成人(25 - 35 g;查尔斯河、意大利)男性C57BL6-J老鼠( n = 10 )使用。老鼠保持在12/12 h光/暗周期,允许自由获取食物和水。动物保健是符合意大利(d . l . 116/92)和电子商务(e . o . j . c . L358/1 18/12/86)规定的实验动物。所有的努力都是减少动物数量。

老鼠( n = 10 与40毫克)麻醉肌内chlorohydrate tiletamine, 15毫克甲苯噻嗪,每公斤2.5毫克乙酰丙嗪在0.9%氯化钠溶液。麻醉是维护使用inhalatory七氟醚1 L / min氧(2%)。我们最小的呼吸和心跳运动鼠标使用Narishige设备(英国Narishige STS-A)。皮肤的切入,轻轻舒展肌肉暴露胸椎骨。我们生产一个定制的脊柱椎表面粘合板,创建一个在暴露的椎骨。椎椎板切除,我们暴露了腰椎脊髓,留下完整的硬脑膜( 23, 24)(图 1(c))。中线静脉通过椎窗口是可见的。然后我们充满了脊髓与一滴人工脑脊髓液(ACSF)。

脊髓星形胶质细胞通过加压注射微量吸液管加载(多单元的丸加载) 在活的有机体内与Ca^{2 +}敏感染料多光子显微镜下的视觉指导。一个补丁吸管齿顶圆直径的2 - 3 μm是插入到脊髓的深度150 - 300 μ从表面。OGB是溶解在二甲亚砜(DMSO)含20%普朗尼克酸(f - 127,英杰公司)和混合在人工脑脊液(ACSF)的最终浓度0.8 - -1.0毫米。一个卷(10 - 15 μL)含有染料的ACSF注入脊髓背角的下面软膜的表面。暴露脊髓也装满了astrocyte-specific指示器SR101(表达载体、意大利)。OGB和sr - 101 pressure-ejected吸管在5 - 10 PSI的60 - 90秒使用AM-system Picospritzer 2000。注射后,我们允许加载一个小时。标签脉管系统,Dextran-Rhodamine (200 μL 20毫克/毫升的解决方案),突出了血浆,注入到尾静脉。

两个皮下铜针插入正确的后爪。刺激呈现由模拟-数字转换器控制单元(广告工具,英国)(脉冲持续时间:10 ms;振幅:1马;脉冲间隔的时间间隔:167 ms / 6赫兹)。三个30年代休息时间(R1、R2、R3)被允许两个刺激之间持续10年代(S1, S2) [ 25]。

在整个成像会话(约3 - 4小时从一开始的手术结束成像),麻醉老鼠与七氟醚在37°C inhalatory维护使用加热垫。脊髓的双光子成像进行了使用一个定制的双光子激光扫描显微镜(图 1(a))。它由激光器、可变衰减器过滤器,扫描单元,一个正直的显微镜,基于光电倍增管(PMT)的检测系统。激光是一种可协调的钛:蓝宝石(变色龙XR;相干),其波长范围从690纳米到1040纳米,功率2.7 W,频率76 MHz。这是调整在有效地激发SR101和OGB 810海里。最小化photodamage,激发激光强度保持在足够的最小信噪比(15 - 20兆瓦的示例)。显微镜是一个正直的奥林巴斯BX51WI并配有水浸物镜(奥林巴斯)XLUMPlanFL 20 xw 0.95 NA。奥林巴斯FV300扫描单元是一个修改。荧光检测系统有两个渠道,允许两个荧光信号的同步检测。为了有效地收集SR101和OGB信号,我们的系统配有570海里二向色镜和带通障碍过滤器放置在前面的pmt (505 - 550 nm OGB频道和585 - 675 nm SR101通道)。 Movement artifacts associated with the mouse heartbeat were overcome by triggering image acquisition from the mouse heartbeat (Powerlab, AD Instruments). The brightness and contrast of the acquired images were adjusted. To reduce the background noise associated with photon or photomultiplier tube noise, a median filter (radius, 1 pixel) was applied to each image. ImageJ free software was used (version 1.42, NIH, USA).

荧光信号可以被测量的平均像素强度量化每个星形胶质细胞的胞体使用ImageJ软件。电影导入ImageJ,荧光跟踪分析了脊髓星形胶质细胞和表示为相对百分比变化( Δ F / F 0 )背景减法后导出数据10.0σ阴谋计划(SPSS,德国)。我们假设OGB-fluorescence强度 ( Δ F / F 0 ) 细胞内钙直接相关^{2 +}水平( 26]。数据表示为均值±SEM。多组比较都是使用一个事后的方差分析 t 测试。一个 P 值≤0.05被认为是具有统计学意义。

我们使用后脊髓静脉,(图作为起点 1(c)),我们遵循脊髓血管(图 4)对脊髓背角的进行定位。然后,我们成像后细绳(图的面积 1(b)): 200 - 300 μm足以包括脊髓背角的表面薄层。加压注入脊髓的红色荧光染料SR101导致星形胶质细胞(图的快速染色 2(一个))到300 μ软膜的表面以下。所有SR101-labeled细胞显示星形胶质细胞的形态学特征。

Ca^{2 +}振荡OGB-labeled脊髓星形胶质细胞(图 2 (b))成像在休息期间和之后的正确的后爪根据先前描述电刺激刺激协议。

在麻醉老鼠休息,在正常情况下,星形胶质细胞表现出短暂的Ca^{2 +}振荡,这种模式没有显著改变在感官刺激。相比之下,正确的后爪刺激触发增加病患的Ca^{2 +}水平( 0.52 ± 0.03 )(数据 3 (b)和 3 (c))休息相比值( 0.38 ± 0.02 )(数据 3(一个)- - - - - - 3 (c))。