文摘

缺血性中风是一种中枢神经疾病的特点是高发病率、高死亡率和高残疾。炎症和自噬发挥重要作用在脑缺血/再灌注损伤(CI / R)。本研究描述TLR4活化的影响在CI / R损伤炎症和自噬。一个老鼠体内CI / R损伤模型和体外缺氧/复氧(H / R) SH-SY5Y细胞模型建立。脑梗塞大小、神经功能、细胞凋亡、炎症介质的水平和基因表达测定。梗死、神经功能障碍和神经细胞凋亡诱导在CI / R老鼠或H / R-induced细胞。NLRP3的表达水平,TLR4、LC3 TNF -α,interleukin-1 (il - 1)、白细胞介素- 6 (il - 6)和interleukin-18(地震)明显增加I / R老鼠或H / R-induced细胞,而TLR4击倒显著抑制NLRP3, TLR4 LC3, TNF -α,interleukin-1/6/18 (IL-1/6/18) H / R-induced细胞以及细胞凋亡。这些数据表明TLR4 upregulation诱导CI / R损伤通过刺激NLRP3 inflammasome和自噬。因此,TLR4是一个潜在的治疗目标改善缺血性中风的管理。

1。介绍

缺血性中风(是)是临床常见的疾病,具有高发病率、高死亡率和高残疾。它对社会带来沉重的经济和情感上的负担1]。缺血是一种体内的疾病,心脏衰竭的结果和大脑血管闭塞。它的发生随着年龄的增加,加剧了久坐不动的生活方式。循环功能障碍导致葡萄糖和氧气不足都是缺血性中风的主要原因(2,3)提供的血液溶栓或血栓切除术的主要治疗方案是反转下跌的葡萄糖和氧合。然而,血流量恢复将迅速导致脑缺血/再灌注(CI / R)受伤4]。最近,研究已经证明,过程中CI / R损伤,侮辱了大脑组织经历严重的氧化应激,会引起炎症反应,自噬,水肿[2,3,5]。在这些反应中,炎症和自噬得到了广泛的关注,但细胞机制尚不清楚,调解这些反应CI / R损伤。因此,改善缺血性中风的治疗管理有待澄清的机制,调解CI / R (6]。

炎症和自噬在调节神经赤字的关键球员,开发CI / R事故之后(6]。在缺血再灌注过程中,炎症发展脑组织由于增加浸润的炎症细胞如巨噬细胞和小胶质细胞,释放促炎的因素很多,如肿瘤坏死因子-α和interleukin-1β/ 18 (il - 1β/ 18),最终导致脑组织损伤(7- - - - - -9]。这种炎症过程通过的形成和活化介导NLRP3 inflammasomes在MCAO(大脑中动脉闭塞)小鼠模型9]。证据il - 1的激活源于NLRP3-induced上涨β释放(9]。此外,结果表明,介质控制之间存在串扰NLRP3 inflammasome形成和自噬在CI / R损伤(6]。自噬的激活与NLRP3共存inflammasome诱导神经元凋亡或死亡的不同型号的CI / R损伤(全球缺血、缺血或缺氧缺血)。然而,背后的分子机制尚不清楚这些病态反应,他们需要澄清。

最近的研究表明,toll样受体4 (TLR4)在应激激活神经细胞缺氧诱发炎症反应。TLR4的参与是显而易见的,因为他们接受upregulation在缺血性侮辱,而这种反应是抑制TLR4-deficient /基因敲除小鼠(10,11]。这些效应表明,CI / R创伤性TLR4 upregulation是一个无意的有害副作用等压力。然而,目前尚不清楚是否TLR4的表达和激活直接导致的副作用Cl / R-induced损伤通过移植和刺激NLRP3 inflammasomes和自噬在大脑组织。

我们这里显示,低氧诱导TLR4 upregulation和激活在再灌注导致中介通过NLRP3 inflammasomes炎症和自噬增加大脑神经组织体内和体外。这些结果提供了新颖的见解缺血性中风的发病机理和治疗。

2。材料和方法

2.1。动物实验

SD雄性大鼠( ;8周大,重量250克)是由湖南SJA提供实验动物有限公司有限公司老鼠维持在25°C,湿度65%的循环12 h光/ 12 h黑暗。这个调查是伦理委员会批准湖南师范大学的附属医院长沙,并执行实验符合国家卫生研究院(NIH)的指导方针。

创建一个SD鼠CI / R模型方法建立了后毛等。12)或左et al。(4]。老鼠被轻度麻醉与戊巴比妥钠腹腔内注射。老鼠的大脑前动脉的闭塞是使用尼龙单丝执行。闭塞2 h后,再灌注的老鼠进行了24小时。虚假的组只收到一个没有颈内动脉阻塞的皮肤切口。24小时再灌注后神经功能评估,和脑组织对TTC采样(2、3、氯化5-tripenyltetrazolium)染色或者其他相关分析,如基因表达。

2.2。细胞培养

SH-SY5Y细胞系是来自中国科学院的CTCC和验证使用STR(短串联重复序列)分析。细胞培养在37°C, 95%的空气,和5%的有限公司2在化合物中含有DMEM 10%胎牛血清和抗生素。

2.3。体外模型的体外模型缺血性中风(是)

体外模拟缺血性中风,H / R(缺氧/复氧)模型使用。SH-SY5Y细胞受到4 h(缺氧紧随其后20 h再氧化。缺氧期间,只SH-SY5Y细胞诱导使用DPBS(杜尔贝科的磷酸盐),而在再氧化,DPBS取代正常介质(DMEM培养基包含10%的边后卫)。

2.4。神经功能评价

神经功能评估后5点量表(4]。根据评定量表,0表示正常,1意味着左前爪不能变直,2代表一个前爪的握力下降,3表示转向左边时把尾巴,和4意味着自发的旋转。

2.5。梗塞尺寸测量

TTC(2、3、氯化5-tripenyltetrazolium)染色进行脑梗塞尺寸测量后之前的描述方法(4]。简单地说,大脑部分(厚0.2 - -0.3厘米)孵化TTC 2%解决方案在黑暗中半小时25°C,然后成像。总梗塞尺寸(cm3)部分计算的方程: 。

2.6。细胞凋亡特征

TUNEL /赫斯特double-labelling用于分析大脑组织的细胞凋亡13]。大脑部分是处理如下:w / v沉浸在4%多聚甲醛(25°C, 10分钟)修复,沉浸在多聚甲醛+醋酸(4°C, 5分钟)后缀,沉浸在反应的解决方案包含平衡缓冲和工作强度deoxynucleotide转移酶(TdT) (35°C, 1 h)和印迹,其次是孵化与赫斯特33342 (25°C, 5分钟)。最后,使用显微数字化图像捕获(×200放大),和TUNEL-positive细胞的数量统计。

细胞凋亡分析如前所述[4]。SH-SY5Y细胞悬液(100细胞/毫升)与FITC-conjugated混合膜联蛋白V和propidium碘和维护在黑暗中在25°C,持续15分钟。随后,细胞凋亡是使用流式细胞分析仪检测。

2.7。基因表达击倒

TLR4损失函数得到以下SH-SY5Y细胞转染过程。混合物是由混合核的TLR4 (R: UGUUCUAGAAUUAAUAAGCCC序列针对R: GCUUAUUAAUUCUAGAACAAA)和Lipofectamine 2000。SH-SY5Y细胞转染24 h。

2.8。测定炎症介质

一个酶联免疫试剂盒用于确定肿瘤坏死因子的水平α(Beyotime), l - 1β(Beyotime)、il - 6 (Beyotime)或地震(Beyotime)根据制造商的指示。短暂,SH-SY5Y细胞收集上层清液,光吸光度在540 nm决心使用标。

2.9。实时聚合酶链反应

实时PCR进行以下描述的方法(4]。使用试剂盒短暂,总RNA提取试剂盒(豆类)其纯度和浓度是spectrophotometrically决定。反转录系统和实时PCR反应体系建立了定量确定TLR4的表达水平,NLRP3, LC3根据指令的转录工具包(DRR037A;豆类)和SYBR预混料交货Taq工具包(豆类)。放大反应是使用ABI 7300实时PCR系统进行的。PCR引物如下:使用TLR4 (F: 5 - - - - - -CCGCTCTGGCATCATCTTCA-3 ;R: 5 - - - - - -TCCCACTCGAGGTAGGTGTT-3 ),NLRP3 (F: 5 - - - - - -CTGCAGAGCCTACAGTTGGG-3 ;R: 5 - - - - - -GTCCTGCTTCCACACCTACC-3 ),和β肌动蛋白(F: 5 - - - - - -CCCATCTATGAGGGTTACGC-3 ;R: 5 - - - - - -TTTAATGTCACGCACGATTTC-3 )。

2.10。西方墨点法

总蛋白提取使用一个包含1% PMSF提取液,和它的浓度决定。sds - page凝胶(10%)被用于靶蛋白隔离,和他们electrotransfered PVDF膜。膜是孵化主要抗体(4°C, 16 h)和二次抗体(25°C, 2 h)先后。带信号的强度检测使用增强化学发光和ChemiDoc XRS系统(Bio-Rad)。主要抗体包括兔子anti-TLR4、-NLRP3 LC3-I, LC3-II。β肌动蛋白是用于建立蛋白质加载等价。主要的抗体都是由圣克鲁斯。

2.11。统计分析

SPSS 21用于统计分析。数据了 。单向方差分析、独立样本 - - - - - -测试被用来计算不同组。 值< 0.05被认为是重要的。

3所示。结果

3.1。严重损害发生在CI / R损伤鼠

数据1(一)和1 (b)比较暴露的影响I / R强调神经组织学的骗局。结果清楚地表明,实施I / R压力诱导脑梗塞,而虚假的组组织学改变。图1 (c)显示神经功能测定的结果,他们在I / R组表明,I / R压力诱导的神经功能障碍(图1 (c))。数据1 (d)和1 (e)表明,I / R老鼠的脑组织有更多TUNEL-positive细胞,这表明他们接受了细胞凋亡。这些数据证实,这种I / R组诱发严重的神经结构和功能损伤。

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图1
诱导神经组织学变化CI / R损伤鼠。(一)梗塞大小。(b)代表TTC染色的图像。(c)神经功能分析。(d)代表TUNEL /赫斯特双染色法的图像。(e) TUNEL-positive细胞数量。数据表示为 ( )。 与骗局。
3.2。CI / R损伤移植促炎细胞因子释放

由于炎症是CI / R损伤的主要原因,我们决定如果增加促炎介质释放伴随这种反应。结果在图2(一个)- - - - - -2 (d)表明TNF -的水平α和interleukin-1β/ 6/18 (1 l - 1β/ 6/18)显著增加老鼠I / R组相比,虚假的组的相应水平。

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图2
CI / R损伤增强炎性介质释放。(一)TNF -α的水平。(b) il - 1β的水平。(c) il - 6水平。(d)的地震水平。数据表示为 。 与骗局。
3.3。CI / R损伤移植NLRP3、TLR4和LC3表达水平

CI / R损伤的影响测定有关炎症基因表达的水平。结果如图3(一个)和3 (b)表明这样的压力增加了TLR4表达水平相对于其虚假的集团持续的水平。一致,NLRP3基因表达水平也经历了upregulation I / R强调老鼠(由数字3(一个)和3 (c))。本协议表明TLR4和NLRP3 upregulation与炎症反应密切相关的I / R老鼠。考虑到有一个相互影响炎症和自噬,然后,我们测量了LC3的表达水平(细胞凋亡的生物标志物)6]。结果如图3(一个)和3 (d)清楚地表明,LC3-II比LC3-I增加I / R的老鼠。这对应提高LC3-II / LC3-1(细胞凋亡的生物标志物)(6)比和NLRP3 inflammasome upregulation表明这些反应都与CI / R损伤。

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图3
CI / R损伤NLRP3的表达增加,TLR4和LC3。(一)蛋白表达水平。(b) TLR4的比率β肌动蛋白。(c) NLRP3的比率β肌动蛋白。(d)的比值LC3-I LC3-II。数据表示为 。 与控制和虚假的。
3.4。对应的影响NLRP3 TLR4击倒,LC3在H / R-Induced SH-SY5Y细胞和CI / R鼠群

我们确定是否有对应体内H / R-induced upregulation TLR4、NLRP3, LC3体内表达水平和暴露SH-SY5Y诱导的细胞压力(数据4(一)- - - - - -4 (g))。结果如图4(一)- - - - - -4 (g)确认H / R暴露在两种条件下移植这些介质通过刺激TLR4的活动。结果在图4(一)与TLR4基因沉默表明转染核显著抑制TLR4的表达SH-SY5Y细胞经历了H / R,但数控生理无关紧要的siRNA没有影响。数据4 (d)和4 (e)表明TLR4的转染核抑制TLR4的蛋白质表达水平在H / R-induced SH-SY5Y细胞。此外,TLR4击倒抑制NLRP3的表达水平和LC3在H / R-induced SH-SY5Y细胞,而数控siRNA没有抑制作用的表达水平(出口数据4 (b)- - - - - -4 (d),4 (f),4 (g))。这些数据证实了H / R上调NLRP3 inflammasome和自噬通过TLR4活动的增加。

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图4
TLR4击倒抑制上涨NLRP3 LC3在H / R-induced SH-SY5Y细胞。(一)TLR4 mRNA水平。(b) NLRP3 mRNA水平。(c) LC3 mRNA水平。(d)蛋白表达水平。(e) TLR4的比率β肌动蛋白。NLRP3比(f)β肌动蛋白。(g)的比率LC3-I LC3-II。数据表示为 。小干扰rna对TLR4 + TLR4 siRNA:细胞治疗(100海里);+ NC siRNA:细胞与消极控制核(100海里)。 与控制;# 与H / R;# # 与H / R;# # # 与H / R。
3.5。TLR4击倒抑制炎性介质释放H / R-Induced SH-SY5Y细胞

来确定曝光SH-SY5Y细胞H / R压力释放促炎细胞因子的介导增长通过刺激TLR4受体TLR4击倒的影响进行评估在这些上涨H / R强调SH-SY5Y细胞。与动物的结果一致,释放肿瘤坏死因子-α和白介素1β/ 6/18 (1 l - 1β/ 6/18)显著增加H / R-induced SH-SY5Y细胞,而TLR4击倒明显减少了释放(数字5(一个)- - - - - -5 (d))。这些结果证实TLR4参与调停H / R-induced对促炎细胞因子表达水平增加潜在的炎症在神经元。

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图5
TLR4击倒抑制炎性介质释放H / R SH-SY5Y细胞治疗。(一)TNF -α的水平。(b) il - 1β的水平。(c) il - 6水平。(d)的地震水平。数据表示为 。 与控制;# # 与H / R。
3.6。TLR4击倒抑制H / R-Induced SH-SY5Y细胞凋亡

协会之间的决心H / R-induced TLR4在SH-SY5Y细胞活化和细胞凋亡。结果如图6(一)和6 (b)表明,H / R治疗明显诱导增加SH-SY5Y而TLR4击倒明显抑制这种反应。因此,H / R细胞凋亡神经元通过移植和刺激TLR4表达水平。

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图6
(一)TLR4击倒减少增加细胞凋亡在H / R-induced SH-SY5Y细胞。流式细胞术的形象代表。(b)细胞死亡比例。数据表示为 。 与控制;# # 与H / R。

4所示。讨论

在CI / R损伤炎症发挥关键作用。目前的研究显示,高表达TLR4通过调节NLRP3 CI / R损伤和LC3 upregulation和刺激。结果表明,TLR4的表达水平积极与NLRP3和LC3的表达水平。细胞凋亡和炎症介质的释放在脑组织受到CI / R或SH-SY5Y细胞。TLR4击倒显著抑制TLR4的表达,NLRP3, LC3和抑制细胞凋亡的SH-SY5Y细胞经历了H / R。这些结果表明,TLR4诱发CI / R损伤通过调节NLRP3 inflammasome和自噬。这些发现表明,NLRP3抑制是一个潜在的缺血性中风治疗的目标。

激活炎症反应在脑缺血/再灌注组织。这种效果是由于增加炎症细胞(巨噬细胞)和小胶质细胞渗透释放促炎的因素很多,如肿瘤坏死因子-α和白介素1β/ 18 (1 l - 1β/ 18)[14]。在这个过程中,形成和活化的NLRP3 inflammasome对炎症反应的起始至关重要。因此,角色的NLRP3 inflammasome CI / R损伤非常广泛研究[7,8]。例如,NLRP3 upregulation被发现在MCAO调节小鼠模型以及布鲁顿Ttrosine激酶(对)杀人案引发反应通过调节NLRP3的表达水平9,15]。增加释放il - 1β的标记NLRP3 inflammasome激活,MCAO老鼠的大脑组织中9]。我们发现CI / R -和H / R-induced神经元损伤体外和体内释放的增加有关TNF -α和interleukin-1β/ 18 (1 l - 1β/ 18),证实NLRP3激活有助于调节这些影响。这模仿证实TLR4-induced增加的相关性炎症H / R和调节TNF -脑动脉阻塞α和interleukin-1β/ 18 (1 l - 1β/ 18)[9通过NLRP3 inflammasome upregulation和激活。此外,他等人最近发现,白藜芦醇能降低脑梗死面积和改善神经功能的老鼠接受了CI / R损伤及其机制包括抑制NLRP3 inflammasome [16]。这些数据提供额外证明暴露在CI / R诱发神经元损伤通过NLRP3 inflammasome激活。因此,澄清的背后机制控制NLRP3函数是非常相关的识别新治疗方法减轻CI / R损伤。

自噬是一种守恒的,控制,lysosomal-dependent生物过程形成在真核生物的进化和参与许多疾病的发病机制在哺乳动物中,如CI / R损伤(7,17]。CI / R损伤过程中,发现自噬可能是一把双刃剑(有益的或有害的),比如在缺血性预处理模型。在这种情况下,自噬激活神经,而CI / R损伤模型(完整的脑缺血和缺血或缺氧缺血模型),自噬激活而是与神经细胞凋亡或死亡(18- - - - - -20.]。这表明自噬在CI / R损伤的机理是非常复杂的。因此,澄清自噬在CI / R损伤的机制是缺血性中风治疗的关键和迫切需要实施广泛的基础或临床研究来解决这个复杂的问题。先前的研究表明,自噬伴随梗死和细胞凋亡在大脑神经组织的CI / R损伤老鼠,而抑制自噬提供保护神经元脑损伤(20.,21]。例如,张等人发现deltonin可以抑制自噬减轻脑缺血再灌注损伤(21]。一致,我们发现LC3在CI / R损伤大鼠明显调节。有一个协会之间表达水平的增加LC3(自噬的生物标志物)18)和脑梗塞大小和TUNEL-positive细胞数量。这些结果表明,有一个协会之间的CI / R损伤和自噬。

很明显,自噬在CI / R损伤的机理非常复杂,由信号通路介导,如AMPK-mTOR通路,PI3K / Akt / mTOR通路,TLR4 / p38 MAPK [19,21- - - - - -23]。其中,PI3K / Akt / mTOR通路和TLR4 / P38 MAPK pathway-mediated凋亡的神经元是最近很多报道的焦点。许多研究已经描述了CI / R损伤与破坏TLR4 / P38 MAPK信号通路,表明它是一个重要的CI / R损伤的治疗目标。例如,黄等人发现,姜黄素可以减轻CI / R损伤通过抑制TLR4 / P38 MAPK信号通路(24]。一致,我们发现TLR4表达水平之间存在正相关和自噬,细胞凋亡在I / R老鼠,或者在H / R-induced SH-SY5Y细胞。这表明有一个内部关系CI / R-induced炎症和自噬。

最近的研究表明TLR4在介导炎症和自噬有一个重要的角色在许多中枢神经系统疾病,如中风和硬化(25]。抑制TLR4保护实验中风动物损伤(10,11]。最近,据报道,TLR4-dependent自噬对macrophage-induced炎症(至关重要25]。这个结果是符合我们的发现TLR4是调节在CI / R损伤鼠或H / R-induced SH-SY5Y细胞。这种反应与增加NLRP3和LC3的表达水平。这些结果说明CI / R-induced TLR4 upregulation激活炎症和自噬是至关重要的。这种依赖是一致的与我们的发现表明在TLR4-deficient /基因敲除小鼠,缺血性侮辱与一个较小的炎症反应(10]。此外,一项研究报道,TLR4-knockdown变弱脑损伤通过抑制炎症和自噬在创伤性脑损伤大鼠26]。考虑到缺血性中风和创伤性脑损伤之间的因果关系,很明显,TLR4是一个潜在的治疗目标CI / R损伤的治疗。

然而,考虑炎症和自噬之间的相互作用的复杂性,没有明确的机制,描述了TLR4在CI / R损伤的作用。例如,机制是未知的,占TLR4如何调节NLRP3 inflammasome和自噬。尚不清楚如果TLR4-mediated炎症促进自噬或TLR4-mediated自噬促进炎症在CI / R损伤。因此,仍然需要多努力充分阐明TLR4在诱导炎症和自噬的作用在脑缺血/再灌注损伤。

总之,TLR4扮演着一个重要的角色在诱导炎症和自噬在CI / R损伤。我们这里显示大脑CI / R损伤induced-TLR4激活促进炎症和自噬通过上调NLRP3 inflammasome表达式和活动。这一发现可能导致发展的新方法来改善临床治疗缺血性事件的管理。

数据可用性

可用的数据集可以从相应的作者如果合理请求。

伦理批准

本研究伦理委员会批准的湖南中医学院附属医院。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

毛李、吴大华和Guo-Huang胡锦涛导致数据1- - - - - -6。Jian-Hu风扇起草了手稿。

确认

这项工作是支持的科学与健康联合湖南省自然科学基金项目(2020号jj8017)和长沙科技局(没有。kq2004154 Guo-Huang胡锦涛)。