27) = 3.08,；基因型×治疗互动，(1,27) = 3.14,  ）.图表显示平均值±SEM。

在三体和整倍体小鼠之间，胆碱能细胞数量没有明显差异（受试者因素之间基因型和治疗的双向方差分析：F(27) = 0.04,）.治疗对基底前脑胆碱能核chat阳性细胞数也无明显影响(基因型和治疗为受试者间因素的双向方差分析:F（1,27）= 0.61，  ).因为神经元萎缩先于细胞丢失[28，我们分析了氟西汀/载体处理的Ts65Dn小鼠/野生型对照BFCN中chat阳性细胞的大小。整倍体小鼠的胆碱能神经元比三体小鼠的胆碱能神经元大不显著(基因型和治疗作为受试者之间因素的双向方差分析:F(27) = 2.2,）.氟西汀治疗对细胞大小没有显著影响，尽管在Ts65Dn小鼠中有增加细胞大小的趋势(基因型和治疗作为受试者之间的因素的双向方差分析:治疗效果，F(27) = 3.08,；基因型×治疗互动，F(1,27) = 3.14,  ）.

4.讨论

在本研究中，我们开始测试4周成人期氟西汀治疗是否对唐氏综合征Ts65Dn小鼠模型的行为改变有效。我们在Ts65Dn小鼠中未发现氟西汀治疗方案的明显益处。特别是，我们没有观察到对明确的Ts65Dn行为改变的治疗效果水迷宫中的表型，包括较慢的游泳速度和对指示空间学习和记忆损伤的探针试验测量的影响。

然而，在我们的队列研究中，氟西汀治疗Ts65Dn小鼠的副作用似乎很严重。9只Ts65Dn小鼠中有4只在氟西汀治疗期间死亡，而在此期间，其他组中没有死亡(1只野生型/运载动物死亡)。这些结果表明氟西汀可能具有基因型特异性的不良反应，并为进一步在更大的动物队列中进行实验提供了依据，这些动物队列也评估了氟西汀治疗的Ts65Dn小鼠的死亡原因。

我们在少量氟西汀治疗的Ts65Dn小鼠中观察了处理诱发的癫痫发作，提示Ts65Dn基因型和氟西汀治疗对癫痫易感性的交互作用。癫痫发作是氟西汀治疗方案在一般临床人群中相对少见的副作用，但却是氟西汀中毒较为常见的特征[29-31］.动物模型中的几种癫痫范式也表明氟西汀有促惊厥作用;例如，氟西汀预处理增强了戊四唑(PTZ)的惊厥作用和电诱发癫痫[32那33］.总的来说，这些报告显示，治疗具有选择性血清素再摄取抑制剂，包括氟西汀，可以降低人类和动物模型中的癫痫发作阈值。

癫痫于唐氏综合症并不少见，可能影响1-13％的三元素21 [34那35］.虽然自发性癫痫不是Ts65Dn模型的特征，但Ts65Dn小鼠比对照组更容易发生听觉性癫痫[36，表明该模型中癫痫发作阈值降低。总而言之，上述数据提高了Ts65Dn小鼠行为惊厥的可能性，即氟西汀与Ts65Dn小鼠癫痫阈值降低之间的相互作用。未来的研究应该在更大的动物队列中检查这些影响，并包括癫痫发作活动的电生理学评估。

在目前的研究中，我们采用了以前使用过的氟西汀治疗方案[11，即0.2 mg/mL氟西汀经饮用水给药。这种治疗方法被发现可以降低皮质内抑制并恢复成人视觉皮质的眼优势可塑性[11］.氟西汀剂量高于临床使用剂量的啮齿动物当量(即，将临床使用剂量转换为小鼠/大鼠的等效表面积剂量)，但属于一般用于小鼠和大鼠的氟西汀剂量方案的范围(例如，[20.那37那38])。在未来的工作中，建立一个针对Ts65Dn小鼠副作用的剂量-反应函数将是重要的。基于我们目前的数据，我们不能排除低剂量氟西汀在唐氏综合征Ts65Dn模型中发挥有益作用的可能性。同样重要的是，确定药物×基因型相互作用是否由氟西汀CNS效应的基因型依赖差异引起，或者可能是Ts65Dn小鼠和野生型对照的不同药代动力学谱(如氟西汀代谢、组织分布等)。

本研究中使用的动物部分处于Ts65Dn小鼠神经退行性过程可能缓慢开始的年龄范围(即>6个月大)。我们通过对基底前脑胆碱能神经元的体视学量化评估神经变性，没有观察到三体和整倍体动物之间的显著差异(图)4.)，表明在我们的Ts65Dn队列中，神经退行性变化不是一个突出的特征(与其他报告一致，表明影响Ts65Dn小鼠胆碱能系统的退行性变化的最初迹象出现在6至12个月之间;［28那39])。然而，我们不能排除细微的退行性变化已经存在的可能性，但在我们的队列中无法测量。因此，成年期氟西汀治疗仍有可能对3-6月龄Ts65Dn小鼠(即在成年期狭窄的时间窗内，Ts65Dn小鼠被认为没有退行性变化)产生有益效果。

先前的一项研究评估了氟西汀治疗对2-5个月大Ts65Dn小鼠海马神经发生的影响[40］.氟西汀被施用I.P.并且治疗较短（15天），并且比本研究中的治疗涉及低计量剂（5mg / kg）。氟西汀治疗在TS65DN小鼠和野生型控制中增加神经发生[40，这与早期关于慢性氟西汀治疗对成人海马神经发生影响的报道一致[41］.行为结果未被报道，因此，在本研究中氟西汀治疗Ts65Dn小鼠是否存在与行为效应相关尚不清楚。

另一项最近的研究报告了出生后早期给予氟西汀对Ts65Dn小鼠模型的有益作用[42］.在这项研究中，在P3至P15期间给予氟西汀(P3至P7期间注射5mg /kg氟西汀，P8至P15期间注射10mg /kg氟西汀)，然后在P15处注射BrdU以标记增殖细胞。氟西汀可促进Ts65Dn小鼠和野生型对照组齿状回和心室下区细胞增殖和新神经元的生成。氟西汀使Ts65Dn小鼠P45处齿状回颗粒细胞数量增加到野生型对照水平，而在载药型Ts65Dn小鼠中颗粒细胞数量减少。在本研究中对青少年进行了有限的行为评估(在P43)。背景:出生后早期氟西汀治疗可改善Ts65Dn幼年小鼠的恐惧条件障碍，而氟西汀对野生型对照组无影响。在目前的研究中，我们没有发现氟西汀治疗对Morris水迷宫中Ts65Dn成年小鼠的行为障碍的有益作用。出生后早期和成年期氟西汀治疗可能对Ts65Dn小鼠的行为障碍有不同的影响。然而，我们的研究方案在许多其他方面也与发表的论文不同(例如，氟西汀剂量、给药途径和治疗时间;行为范式:这里，我们评估了水迷宫中的学习; Bianchi et al. assessed fear conditioning), which may also account for the different findings. In future studies, it will therefore be important to further explore this parameter space, that is, to establish dose-response relationships for fluoxetine treatment in Ts65Dn mice at different ages and to conduct comprehensive behavioral assessments that cover impairments of Ts65Dn mice in a range of behavioral tasks.

5.结论

在这里，我们确定了一种成年期开始的慢性抗抑郁药物氟西汀治疗对唐氏综合征Ts65Dn小鼠模型行为改变的影响。我们没有发现氟西汀治疗对Ts65Dn行为表型的有益影响，但我们的研究结果表明存在基因型依赖的氟西汀副作用;我们观察了治疗Ts65Dn小鼠的癫痫发作和死亡率，但未观察野生型小鼠。未来的研究应该在更大的动物队列中重新评估这些发现，确定可能的药物×基因型相互作用的性质(例如，药物代谢、组织分布中的基因型依赖差异，或等效药物组织浓度对细胞/组织功能的真正差异效应)，并建立这些可能副作用的剂量-反应关系。

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