识别和描述的两个小说RNA编辑网站grin1b成绩单的胚胎鲐鱼类

文摘

发现RNA编辑网站在生物模型提供了一个洞察他们的改编除了寻找潜在的神经活动的监管和网站集成的后生动物模型的基础上编辑与各种各样的应用程序,包括潜在的临床治疗神经失调。斑马鱼,鲐鱼类,是一个重要的脊椎动物模型系统。我们专注于grin1b斑马鱼的基因由于其重要的功能作为谷氨酸受体在神经组织。使用比较序列的方法,我们位于内RNA编辑事件的可能性grin1b成绩单。令人惊讶的是,序列分析还显示一个新的编辑网站并没有预测的比较方法。我们在这里报告两个小说RNA编辑事件的发现grin1b斑马鱼胚胎的成绩单。这些编辑事件的频率,并在它们的位置grin1b成绩单也进行了描述。

1。介绍

Adenosine-to-inosine RNA编辑主要发生在组件的神经功能和突触传递;腺苷在目标文本转换为肌苷在翻译和表现为被解释为鸟嘌呤核苷序列色谱/ G好坏参半的信号。在斑马鱼已报告的编辑数家网站(鲐鱼类),包括一个位于GRIA2基因(1]。有几个门冬氨酸受体在斑马鱼基因组中编码(2),我们发现编辑在这个群体的一员,grin1b(NMDAR1.2)。

斑马鱼Grin1b是ionotropic NMDA谷氨酸受体位于5号染色体。成熟的编码序列grin1b记录是2814个核苷酸。翻译这个成熟的信使rna产生产品由937个氨基酸组成的蛋白质,作为突触后谷氨酸受体和ligand-gated离子通道。

门冬氨酸受体在神经可塑性和长期势差是重要的;兴奋过度的受体可以导致神经元死亡。理解的因素,因此重要的是影响这些受体的调节治疗各种人类的神经系统疾病。

2。材料

2.1。RNA隔离和rt - pcr

从野生型RNA提取鲐鱼类EK应变胚胎60 - 72小时使用三试剂协议(MRC,辛辛那提,哦);编辑网站注册一个命名的“E”指定强调使用胚胎组织。按照机构IACUC鲐研究做了指导方针。

使用执行反转录表达载体MMLV-RT和相关组件(CA)卡尔斯巴德,影射与polythymidylate polyT底漆。随后PCR进行使用Promega GoTaq(麦迪逊,WI)和特定的引物集(见表1和2)从IDT(珊瑚镇,IA)。DNA基因组控制的孤立使用试剂盒(瓦伦西亚,CA) DNA迷你程序相同的组织样本集用于RNA。

2.2。测序和限制消化

凝胶电泳是1.2%,凝胶萃取按试剂盒(瓦伦西亚,CA)凝胶萃取设备的指令。

测序服务提供的SeqWright(费舍尔,休斯顿,德克萨斯州)。限制消化与内进行(伊普斯维奇,MA)的酶MluI和BstNI内后,建议关于温度和加入牛血清白蛋白(BSA)。

基于溴化乙锭荧光强度值是使用柯达凝胶逻辑(罗彻斯特,纽约)软件和调整中描述的文本。

3所示。结果

一个爆炸搜索进行使用grin1b编码序列(CDS)与NCBI数据库;实质性的区域序列的身份与鲐只发现序列。鲐grin1bcd然后对EST序列相比,过滤虽然几支安打我们选择序列包含几个g不匹配(图比较1)。这些g不匹配被解释为潜在A-to-I RNA编辑网站。

感兴趣的序列中选择这个研究RNA: RNA策划斑马鱼的比较grin1b成绩单,许多从眼睛的前部分和可能包括视网膜神经组织(图1)(参见[2]:NR1.2表达式模式)。结果,序列比较一致彼此完美除了5 g不匹配的职位,以下简称E1, E2, E3, E4, E5(图1,部分2)。这个预测结果是鼓励和促使我们继续我们的研究使用这个爆炸搜索发现的网站。

我们映射编辑网站E1和E2grin1b外显子,外显子16 E3, E4, E5外显子17(图1 (b)、表1)(按zfin.org, ensembl.org)。如图1所有五个候选人,编辑网站位于相邻的外显子区域内468核苷酸的成熟grin1b信使rna。

这样就能够对设计寡核苷酸旨在放大的区域grin1b记录包含潜在的编辑网站使用Accelrys DS基因软件。引物对(图2)被选为后续rt - pcr反应。引物组合Forward3 / Reverse3 (F3 / R3)产生一个强大的乐队在311个核苷酸(图3);这个产品代表一个地区包括所有五个假定的编辑事件(图3),为进一步提取序列的分析预测RNA编辑网站内grin1b成绩单。

测序后,提取的产品没有显示出色谱/ G混合信号的证据网站E1, E2、E3和E4,,然而,预测网站E5显示双峰值对应于a / G混合信号(图4(一))。令人惊讶的是,在进一步分析的色谱图序列,我们可以发现另一个名叫E6 / G混合信号,我们(基于预测的时间表,而不是记录位置)(图4 (b)),尽管E6并未显示为一个g不匹配在最初的爆炸的比较。这个结果说明了比较方法在编辑网站预测的局限性。我们在初始屏幕解释假阳性罕见的单核苷酸多态性或聚合酶克隆记录中的错误。

我们继续复制结果进行两个单独的,额外的rt - pcr反应(总共3个独立的rt - pcr反应)在同等条件下验证这些编辑网站的出现。正如所料,这些产生强劲的乐队规模预测和确认/ G混合信号对应于E5和E6新的反应(数据未显示)。

下一步我们的调查旨在确认这些信号编辑网站,而不是单核苷酸多态性grin1b斑马鱼的成绩单。为此我们放大的基因组区域grin1b在该地区的候选人E5和E6。因为单核苷酸多态性(snp)常常被误解为RNA编辑事件,有必要放大和基因组序列grin1b地区来区分这些解释混合色谱信号;阿达尔月编辑DNA酶不编辑。因此,我们设计了两个新的后续斑马鱼套引物PCR反应使用基因组DNA;这些引物包括从内含子区域托架相对应的区域E5 E6,另外,在rt - pcr和不产生产品使用时(数据没有显示)。我们进行了单独的PCR反应E5和E6。图5显示了这些PCR反应的结果,两个截然不同的乐队是可见的约200个碱基对(bp)和223个基点E5 E6,分别;测序后,只有腺苷信号(没有检测到鸟苷背景之上,后来证实了限制摘要)也观察到站点(图5)。

我们选择使用限制消化和微RNA编辑量化水平。编辑发生在人口和记录可能导致一个限制性内切酶站点的创建或销毁。未经编辑和编辑文本形式分析了使用新英格兰生物学实验室(内)和Accelrys DS基因软件,选择和限制性内切酶可以区分编辑和缺乏编辑记录在网站5或6,分别。MluI(一个/ CGCGT)被选为网站5日BstNI(CC / WGG)被选为网站6。编辑在网站5创建一个MluI限制性内切酶的网站(ACGC一个T /公司治理文化GT),编辑在网站6创建一个BstNI限制站点(CCA一个CC / GG5 G),没有在网站编辑预防MluI限制,因此做了一个全身311个基点产品;编辑在网站5生产2乐队(78个基点,233个基点)。没有编辑网站6生产3乐队之后BstNI消化(22日英国石油公司,81个基点,208个基点;208个基点乐队是用作缺乏诊断编辑),而编辑紧随其后BstNI消化生产4乐队(22日英国石油公司、69个基点,81个基点,139个基点;69个基点和139个基点乐队被视为诊断存在的编辑)。不完整的编辑在网站表现为全身的每个限制和减少产品。

三个完全相同的启动(F3 / R3;pcr扩增子311个基点)从每个三个独立的低聚糖dT-primed RTs总放大(9)被用于这些分析:每组的三个反应,一个是用于MluI消化,一个用于BstNI,一个未经处理的控制。产品从琼脂糖凝胶中提取和纯化使用试剂盒凝胶萃取设备和协议。通过凝胶电泳确定提取的乐队,和25 uL限制消化按内进行推荐。分析了限制消化后使用柯达凝胶电泳凝胶成像站和柯达软件逻辑。诊断的强度与毛边的乐队(也比不受限制的控制乐队)进行了分析和修正带大小(按[3])。结果近似频率编辑确认最初预测的色谱图(图序列4色谱信号)和集成(数据没有显示)。编辑在网站5 26.98%的标准偏差为4.10%,和编辑在网站6 21.36%的标准差为4.47%(图6)。

4所示。讨论

编辑的位置发生在阅读框3基因的密码子的位置,不会导致氨基酸替换。这些编辑的位置表明他们不会导致记录重新编码。这相当复杂的分析以监管的目的在这些位点;然而,一个有趣的可能性是nonrecoding编辑影响等额外因素的绑定为亚微rna或定位信号。搜索现有的微rna数据库如miRBase (http://www.mirbase.org/)d .鱼类microrna针对E5和E6地区显示,没有已知的斑马鱼microrna结合在这个区域(100基地内5′E6和大于100基地3′E5),虽然我们建议附加身份不明的小说microrna的存在(或其他小RNA物种)可能会有影响。讨论这种可能性的数量non-recoding编辑莫尔斯和他的同事(4]。

有几种途径的未来的研究阐明non-recoding编辑的功能在这些位置。这些地区的二级结构预测使用mfold程序由朱克(5在考虑未来的结构确认(见[3])。分别与这些变化可以构造(或协调)与质粒mutageneses影响编辑化验在细胞培养和转基因动物。考试的结合亲和力斑马鱼与编辑和阿达尔月未经审查的构造可以追求,以及搜索不同的microrna的绑定由这些编辑的变化引起的。这个编辑也可能是巧合,而不是通过模仿功能,编辑酶底物的结构。

的grin1b人类直接同源是GRIN1门冬氨酸受体基因。一些突变GRIN1与严重的精神发育迟滞。当测试非洲爪蟾蜍卵母细胞系统,增加钙条目发生一个突变形式(6),这项研究的作者指出潜在的致病性合成钙流入增加。这样的结果突出的临床价值和人类相关性的研究grin1b在脊椎动物模型,如鲐。

RNA,它的许多形式,在细胞过程中起着举足轻重的作用。RNA编辑和拼接的过程随着微RNA, RNA干扰,核内小RNA核糖酶等等,当然指向RNA作为基本的指挥和协调器的遗传指令。尽管RNA编辑已广泛观察到在许多生物模型,找到一个特定的编辑网站仍然是一个艰巨的任务。我们感兴趣的是发现新的编辑网站以及对这些网站的监管,在各种各样的生物模型。生物分子科学包含教员工作的部门协作与各种实验系统,和宫的记录和他的同事们发现了RNA编辑的gria2斑马鱼的成绩单1)是一个提示和线索什么额外目标记录的编辑可能存在鲐的基因家族。我们能够证明存在两个新的RNA编辑的网站grin1b斑马鱼的基因转录。我们也叫注意网站E6是检测不只有通过直接测序和比较方法;许多编辑的网站,特别是那些独特的单一物种,可能仍然被发现。此外,通过描述编辑的频率和位置我们希望为当前的RNA编辑知识的目的,参与这个有趣的分子过程的完整说明。

承认

作者希望感谢贝琪Dobbs-McAuliffe博士的慷慨的捐赠d .鱼类胚胎。

引用

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