文摘

本研究探讨T细胞亚群的作用以及相关的小分子核糖核酸的表达在怀孕早期复发患者损失(EPL)。五十EPL患者损失2018年5月到2021年5月被随机选中EPL集团和50名正常孕妇怀孕或正常交付成果被随机选为对照组。T细胞的表达水平subset-related标记和T细胞subset-related microrna,除了T细胞亚群的频率,在两组外周血进行了分析。T闲暇的标记,结果表明,转录表达水平的监管机构TBX-21 (T-bet)和干扰素调节因子4 (IRF4)显著调节患者的外周血EPL集团( ),而叫结合蛋白的表达水平3 (GATA3)和激素性肿瘤坏死因子受体(GITR)显著下调( )。在EPL组,mir - 106 b的表达,mir - 93, mir-25调节( , ,和 ,分别)调节性T (Treg)闲暇的T细胞的子集,而mir - 146 a的表达和mir - 155表达下调( )。Treg的频率和疲惫的T细胞在EPL组明显低于对照组( )。辅助T细胞频率的17 Th17细胞和疲惫Treg细胞在EPL组明显高于对照组( )。总之,免疫细胞和相关的microrna的概要文件可作为预后生物标记人类生殖疾病的治疗,如EPL。

1。介绍

怀孕早期流产(EPL)被定义为损失妊娠12周内,包括流产和生化妊娠丢失(1]。EPL,包括自发流产,最常见的类型的EPL,胚胎流产、宫内胎儿死亡,占大约80%的怀孕的损失(2]。EPL复发是一个主要关注的焦点在人类生殖和许多研究由于其复杂的病因、预后不良,影响孕妇的身心健康3]。免疫异常,主要是T细胞亚群及相关microrna的异常,已知EPL的发生中发挥重要作用[4,5]。

研究表明,调节性T (Treg)细胞免疫调节过程中发挥重要作用,子宫中的胎儿的生存6,7]。17 (Th17)辅助T细胞,新公认的效应辅助T细胞亚群,有能力促进宿主防御细胞外的病原体和调节炎症,慢性,和自身免疫性疾病6,7]。最近的一项研究表明,Th17和Treg细胞不仅紧密相关成功怀孕怀孕也有障碍,如子痫前期(PE)和复发性自然流产(RSA)的频率Treg细胞减少,Th17细胞的频率增加8]。哈德菲尔德等人,麦克拉肯等人发现,在怀孕的第三个三个月,不能挂载足够Th1反应导致减少的表达Th1转录监管机构TBX-21 (T-bet) [9,10]。他们还表明,调整T-bet在T细胞表达细胞因子合成恢复。

近年来一些研究表明,与正常怀孕,microrna在液和等离子体的RSA患者显示显著变化(11,12],mir - 559, mir - 146 b - 5 - p, mir - 320 b和mir - 221 - 3 - p明显调节,而mir - 101 - 3 - p明显下调。这一发现表明,microrna能调节RSA通过各种潜在的机制涉及到不同的目标基因和结合位点。然而,具体的机制尚不清楚,需要进一步的探索。刘等人发现mir - 93的表达和目标B细胞lymphoma-2-like 2 (BCL2L2)增加绒毛膜绒毛的RSA患者与正常妊娠妇女相比,BCL2L2表达负面影响细胞凋亡的平衡,细胞增殖,迁移和入侵,促进RSA的发展13]。其他研究表明,mir - 155 - 5 - p规范RSA通过激活的核因子kappa-light-chain-enhancer激活B细胞信号通路(14]。和mir - 155 - 5 - p的过度之后,降低炎性细胞因子的释放,包括白介素- 6 (IL)、干扰素-γ(IFN -γ)、肿瘤坏死因子-α,从蜕膜基质细胞il - 10,从而抑制蜕膜基质细胞的凋亡14]。

在这项研究中,我们研究了T细胞的作用在发病机理的RPL子集通过评估T细胞的数量,相关的转录因子,microrna针对这些转录因子。结果提供数据,可能援助RPL的治疗和预防。

2。材料和方法

2.1。伦理批准

参与者被告知和自愿同意参加研究。这项研究符合赫尔辛基宣言的道德要求,医学伦理委员会批准的秦皇岛妇幼保健医院。获得书面同意之前进行研究。

2.2。入选标准

18-41岁孕妇的临床诊断复发性EPL,没有配偶精液质量检测异常情况也参与了这项研究。复发EPL指两个或两个以上的流产怀孕前12周(15]。

2.3。排除标准

孕妇有严重的染色体异常,获得性免疫缺陷综合症,乙型肝炎、丙型肝炎和慢性疾病被排除在外,除了那些历史的长期连续用药控制,哮喘,药物过敏,颈椎功能障碍和子宫畸形,吸烟和酗酒,肿瘤等恶性疾病。这些未满18岁或以上41年也被排除在外。

2.4。通用数据

五十个EPL复发患者呈现给我们医院2018年5月到2021年5月,满足入选标准被随机选中EPL集团和另一个50名正常孕妇与正常怀孕或分娩被随机选择作为对照组。没有显著差异( )两组间的年龄、国籍、平价,身体质量指数,或其他通用数据(表1)。

表1
比较两组的通用数据。
2.5。评估和自然杀伤(NK)细胞表达的检测频率

NK细胞的细胞毒性评估通过流式细胞术使用K562细胞目标。首先,外周血单核细胞(PBMCs)孤立和孵化prestained K562靶细胞和碘化propidium 37°C和5%的公司2为2小时。效应细胞,PBMCs用来杀死靶细胞,和死细胞然后permeabilized propidium碘。

PBMCs第一次被孤立,然后洗两次磷酸盐。PBMC染色,三色免疫荧光分析淋巴细胞标记使用抗体免疫荧光测定。异硫氰酸荧光染料用于三色免疫荧光分析,藻红蛋白,和allophycocyanin anti-CD3(美国Abcam猫。不。美国ab237453)、anti-CD16 (Abcam猫。不。ab117117)和anti-CD56(美国Abcam猫。不。ab237383)用异硫氰酸荧光素标记的抗体。在外周血NK细胞由CD3、CD56、CD16细胞。 PBMCs were used in this study when the cellular value and cytotoxicity of NK cells were greater than 14% and 15%, respectively. The frequencies of Th1 and Th2 cells were assessed using flow cytometry fluorescein isothiocyanate- (FITC-) labeled anti-IFN-γ(美国BioLegend猫。不。美国308703年)和anti-IL-4-PE (BioLegend猫。不。355005)和包含在分析当Th1 / Th2比率大于10.7% (16,17]。

2.6。测量的microrna的表达水平T闲暇的标记

从使用RNX-PLUS PBMCs总RNA分离,使用逆转录酶互补脱氧核糖核酸合成装备。T细胞相关因素,T-bet,转录因子GATA-binding蛋白3 (GATA3)、干扰素调节因子4 (IRF4),激素性肿瘤坏死因子(GITR)和肿瘤坏死因子受体超家族18使用rt - pcr进行评估。引物和参考基因如表所示2。β肌动蛋白是用作参考基因,microrna的水平计算的比率目标microrna基因参考基因。相对表达规范化和作为相对比对照组的基因。

表2
目标和参考基因的引物序列。
2.7。microrna与T细胞相关评价子集

相关的microrna Treg (mir - 106 - b - 93 - 25, mir - 146 a,和mir - 155)和Th17 PBMCs (mir - 326)细胞进行评估通过rt - pcr LightCycler 2.0 rt - pcr系统。引物和参考基因如表所示3。RNU6B用作参考基因,microrna的水平计算的比率目标microrna基因参考基因。相对表达规范化和作为相对比对照组的基因。

表3
microrna和参考基因的引物序列。
2.8。T细胞亚群的评估频率

Th17计数,Treg,疲惫的T,筋疲力尽Treg细胞用流式细胞仪进行。表面和胞内抗原的单克隆抗体用于计数Th17细胞CD4-FITC(美国BioLegend猫。不。美国357405年)和IL-17A-PE (BioLegend猫。不。506903),和CD4-FITC(美国BioLegend猫。不。357405),CD25-PE(美国BioLegend猫。不。985802),和CD127-PerCP-Cy5.5(美国BioLegend猫。 no. 351321) were used for Treg cells; CD8-FITC (BioLegend, US, cat. no. 980908), PD-1-PerCP-Cy5.5 (BioLegend, US, cat. no. 329913), and Tim-3-PE (BioLegend, US, cat. no. 345006) for exhausted T cells; and CD4-FITC (BioLegend, US, cat. no. 357405), CD25-PE (BioLegend, US, cat. no. 985802), and PD1-PerCP-Cy5.5 (BioLegend, US, cat. no. 329913) for exhausted Treg cells [18]。

2.9。统计方法

采用SPSS 22.0统计软件进行统计分析。数据表示为 偏差,学生的 - - - - - -测试或卡方检验被用于群体间的比较。统计数据表示为比率,由卡方检验和数据处理。 被认为是一个重要的区别。

3所示。结果

3.1。T闲暇的标记的表达水平在两组

T细胞subset-related基因的表达水平在PBMCs两组进行比较。结果显示T-bet mRNA表达水平存在显著差异,GATA3 IRF4, GITR ( )(图1)。与对照组相比,T-bet的信使rna表达水平和IRF-4 PBMCs EPL组显著调节( ),而那些GATA3和GITR显著下调( )。

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(d)
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图1
表达T闲暇的标记在EPL PBMCs和对照组。(一)T-bet, (b) IRF 4, (c) GATA3, GITR (d)。 表明 值小于0.05。
3.2。T细胞Subpopulation-Associated microrna的表达水平两组

分析Treg闲暇的microrna透露miR-25显著增加,mir - 106 b, mir - 93表达在EPL集团的价格相比对照组( )。此外,mir - 146 a的表达和mir - 155 PBMCs EPL组显著表达下调与比对照组( )。然而,mir - 326的表达,调节对Th17细胞分化[19),在EPL PBMCs组与对照组没有显著不同(图2)。

(一)
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(f)
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图2
T细胞subset-related microrna的表达两组。mir - 106 b (a)、(b) mir - 93 (c) miR-25, mir - 146 a (d), mir - 155 (e), mir - 326 (f)。 表明 值小于0.05。
3.3。流式细胞术分析T细胞亚群频率的两组

流式细胞术结果显示外周血Treg细胞的频率和疲惫的T细胞在EPL组明显低于对照组( )。Th17细胞的频率和疲惫Treg细胞在外周血EPL组显著增加,相比之下,比对照组( )(图3)。

(一)
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图3
T细胞的频率在两组子集。(一)Treg细胞(b) Th17细胞,(c)疲惫的T细胞,(d)精疲力竭Treg细胞。 表明 值小于0.05。

4所示。讨论

EPL的发病率在正常生育年龄的妇女大约是1 - 3%,原因主要是与染色体,内分泌,解剖、感染和免疫异常6,7]。然而,在大多数情况下,EPL仍然无法解释的原因。近年来,一些研究调查反复EPL的各个方面,包括与叶酸代谢相关的基因(20.),氧化应激水平,精子DNA损伤(6在孕妇),先天性子宫畸形,获得性凝血功能障碍,所有这些都取得了突破。

EPL复发可能与T细胞亚群及其相关microrna。为了阐明这个问题,本研究调查了T细胞的表达及其相关子集microrna在EPL复发患者。以前的研究报道,CD4细胞+CD25+,Treg细胞外周淋巴细胞中表达下调和中期女性流产的淋巴细胞21,22]。研究还表明,Th17细胞在外周血淋巴细胞的频率和中期淋巴细胞增加与复发性流产的女性相比,在正常妊娠妇女(23]。此外,Th17之间的负相关和Treg这些患者的外周血淋巴细胞被发现(23]。Th17 / Treg增加女性的比例与EPL,标志着促炎反应,这可能是伴随着减少监管反应,可能导致RPL[的发展24]。在这项研究中,Th17的表达频率在EPL组高于对照组,而Treg细胞的表达与对照组相比呈下降趋势,这是与以往的研究一致24]。此前报道,mir - 155诱导分化的Treg Th17,以及IL-17A Th17细胞所分泌,而它没有显著影响Treg-related分泌的细胞因子(25]。此外,mir - 146——已被证明是必不可少的Treg细胞的抑制作用,与监管的Th1反应控制mir - 146 a表达Treg细胞(26]。此外,mir - 146 a可以抑制Treg细胞Th1-like细胞的变换。在PBMCs cocultured与结直肠癌细胞,mir - 146 a Treg细胞的数量增加,抑制细胞因子有关,如转化生长因子-β(TGF -β)和il - 10 (26,27]。根据我们的结果,mir - 155的表达和mir - 146似乎降低了患者的复发EPL,这可能与减少病人的Treg细胞数量。研究表明,Treg细胞的数量减少鼠标怀孕损失模型和不明原因复发性流产患者(28,29日]。

mir - 106 - b - 93 - 25集群中扮演着关键角色的监管TGF -β信号通路,它是一个重要的细胞因子诱导的Foxp3 Treg细胞生产。Foxp3被发现是一个转录因子,发挥关键作用在控制炎症的30.]。增加mir - 106 b - 25的表达式可能会扰乱TGF -β信号通路,它扮演着一个重要的角色在维持功能和诱导Treg细胞的生成。我们的结果显示Treg细胞数量的减少和增加的转录水平mir - 106 - b - 93 - 25集群在EPL的病人的外周血组。我们推测,有一个明确的联系,mir - 106 - b - 93 - 25控制Treg细胞力学生物学的EPL的女性(31日- - - - - -33]。

这项研究的结果显示无法控制炎症微环境在EPL集团,表现出Th17频率的增加以及疲惫Treg细胞和增加mRNA的表达T-bet IRF-4外周血。在这项研究中,未能抑制炎症随后Treg的频率,减少疲惫的T细胞,以及减少mRNA的表达GATA3 GITR。以上因素影响妊娠的负面表达过程和可能导致流产。因此,免疫参数及其表观遗传因素有关,如Th17的频率和疲惫Treg细胞和T细胞相关因素的表达,可以作为预后生物标记,防止免疫高危流产的女性。

总之,在怀孕期间,监管和控制免疫系统,抑制机制可能通过microrna。免疫系统的失调可能会导致拒绝胚胎和EPL。在这项研究中,我们比较T闲暇的标记在EPL复发患者外周血和妇女与正常怀孕。结果表明,T-bet和IRF4的表达显著调节,而GATA3的表达和GITR显著下调。在Treg细胞相关microrna的T细胞亚群,在EPL组,mir - 106 b的表达,mir - 93, miR-25调节,而mir - 146 a的表达和mir - 155表达下调。与对照组相比,Treg和疲惫的T细胞的频率减少,而那些Th17和疲惫的EPL组Treg细胞增加。有显著差异的表达和频率T细胞及其相关子集microrna在两组。因此,免疫细胞及其相关microrna的可以用作治疗预后的生物标记的人类生殖障碍的临床研究。

数据可用性

这个手稿的数据可从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

这项研究得到了河北省科学技术厅(201902 a211)。