文摘

没有有效的治疗周围神经创伤性慢性神经性疼痛(NP),它深刻地影响着患者的生活质量。Transmembraneprotein100 (TMEM100)被认为是一个痛苦的监管蛋白质和表达在大鼠背根神经节(DRG)。然而,疼痛的机制监管和TMEM100的表达各种周围神经损伤后尚不清楚。在这项研究中,我们构造了两种疼痛模型的周围神经损伤:胫骨神经损伤(交通噪音指数)和慢性收缩损伤(CCI)。本研究发现,爪子撤军机械阈值(PWMT)和爪子取热延迟(PWTL)两种疼痛模型大鼠的显著降低,和DRG的TMEM100两组的表达也显著减少。此外,减少CCI组比交通噪音指数组更明显。没有显著的统计学意义( )。我们构造了一个向量表达重组腺相关病毒6 (AAV6)荧光TMEM100蛋白,将其注入坐骨神经(SN)两种疼痛模型:CCI和提供支援。PWMT和PWTL两组显著增加,随着脊髓和按TMEM100的表达式。它也显著地抑制小胶质细胞的激活,星形胶质细胞,和一些炎症介质(TNF -α,il - 1β和il - 6)。总之,这项研究的结果表明,TMEM100战略可能是一个有前途的分子治疗NP,及其抗炎作用可能在缓解疼痛发挥重要作用。

1。介绍

神经性疼痛(NP)是指主要病变引起的疼痛或神经系统的功能障碍1,2]。这是一种常见的临床问题,通常表现为持续性痛(燃烧、挤压和压缩)或阵发性疼痛(失衡的感觉和刺痛),导致感觉异常和感觉迟钝(刺痛和针)3]。NP影响大约7%全球总人口的-10%,主要集中在50岁以上的患者(2,4]。NP的发病机制是复杂的。先前的研究已经发现,NP与结构和功能变化在周围神经损伤等疼痛的途径站点,脊髓和背根神经节(DRG) [3]。这些疾病与各种外围或中枢神经系统病变(5]。NP可以分为外围和中央NP基于损伤的解剖学和疾病(6];前者是更常见的在临床实践7,8]。虽然周围神经损伤通常导致慢性NP,底层机制往往是不确定的(9]。目前没有足够有效的治疗NP,虽然许多研究都集中在发现新的药物靶点和它们对疼痛的影响行为。

Transmembraneprotein100 (TMEM100)被发现有很多生物功能,表达血管、肺和胃肠道组织,在动脉内皮分化起着必要的作用,血管的完整性,癌症细胞,增殖(10- - - - - -13]。最近,人们已经发现,TMEM100也在DRG中表达的9,14)作为一个表达的疼痛信号调制器疼痛的神经元。它调节疼痛调节TRPA1之间的交互和TRPV1和扮演重要的角色在疼痛和神经系统14]。DRG是周围神经系统的一个重要组成部分。据报道,TMEM100主要位于鼠标DRG、神经节细胞肽能的神经元(14,15),但其表达在NP是不确定的15]。之间可能存在的差异基因表达炎性疼痛和NP (16- - - - - -19]。

研究表明,慢性疼痛是由干扰引起的神经炎症的分解20.- - - - - -23]。在慢性疼痛条件下典型特征的神经炎症包括免疫细胞的渗透到坐骨神经(SN)和按激活的胶质细胞:小胶质细胞和星形胶质细胞,生产和分泌的促炎细胞因子和趋化因子(TNF、il - 1βil - 6, CCL2,处于受控)[20.]。先前的研究已经报道,TMEM100在炎性细胞因子的分泌有抑制作用在肝脏炎症24]。因此,我们调查的贡献TMEM100在初始神经组织的炎症。

AAV6现在被认为是最有用的一个向量的基因疗法由于其低免疫原性和毒性。诊断相关基因传递到已被证明是可能的。据报道,逆行AAV6成神经细胞的转染SN注入背根神经节神经元的组织可以获得更高的转染效率比其他转染方法(静脉、肌肉和鞘内)。

AAV6现在被认为是最有用的一个向量的基因疗法由于其低免疫原性和毒性25]。基因传递DRG已被证明是可能的(26,27]。据报道,逆行AAV6成神经细胞的转染SN注射可以获得更高的转换效率比其他转导DRG神经元的方法(静脉、肌肉和鞘内)(28,29日]。

本研究旨在探讨影响TMEM100 NP和TMEM100作为潜在的治疗目标治疗慢性NP。在这项研究中,我们构造了一个腺相关病毒(AAV6) -TMEM100超表达载体注射到老鼠的SN,和分析的微分表达式TMEM100在老鼠和痛苦的行为。此外,促炎细胞因子在大鼠DRG引起疼痛评估。

2。方法和材料

2.1。动物

本研究使用干净、健康的男性Sprague-Dawley (SD)大鼠年龄在7 - 10周,体重200 - 300克。室内温度保持在23±2°C,相对湿度60% - -70%。单独的笼子里的老鼠被喂食自由喝和吃。山东省青岛大学实验动物中心提供所有的实验动物。实验操作遇到了动物保护协会的要求和用户的青岛大学委员会和符合国家动物保护协会的指导方针。

2.2。建立动物模型

根据班纳特的方法(30.慢性收缩),一只老鼠模型损伤(CCI)成立:我们4%异氟烷诱导和2%用于维持麻醉,然后让老鼠在手术台上,和右后肢剃了准备。皮肤消毒用10%碘附解决方案,其次是坐骨结节的切口和钝性剥离每一层的肌肉暴露SN;4 - 0肠线是用来制造四松配合连接,间隔约1毫米,获得损坏SN长度4 - 5毫米。结扎强度是基于神经外动脉轻度压缩在解剖显微镜下,而血液流动并不是完全中断。当老鼠表现出典型的NP迹象:减少下肢重量,爪子挛缩,舔,和运动机能的限制如残废,模型被认为是成功的。

根据李的方法等。31日)固定胫骨神经损伤的大鼠模型(提供)成立:麻醉的步骤,皮肤准备,消毒是一样的CCI模型。SN和其三个分支接触和脱离周围的软组织神经解剖。SN阀杆和三个分支都小心地隔离。胫骨神经分支识别,很仔细,胫骨神经是紧密的结扎和4 - 0 chrome肠线切断长度约5毫米,离开腓腓肠神经完好无损。成功的标志是CCI一样。

2.3。实验分组

共有80名男性SD大鼠被包括在这项研究中,随机分为8组:正常;虚假的;CCI;交通噪音指数;CCI, AAV6-GFP;TNI AAV6-GFP;CCI, AAV6-TMEM100;和TNI AAV6-TMEM100组各10个。组的描述如下。

正常组不进行任何操作。虚假的组,SN暴露但不结扎。手术建模在CCI和交通噪音指数组,但没有进行注射。而在CCI, AAV6-GFP TNI AAV6-GFP组;AAV6-GFP (1012病毒颗粒)被注入了SN。此外,CCI, AAV6-TMEM100 TNI AAV6-TMEM100组,AAV6-TMEM100 (1012病毒颗粒)被注入了SN中建模。AAV6-TMEM100 AAV6-TMEM100设计和合成了生物医学生物技术(中国重庆)。

2.4。行为分析

爪子撤军机械阈值(PWMT)测试前一天进行了建模,1,3,5,7,10日,14日,21日和28天后建模,根据上下法(32,33),使用·冯·弗雷细丝来确定机械触诱发痛步行撤退。老鼠被放在一个金属网框架,和纤毛通过网格垂直刺入皮肤的大鼠后肢直到他们微微弯曲成一个形状。每个刺激的持续时间是3 - 5 s,间隔10 - 15 s。反应:如果显示的老鼠的脚,这是标记为“+”;如果没有回应,这是标记为“−”;如果出现“+”,相邻的纤毛与减少力量用于刺激;如果消极,用于刺激邻近的增加力量。刺激了如果没有积极回应纤毛的最大刺激强度。第一个阳性反应后,上下方法重复测量6次10分钟休息;两边的极端值被移除,剩余值的平均值作为老鼠的PWMT价值。

爪取热延迟(PWTL)决心完成一天在建模之前,1,3,5,7,10日,14日,21日和28天后建模,根据爪子撤军延迟(PWL)方法(34]。热辐射曝光时间限制设置为20年代,老鼠被放置在玻璃板在玻璃板上的温度保持在26±0.5°C,和玻璃板下的照射光源调整瞄准的手掌后老鼠的爪子。脚戒断反应发生时,照射时间达到20多岁或更多(20年代照射限制),光源关闭并记录。测量重复了六次10分钟休息;两边的极端值被移除,平均PWTL记录。

2.5。免疫荧光

疼痛行为测量后,每组大鼠解剖在L4, L5,背根神经节,和16种腰椎,DRG组织很快就被移除和解剖。L4-L6脊柱被曝光,脊髓中间分开了一个工具。删除组织在4%多聚甲醛在4°C后缀为8小时,嵌入在石蜡,分段连续4µm。免疫荧光tristaining做是为了描述细胞特异性和分布目标分子的部分。4微米厚的部分在二甲苯deparaffinized,患者通过分级醇,柠檬酸和被燥热引起抗原决定基检索在10毫米缓冲区(Elabscience)。我们使用5% BSA (Solarbio,北京)屏蔽解决方案1小时在室温下37°C以下的主要抗体与抗体稀释剂稀释(稀释比例是根据抗体指令)一滴一滴地,湿盒放置在4°C冰箱在一夜之间就孵化。两种荧光二次抗体(Elabscience)添加和孵化室温1小时的37°C。每次孵化后,洗聚偏二氟乙烯(PVDF)膜三次TBST溶液瓶10分钟/次。然后,细胞核与DAPI荧光染料复染色(蓝色),一滴一滴地一个antifluorescence冷却器是补充道。盖玻片被放置在4°C低温冰箱以备后用。准备后,共焦显微镜下观察切片,和组织图像拍摄使用Image-Pro +(美国媒体公司控制论6.0.0.260版本)。图片终于进行了分析。

2.6。定量实时聚合酶链反应(存在)

切除标本后,放入一个enzyme-free EP管(包含1毫升试剂盒(Elabscience)和钢球)其次是振动磨在60岁rpm 30年代,六次。站后,氯仿提取mRNA。当时反转录成cDNA使用Evo M-MLV RT工具包qPCR(准确的生物学)。qPCR放大反应进行PCR仪器根据设备制造商的指令(SYBR®绿色预混料Pro Taq HS qPCR工具包(准确的生物学))与下列条件:95°C 30年代,然后对5 s 95°C, 30年代和60°C 40周期。在这项研究中使用的引物序列是显示在表中1。使用2(−获得的数据进行了分析ΔΔCt)算法来获得结果。

2.7。免疫印迹分析

蛋白质提取与radioimmunoprecipitation溶解组织(里帕)裂解缓冲(Solarbio,北京)包含1毫米phenylmethanesulfonyl氟化物(PMSF)。提取蛋白质的浓度是决定bicinchoninic酸(BCA)工具包(Solarbio,北京)。蛋白质和加载缓冲喜忧参半的比率4:1 (V / V)和煮10分钟的99°C。由钠十二烷基sulfate-polyacrylamide凝胶电泳(sds - page)和转移到PVDF膜。PVDF膜被封锁在室温下5%的脱脂奶粉。膜被孵化主要抗体在一夜之间在4°C(表2)。孕育了一夜后,膜与辣根过氧化物酶(合)标记二次抗体(Elabscience) 1小时,然后ECL工具包(Elabscience)是用于发光观察。获得的图像进行了分析使用开发工具(奥德赛®XF)。

2.8。统计分析

收集的数据进行统计分析,发现和排序。连续数据提出了均值±标准差,而非参数数据提出了中位数和四分位范围。比较组间进行使用单向方差分析(方差分析)其次是克鲁斯卡尔-沃利斯检验。平行组之间比较的参数进行使用t以及。 被认为是具有统计学意义。进行了统计分析,统计图是用GraphPad棱镜8(美国GraphPad软件)软件。

3所示。结果

3.1。减少两个NP TMEM100表达模型

3.1.1。两组大鼠疼痛模型表现出显著减少疼痛行为测试

大鼠术后状况总体是好的;没有四肢的自噬,典型的自发的痛觉过敏逐渐出现。正确的肢体的老鼠,拖,或者暂停,有明显的步行和残废。我们第一次进行疼痛研究正常大鼠,骗局,CCI,和交通噪音指数组:PWMT和PWTL测试结果显示,正常的值和虚假的团体是相同的每一次,和没有明显变化( )。与正常组相比,PWMT和PWTL CCI和交通噪音指数组手术后减少在每个时间点,他们第一天显著降低手术后,一直持续到28天( ,数据1(一)和1 (b))。

3.1.2。痛苦的老鼠与腺病毒转染了显著缓解疼痛的行为

建模期间,我们AAV6-GFP和AAV6-TMEM100注入CCI的SN和TNI老鼠。结果表明,AAV6-TMEM100集团有一个较小的下降PWMT和比AAV6-GFP PWTL集团和手术后在过去的七天里,有不同程度的增加( ),在28天的最高水平( ,图1 (c)- - - - - -1 (f)。

3.1.3。减少TMEM100 DRG NP外围的表情

经过4周的建模、老鼠都牺牲了,他们的DRG组织解剖。正常使用免疫印迹和虚假的组比较,存在,免疫荧光。此外,按组织CCI和交通噪音指数组比较。TMEM100基因的表达变化,TMEM100的表达在正常和虚假的团体被检测到。CCI TMEM100的表达显著减弱,交通噪音指数组相比,正常的和虚假的团体,有统计学意义( )。交通噪音指数组表达水平略高于CCI组,但差异无统计学意义( ,图2(一个))。存在结果与免疫印迹结果一致。CCI的表达式和交通噪音指数比正常组明显减少和虚假的组( )。CCI集团组蛋白表达略低于交通噪音指数( )。正常的和虚假的组织有相似的组蛋白表达( ,图2 (b))。

前面描述的免疫荧光染色产生相同的结果。CCI的荧光强度和交通噪音指数组低于正常和虚假的组( ),交通噪音指数组略高于CCI集团( ),和其他组之间没有显著差异( ,图3)。通过构造两种疼痛模型,CCI, TNI我们发现TMEM100表达下调的drg模型。我们推测TMEM100可能参与疼痛的发生,作为其表达表现出下降的趋势。

3.2。微创注射AAV6-TMEM100 CCI和交通噪音指数老鼠可以扭转TMEM100减少和减轻NP

疼痛模型:CCI和交通噪音指数与TMEM100由腺病毒转染,和相同的实验小组成立作为一个正常组和病毒转染组(AAV6-GFP和AAV6-TMEM100组)。转染后四个星期,存在检测。结果显示,AAV6-TMEM100 AAV6-GFP组相比显著增加表达式有统计学差异( ,图4)。

免疫印迹检测到CCI, AAV6-TMEM100 TNI AAV6-TMEM100组明显增强蛋白表达与AAV6-GFP组有统计学差异( ,数据5(一个),5 (c),5 (d))。同时,我们提取和检测大鼠的脊髓建模(R)和未建模方面(l在每组),与前获得类似的结果。有统计学差异( )。此外,CCI的表达TMEM100建模方面的大鼠的脊髓AAV6-TMEM100组高于未建模方面,统计差异( )。的表达在大鼠的脊髓TMEM100交通噪音指数和AAV6-TMEM100组高于nonmodeled一侧,但两者之间无显著差异( ,数据5 (b),5 (e),5 (f))。

免疫荧光染色产生了类似的结果如上所述。AAV6-TMEM100组表现出显著增强的荧光强度比AAV6-GFP集团( ,数据6(一)和6 (b))。这个建议TMEM100作为至关重要的蛋白质,控制疼痛和免疫力和NP中扮演着关键角色。转染腺病毒携带TMEM100可以反向discogenic疼痛和达到治疗的效果。它可以作为discogenic疼痛的基因治疗。性疼痛提供了一个良好的理论基础和先决条件后动物实验。

3.3。逆转TMEM100表达减少胶质细胞和炎症介质的表达升高引起的周边NP

本研究调查了TMEM100和小胶质细胞之间的关系(Iba-1)星形胶质细胞(GFAP)和炎症介质(TNF -α、il - 6和il - 1β外围NP后)。qPCR,免疫印迹和免疫荧光检测每个指标的表达水平在正常和virus-injected组。Iba-1 qPCR证明了表情,GFAP、TNF -α、il - 6和il - 1βAAV6-GFP组增加不同程度比正常组( )。AAV6-TMEM100组表达明显低于AAV6-GFP集团( ,图7)。免疫印迹(类似结果 ,图8)。

我们进一步验证Iba-1和GFAP的表达通过免疫荧光,结果是一致的与那些通过qPCR和免疫印迹(图9)。

这些结果表明,TMEM100可能减轻疼痛,减少神经胶质细胞和炎症因子的表达在NP。

4所示。讨论

本研究旨在确定表达式的TMEM100 NP和探索可能的TMEM100在缓解疼痛的作用。我们发现TMEM100的表达与外围显著降低大鼠DRG的NP通过创建两个不同的疼痛模型:CCI和提供支援。我们建立了一个AAV6向量编码荧光TMEM100重组和转染到DRG近端周围神经损伤。我们发现的表达TMEM100转染大鼠DRG的明显高于单独模型大鼠,大鼠痛行为的显著提高。此外,我们发现扭转TMEM100的表达抑制NP和小胶质细胞(Iba-1)星形胶质细胞(GFAP)和炎症介质(il - 1β肿瘤坏死因子-α和il - 6)。总的来说,这项研究的结果直接TMEM100是一个重要的pain-regulating蛋白质扮演重要的角色在NP和通过减少炎症介质可能会减轻疼痛。

TMEM100 two-transmembrane蛋白是广泛分布于各种组织。据报道,TMEM100表达在血管,脊索,和其他组织和肾有关发展,血管生成,肺癌转移(10,35,36]。的表达TMEM100最近被发现在神经系统14]。然而,在NP TMEM100的表达和作用仍不清楚。

为了进一步确定TMEM100和疼痛之间的关系,我们建立了两种病理性痛模型:CCI和提供支援。CCI模型是一种行之有效的(30.)和最疼痛模型用于研究。四个线程的压缩引起的疼痛是结的SN树干,和老鼠可能感觉异常的经验,机械触诱发痛,和热量的肢体异常性疼痛,类似于人类NP的特点(37]。交通噪音指数模型是一种优化的导数的避免神经损伤(SNI)。SNI类的典型特征和一些优势。李等人。31日)发现,同时胫骨横断和腓肠神经或单一的交通噪音指数导致更严重的痛阈变化。胫骨神经疼痛的过程中可能发挥重要作用[38]。因此,研究人员认为单一的交通噪音指数是一个更加稳定和高效的外围模型比经典的NP SNI [39]。

我们与两个不同的疼痛模型大鼠行为执行测试和评估每组TMEM100的表达。我们发现痛苦的生产伴随着TMEM100表达的变化在两种疼痛模型大鼠DRG的。TMEM100的表达在两组显著降低,所以我们猜测的亲密关系TMEM100代或监管的痛苦。有趣的是,尽管TMEM100的表达明显减少CCI和交通噪音指数组与正常组相比,减少TMEM100 CCI模型中更加明显。许多研究已经证明,(9TMEM100的差别]对这些基因可能与神经损伤后星形胶质细胞和小胶质细胞的增殖。通过检测astrocyte-specific标记(GFAP)和microglia-specific标记(Iba-1),我们发现两种疼痛模型有不同程度的升高;CCI模型中,高程GFAP和Iba-1更明显比TNI解释TMEM100在NP的减少,低表达相比,CCI TMEM100交通噪音指数模型。

TMEM100的功能是涉及生物学的许多方面。例如,TMEM100参与发育增殖和分化的控制(40]。它扮演了一个角色在细胞发育和分化等途径改变增长factor-bone地貌成因的蛋白质在肠神经系统。它有基本功能在维持血管完整性以及血管的形成。与此同时,TMEM100作为肿瘤抑制多种肿瘤细胞抑制转移和扩散41]。锅等。24]表明TMEM100来说是至关重要的分泌炎症因子,发现TNF -αTMEM100的表达有抑制作用,同时减少TMEM100表达式可以显著降低炎症因素如il - 1的分泌β和il - 6。这是与我们的研究结果一致,TNF的表达α,il - 1β诊断相关,il - 6的CCI和TNI老鼠TMEM100过度后有所下降。炎症介质的释放(TNF -α,il - 1β和il - 6)是NP的发病机制密切相关。这些炎症介质导致脊髓中枢敏化,从而提高NP的发展(42,43]。

激活的胶质细胞,这些细胞和神经元之间的相互作用可能参与痛觉过敏在中央和周边神经系统(44]。神经胶质细胞,包括星形胶质细胞和小胶质细胞参与的感应和维护NP (45]。在激活星形胶质细胞发挥的重要作用可能与细胞因子的生产受伤后(46]。有人建议upregulation GFAP、标记星形胶质细胞激活后受伤,有一个角色在维护NP (47]。一项研究发现,upregulation GFAP的坚持从神经损伤后3至21天48]。本研究表明,GFAP水平增加团体的CCI和交通噪音指数模型注射空病毒(AAV6-GFP组)。相比之下,该组织注射病毒携带TMEM100 (AAV6-TMEM100)表现出衰减GFAP CCI和交通噪音指数模型。

此外,小胶质细胞的激活有关键作用的中枢敏化NP (49]。NP的病理条件导致小胶质细胞激活:小胶质细胞释放多种促炎细胞因子,如肿瘤坏死因子-α与谷氨酸释放过量的活性氧和细胞凋亡。在这项研究中,我们发现不同程度的海拔Iba-1,小胶质细胞激活的标志,AAV6-GFP组的大鼠中CCI和交通噪音指数模型。的水平Iba-1 AAV6-TMEM100组明显减少。Yu et al。9通过体外实验证明了过度的TMEM100在星形胶质细胞和小胶质细胞细胞系明显抑制其增殖,通过动物实验发现,TMEM100可能发挥作用在控制卫星胶质细胞(国网公司)增殖。相信动物神经损伤后的神经胶质细胞增殖可能TMEM100的差别的原因对这些基因的表达,这与我们的研究结果是一致的。

AAV6-TMEM100注入SN的老鼠后,的表达TMEM100 CCI和交通噪音指数大鼠明显增加,和痛苦的表达行为明显提高,这也反映了TMEM100的潜在治疗镇痛效应的机制。因此,AAV6-mediated DRG-targeted交付TMEM100有潜力成为转化为临床应用治疗患者NP,尽管长期安全性需要进一步研究。

5。结论

本研究发现,在NP TMEM100表达水平的降低。TMEM100上调表达,神经胶质细胞的激活和炎症介质可以减轻疼痛。我们相信TMEM100可能有助于治疗NP。

数据可用性

所有可用的数据和材料可以从昭阳郭、朱郭,Zuoran粉丝,红飞,小林吴、陈Bohua合理的请求。

信息披露

一个预印本曾发表(https://www.researchsquare.com/article/rs-2358317/v1][50]。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

小林,朱郭、Bohua陈和红飞香贡献在设计的实验中,朱Youfu Zuoran球迷贡献了文献检索,昭阳郭、Huifei崔,原液,Zuoran粉丝贡献进行实验,Huifei崔,朱郭,少林,在数据分析和娜娜盛,昭阳郭、朱郭,在手稿写红飞香了,小林吴,红飞,娜娜沈,小颖气,Bohua陈在手稿评论。Huifei崔、朝阳郭和朱郭本研究同样起到了推波助澜的作用。

确认

这项工作是由中国国家自然科学基金(82172478);年轻的泰山学者计划(tsqn201909190);山东高等教育年轻的科技支持计划(2021 kj048);中国博士后科学基金会(2022 t150340;2021 m701813);青岛博士后应用研究项目(2020);青岛大学医学院青年人才援助计划;创新基金的国家整形外科和体育康复临床医学研究中心(2021 - ncrc cxjj - zh型- 02)。