感觉刺激后小鼠脊髓活性星形胶质细胞的钙成像

摘要

星形Ca²⁺动力学已被广泛地研究体外楷模;然而，最近的双光子显微镜和星形胶质细胞特异性标记的发展允许研究CA²⁺活中枢神经系统的信号传导。Ca²⁺在培养的细胞和切片制剂中描述了星形胶质细胞的波浪，但缺乏感觉活动期间星形胶质激活的证据。目前有几种方法是图像生活脊髓：呼吸和心脏跳动的工件阻碍了这种技术的广泛应用。在C57BL6 / J小鼠中，我们通过双光子显微镜将活脊髓成像。通过加压注射，我们使用红色荧光染料苏尔磺胺胺101（SR101）和成像星形胶质瘤CA的脊髓星形胶质细胞。²⁺俄勒冈绿色BAPTA-1 (OGB)水平。然后，我们研究了星形细胞钙²⁺静息和右后爪电刺激后的水平。感觉刺激显著增加星形细胞钙²⁺与静止相比，脊髓的浅层背角内的水平。综上所述，体内脊髓中活性星形胶质细胞的形态官能成像显示，星形胶质细胞积极参与感官刺激。

1.介绍

双光子激光扫描显微技术是高分辨率的主要技术之一体内中枢神经系统成像[1-4.]．通过这种方法，已经揭示了生理和病理条件下神经胶质动态相互作用的新细节[5.-9.]．这产生了大量的知识，导致了我们对神经胶质网络可塑性的理解的全面修订。

星形胶质细胞已被证明在调节中枢神经系统神经胶质网络中发挥关键作用[10.-16.形成一个结构上相互联系的网络，在功能上与神经元相关。体外有证据支持星形细胞在神经元活动后的活化，但尚未确定它们是否对生理活动有反应体内［17.]．

Ca²⁺振荡自发发生或响应机械或电刺激[18.那19.];几个数据已经分析了星形胶合剂CA²⁺感官处理期间和之后的行为。皮质星形胶质细胞已被广泛调查[20.那21.]但是工具允许在脊髓中成像胶质细胞体内只是兴起[22.]．

在这项工作中，我们已经表演了双光子体内星形胶质性CA的功能性成像²⁺脊髓动力学。在脊髓中加压注射荧光染料特别标记的星形胶质细胞(红色荧光sulforhodamine 101-SR101)，并允许监测胞浆钙²⁺(Oregon-Green BAPTA-1-OGB)在休息和右后爪刺激后的动力学。我们发现Ca²⁺与休息相比，星形胶质细胞的水平显着增加。总之，我们直接成像脊髓的活性星形胶质细胞，表明星形胶质细胞积极参与感官刺激。

2。材料和方法

2．1.动物

成人（25-35克;查尔斯河，意大利）雄性C57BL6-J小鼠（)使用。小鼠维持在12/12小时的光/暗周期，并允许自由获取食物和水。动物护理符合意大利(D. L. 116/92)和EC (O. J. of E. C. L358/1 18/12/86)关于实验动物护理的规定。所有的努力都是为了减少动物数量。

２.２.脊髓窗手术

老鼠 （)，用氯水合替他明40 mg / kg、氧拉嗪15 mg / kg、乙酰丙嗪2.5 mg / kg，在0.9% NaCl溶液中肌注麻醉。然后用吸入七氟醚(2%含1 L/min氧气)维持麻醉。我们使用Narishige设备(STS-A, Narishige, UK)最小化鼠标的呼吸和心跳运动。切开背部皮肤，轻轻展开肌肉，露出胸椎。我们制作了一个定制的脊柱板，将其固定在椎体表面，在暴露的椎体周围创造一个井。切除椎板，暴露腰椎脊髓，留下完整的硬脑膜[23.那24.] （数字1（C））。中线静脉通过椎体窗口可见。然后我们用一滴人工脑脊髓（ACSF）填充脊柱良好。

２.３.Ca的压力注入²⁺- 敏感的AM染料和SR101

用加压微管注射(多细胞丸加载)加载脊髓星形胶质细胞。体内与Ca²⁺-敏感染料在多光子显微镜下目测。针尖直径为2-3的补片吸管μM插入脊髓150-300处μ来自表面的m。将OGB溶解在含有20％Hloronic酸（F-127，Invitrogen）的二甲基亚砜（DMSO）中，并在人工脑脊液（ACSF）中混合至终浓度为0.8-1.0mm。一卷（10-15 μl）将含有染料的ACSF注入在物质表面下方的脊髓的背角中。露出的脊髓也被装载有星形胶质细胞特异性指标SR101（Invitrogen，意大利）。使用AM-System Picospritzer 2000，在5-10psi下，从移液管中喷射ogb和sr-101的压力 - 喷射60-90秒。注射后，我们允许一小时加载。标签血管系统，德克萨斯罗丹明（200 μ将20 mg/mL溶液L)突出血浆，注射至尾静脉。

２.４.后爪刺激

将两根皮下铜针插入右后爪。刺激呈现由模数转换器单元（UK仪器，英国）控制（脉冲持续时间：10 ms;幅度：1 mA;瞳孔间隔：167 ms / 6 Hz）。在持续10 s的两个刺激之间允许三个30次静止周期（R1，R2，R3）（S1，S2）[25.]．

2．5．在活的有机体内小鼠脊髓成像:图像处理和量化

在整个成像会议（从手术开始到成像结束时约3-4小时），使用加热垫在37℃下在37℃下将麻醉的小鼠保持在吸入的七氟醚。使用定制的双光子激光扫描显微镜进行脊髓的两光晶成像（图1(a))。它由激光、可变衰减滤波器、扫描单元、直立显微镜和基于光电倍增管(PMT-)的检测系统组成。激光是可调谐的钛:蓝宝石(变色龙XR;相干)，波长范围为690 nm ~ 1040 nm，功率约2.7 W，频率76 MHz。调谐到810 nm有效地激发SR101和OGB。为了最小化光损伤，激发激光强度保持在一个最小值，以获得足够的信噪比(样品的15-20 mW)。垂直显微镜为Olympus BX51WI，配备水浸物镜(Olympus) XLUMPlanFL 20XW, 0.95 NA。扫描单元是改进的奥林巴斯FV300。荧光检测系统有两个通道，允许同时检测两个荧光信号。为了有效地采集SR101和OGB信号，我们的系统在pmt前安装了570 nm的二色镜和带通障滤光片(OGB通道为505-550 nm, SR101通道为585-675 nm)。 Movement artifacts associated with the mouse heartbeat were overcome by triggering image acquisition from the mouse heartbeat (Powerlab, AD Instruments). The brightness and contrast of the acquired images were adjusted. To reduce the background noise associated with photon or photomultiplier tube noise, a median filter (radius, 1 pixel) was applied to each image. ImageJ free software was used (version 1.42, NIH, USA).

2.6。统计分析

荧光信号可以通过ImageJ软件测量每个星形胶质细胞的细胞体的平均像素强度进行量化。将电影导入ImageJ，分析脊髓星形胶质细胞中的荧光痕迹，并以相对百分比变化表示(）通过将数据导出到Sigma Plot 10.0程序（SPSS，德国）后减法。我们假设OGB-荧光强度与细胞内Ca直接相关²⁺水平(26.]．数据表示为平均值±SEM。多组比较采用事后方差分析测试。一个值≤0.05被认为是统计学意义。

结果

３．１．在活的有机体内腰椎背圈SR101正星形胶质细胞的成像

我们使用后脊椎静脉，作为起点（图1（c）），我们遵循脊髓血管（图4.)来定位脊髓的背角。然后，我们成像后索区域(图1(b): 200-300的深度μM足以包括脊髓背角的浅表板。在脊髓加压注射红色荧光染料SR101导致星形胶质细胞快速染色(图2（a））下到300 μ在小皮子表面下方。所有SR101标记的细胞显示星形胶质细胞的形态特征。

３．２．Ca²⁺右后爪刺激后及休息时脊髓星形胶质细胞水平

Ca²⁺OGB标记的脊柱星形胶质细胞的振动（图2（b））在休息期间和根据先前描述的刺激方案进行的右后爪电刺激后成像。

在静止状态下，正常麻醉小鼠星形胶质细胞表现为短暂的钙²⁺在感觉刺激期间，振动和这种模式没有显着改变。相比之下，正确的后爪刺激触发了星形胶质细胞的增加²⁺水平()(数据3 (b)和3 (c)）与休息值相比（)(数据3（a）-3 (c))．

4.讨论

本研究提供的证据表明，活体脊髓星形胶质细胞对外周感觉刺激的反应与星形胶质细胞钙的增加有关²⁺的水平。延时体内双光子成像活体脊髓星形胶质细胞，通过椎管内加压注射右旋糖酐、SR101和OGB，可以对脊髓微血管和脊髓星形胶质细胞进行形态学分析，也可以对Ca进行功能分析²⁺的行为。

几十年来，细胞培养和体外分析极大地支持CNS的研究，允许表征神经元和神经胶质细胞的形态功能性质。虽然这些研究无疑是为了更好地了解神经元素生物学，但他们没有指出血管互动的血管且细胞动态变化的相关性和活性CNS的性质。沿着这个观点，发展体内成像技术促进了神经胶质网络突触可塑性和功能特性的研究。此外，技术设施(成像、外科手术和稳定技术)的广泛应用也得到了改善体内图像采集确保了原始数据的稳定性和可重复性。

正如最近报道的[23.]，脊柱稳定装置的使用减少了呼吸运动造成的伪影，提高了脊柱的稳定性，并允许直接采集数据。因此，该技术可以对脊髓更深层次的神经胶质网络进行详细研究，从而提供细胞结构、细胞间相互作用及其随时间变化的功能数据。

SR101特异性标记的脊椎星罗基亚允许分析星形胶质细胞的密度和分布体内及其在神经变性疾病中的作用[27.那28.]或后脊髓或神经损伤[11.那12.那29.那30.]．将其他脊髓成分，如血管和神经元进行联合标记，使胶质血管可塑性和神经胶质网络的形态学和功能研究成为可能[31]．星形胶质末梢和突触结构的延时成像可能有助于阐明它们对三部突触形成和可塑性的贡献[32]．

我们向功能性标签星形胶质细胞提出了一种模型体内允许在活脊髓中的形态官能成像。OGB染色与SR101组合，使星形胶质细胞的功能研究体内以及它们在脊髓三部突触中的作用。

正如我们最近所证明的[27.那29.那31胶质反应和随之而来的自适应突触可塑性导致非细胞自治疾病的概念，影响星形胶质细胞的表型变化在发作和进展中发挥关键作用。因此，可重复和稳定技术的可用性有助于这种强大的工具在脊髓疾病的研究中的广泛应用体内．

缩写

SR101:	Sulforhodamine 101
OGB：	俄勒冈 - 绿色Bapta-1
中枢神经系统:	中枢神经系统。

致谢

这项工作得到了坎帕尼亚区(l.r. N. 5 Bando, 2003)、意大利研究和大学部长(PRIN2007, M. Papa)、坎帕尼亚区(Prog。Spec art 12 E. F. 2000给M. Papa)和CNR (neurobiotecologie 2003给M. Papa)。

参考文献

1. a . Holtmaat, T. Bonhoeffer, D. K. Chow等，“通过慢性颅窗对小鼠新皮层进行长期高分辨率成像”，自然的协议，第4卷，第4期。8，页1128-1144,2009。视图:出版商的网站|谷歌学术
2. “皮质星形细胞网络的钙动力学体内”,公共科学图书馆生物学，第2卷，第2期第4条e96, 2004年。视图:出版商的网站|谷歌学术
3. W. R. Zipfel, R. M. Williams，和W. W. Webb，《非线性魔法:生物科学中的多光子显微镜》，自然生物技术，卷。21，不。11，PP。1369-1377,2003。视图:出版商的网站|谷歌学术
4. F. Helmchen和J. Waters (Ca²⁺哺乳动物大脑的成像体内”,欧洲药理学杂志，第447卷，第2期。2-3，页119 - 129,2002。视图:出版商的网站|谷歌学术
5. W. Mittmann, D. J. Wallace, U. Czubayko等，“L5体感神经元诱发活动的双光子钙成像体内”,自然神经科学第14卷第2期8, pp. 1089-1093, 2011。视图:出版商的网站|谷歌学术
6. X. Wang，N. Lou，Q. Xu等，“星形胶合CA²⁺由感觉刺激引起的信号体内”,自然神经科学，卷。9，没有。6，PP。816-823,2006。视图:出版商的网站|谷歌学术
7. a . Nimmerjahn, F. Kirchhoff, J. N. Kerr, and F. Helmchen，“Sulforhodamine 101作为新皮层星形胶质细胞的特定标记体内”,Nat方法，卷。1，不。1，pp。31-37,2004。视图:谷歌学术
8. J. T. Trachtenberg, B. E. Chen, G. W. Knott et al，“长期的体内成人皮层中经验依赖型突触可塑性的成像自然，卷。420，没有。6917，PP。788-794,2002。视图:出版商的网站|谷歌学术
9. K. Svoboda, W. Denk, D. Kleinfeld，和D. W. Tank， "在活的有机体内Neocortical金字塔神经元的树突钙动力学，“自然(2002年第1期)6、第1 - 2页，1997。视图:出版商的网站|谷歌学术
10. G. Cirillo, N. Maggio, M. R. Bianco, C. Vollono, S. Sellitti，和M. Papa，“区别性行为评估揭示了3-硝基丙酸亚慢性治疗大鼠基底神经节中显著的反应性星状细胞增多和早期分子相关。”国际神经化学，卷。56，没有。1，pp。152-160，2010。视图:出版商的网站|谷歌学术
11. G. Cirillo, C. Cavaliere, M. R. Bianco等，“在神经性疼痛大鼠模型中，鞘内给药NGF可减少反应性星形细胞增多并改变神经营养因子受体表达模式。”细胞和分子神经生物学，第30卷，第2期1，页51-62,2010。视图:出版商的网站|谷歌学术
12. A. M. Colangelo, M. R. Bianco, L. Vitagliano等，“一种新的神经生长因子-模拟肽对大鼠神经性疼痛有活性，”神经科学杂志》上，卷。28，不。11，PP。2698-2709,2008。视图:出版商的网站|谷歌学术
13. T. Fellin和G. Carmignoto，“大脑中的神经元对星形胶质细胞信号代表了一个独特的多功能单元，”生理学杂志，第559卷，第5期。1, 2004年。视图:出版商的网站|谷歌学术
14. M. Nedergaard，B.赎金和S. A. Goldman，“星形胶质细胞的新作用：重新定义大脑的功能架构，”神经科学的趋势第26卷第2期10，页523-530,2003。视图:出版商的网站|谷歌学术
15. R. D. Fields和B. Stevens-Graham，“神经科学：新的洞察力进入Neuron-Glia Communication”，科学第298卷2002年，第556-562页。视图:出版商的网站|谷歌学术
16. P. G. Haydon，《胶质细胞:倾听和与突触对话》自然评论神经科学，第2卷，第2期3，pp。185-193,2001。视图:出版商的网站|谷歌学术
17. A. Volterra和J. Meldolesi，“星形胶质细胞，从脑胶到沟通元素:革命仍在继续，”自然评论神经科学，第6卷，第2期8，页626 - 640,2005。视图:出版商的网站|谷歌学术
18. I. R. WILESHIP，N.PLAA和T.H.Murphy，“快速的星形胶质细胞钙信号与神经元活动相关，并且血流动力学反应的发作体内”,神经科学杂志》上，卷。27，不。23，pp。6268-6272，2007。视图:出版商的网站|谷歌学术
19. A. C. Charles, J. E. Merrill, E. R. Dirksen, M. J. Sanderson，“胶质细胞的细胞间信号:机械刺激和谷氨酸反应中的钙波和振荡”神经元，第6卷，第2期6、第983-992页，1991。视图:出版商的网站|谷歌学术
20. C. Stosiek，O.Garaschuk，K. Holthoff和A. Konnerth，“在活的有机体内神经元网络的两光核钙成像，“美国国家科学院学报号，第100卷。12，第7319-7324页，2003。视图:出版商的网站|谷歌学术
21. B. Lendvai，E. A. Stern，B. Chen和K. Svoboda，“在发展鼠桶皮层中的树突刺的经验依赖性可塑性体内”,自然，第404卷，第5期。第2页，第2 - 3页，2000。视图:出版商的网站|谷歌学术
22. J.V.Kim，N.江，C. E. Tadokoro等人，“完整脊髓和脑皮质的双光子激光扫描显微镜成像显示了CXCR6和神经引发在皮质损伤部位的免疫细胞浸润中的要求”免疫学方法杂志第352期1-2页，89 - 100,2010。视图:出版商的网站|谷歌学术
23. D. Davalos, J. K. Lee, W. B. Smith等人，“稳定体内使用双光子显微镜致密地填充的小鼠脊髓，轴突和血管的成像，“神经科学方法杂志第169卷第1期1，页1 - 7,2008。视图:出版商的网站|谷歌学术
24. B. Zheng, C. Ho, S. Li, H. Keirstead, O. Steward, M. Tessier-Lavigne，“nogo缺陷小鼠缺乏增强的脊髓再生”，神经元第38卷第2期2，页213-224,2003。视图:出版商的网站|谷歌学术
25. B. G. Sanganahalli, P. Herman, H. Blumenfeld，和F. Hyder，“事件相关范式中的氧化神经能量学”，神经科学杂志》上，卷。29，不。6，PP。1707-1718,2009。视图:出版商的网站|谷歌学术
26. K.V.Kuchibhotla，C.R. Lattarulo，B.T. Hyman和B.J.Bacskai，“阿尔茨海默氏症小鼠的星形胶质细胞中的同步多动和细胞细胞钙。”科学号，第323卷。2009年。视图:出版商的网站|谷歌学术
27. A. M. Colangelo, G. Cirillo, M. L. Lavitrano, L. Alberghina，和M. Papa，“通过新的生物技术策略靶向反应性星形胶质病变”，生物技术的进步，第30卷，第2期1，pp。261-271,2012。视图:出版商的网站|谷歌学术
28. R. Giovannoni, N. Maggio, M. R. Bianco等，“反应性星形细胞增多和胶质谷氨酸转运蛋白聚集是1型脊髓小脑共济失调转基因小鼠模型的早期变化。”神经元神经胶细胞生物学，第3卷，第2期。4，页335-351,2007。视图:出版商的网站|谷歌学术
29. G. Cirillo, a . M. Colangelo, M. R. Bianco等，“神经生长因子(NGF)样肽BB14在周围神经损伤大鼠模型中显示可有效减少反应性星形胶质增生和恢复突触稳态，”生物技术的进步，第30卷，第2期1，页223-232,2012。视图:出版商的网站|谷歌学术
30. C.Cavaliere，G. Cirillo，M. R. Bianco等，“渗透中改变了小鼠神经性疼痛模型中脊髓胶质氨基酸转运蛋白的表达和摄取，”神经元神经胶细胞生物学，第3卷，第2期。2，页141-153,2007。视图:出版商的网站|谷歌学术
31. G. Cirillo, M. R. Bianco, A. M. Colangelo等，“神经生长因子可恢复反应性星形细胞增多引起的突触稳态扰动。”疾病神经生物学号，第41卷。3, pp. 630-639, 2011。视图:出版商的网站|谷歌学术
32. E. M. Ullian，S.K. Sapperstein，K. S. Christopherson和B. A. Barres，“Glia的控制突触号”科学，卷。291，没有。5504，pp。657-661,2001。视图:出版商的网站|谷歌学术

版权

版权所有©2012 Giovanni Cirillo等。这是分布下的开放式访问文章知识共享署名许可协议，允许在任何媒介上不受限制地使用、传播和复制，但必须正确引用原作。