文摘
本研究的目的是探索改变等离子体的临床价值mir-21表达水平作为生物标志物评估冠状动脉疾病(CAD)的严重程度及其分子对HUVEC细胞损伤的影响。血管摄影证实56艘船只的CAD疾病患者,92例double-vessel CAD、139复杂冠状动脉狭窄患者,56健康人( )参加本研究。等离子mir-21的表情显然和逐步提高而PDCD4水平显著和稳定低单、双、多血管闭塞的CAD患者比健康的参与者( )。的相对表达mir-21 hypoxia-reoxygenation -(人力资源)暴露HUVECs明显调节,但PDCD4浓度明显表达下调与正常相比控制细胞( )。此外,改变循环mir-21表达水平能够明显区分单- 0.893 (AUC),双- 0.914 (AUC),多血管狭窄CAD (AUC 0.933)患者健康的主题。此外,等离子体mir-21表达式在老年人(66 - 85年)组显著高于年轻的年龄(25-45年)科目。Caspase-3和活性氧表达水平明显升高,但细胞生存能力明显下降HR-induced HUVECs比在常氧细胞( )。相比之下,mir-21抑制明显减少caspase-3活动和ROS浓度,显著改善HUVEC细胞生存能力的人力资源条件。PDCD4表达式HR-exposed HUVECs显著降低而mir-21抑制显著增强PDCD4水平( )。调节等离子体mir-21是宝贵的临床生物标志物的检测冠状动脉狭窄的严重程度患者。循环mir-21浓度升高与衰老有正相关。抑制mir-21明显增加HUVEC细胞生存能力通过upregulation针对PDCD4和推荐新的可能的治疗分子CAD患者的管理。
1。介绍
动脉粥样硬化冠状动脉疾病(CAD)的主要原因是世界上各民族的成年人意外死亡。由于不健康的生活方式的高发病率,往往不佳主要治疗动脉粥样硬化的风险因素,并产生重大影响的基因,未来10年内,大约12% CAD患病率将会增加(1]。早期诊断与先进的管理和充足的CAD风险因素的控制将大大减少CAD-associated死亡发生率显著降低住院率和经济负担。目前,侵入性冠状动脉造影(CAG)和经皮冠状动脉介入(PCI)广泛可靠的临床技术用于缺血性冠心病、评估和管理。然而,入侵CAG有一些手术并发症和技术,它并不适合所有患者,尤其是老年慢性肾脏疾病患者。此外,PCI管理也不适合多血管闭塞的CAD患者,即使在复杂的左主干病变动脉(LM) CAD科目。因此,非侵入式通用早期诊断的生物标志物和新的治疗药物临床心脏病专家所要求的。
小分子核糖核酸(microrna大鹏)是高度保守的,内生,单链,小约18 - 24个核苷酸的非编码rna长度调节基因表达的翻译通过抑制信使rna (mrna)或信使rna的降解。近年来,一些研究已经证实,各种microrna在整个心血管生理学和直接监管也表现出一个重要的角色在许多心血管疾病过程包括CAD。冠状动脉疾病通常发生由于慢性lipid-induced动脉粥样硬化炎症在动脉壁,和几个atherosclerotic-related microrna (mir - 342 - 5 - p, mir - 217, mir - 126, mir - 155,和mir - 92 - a - 3 - p)是非常相关的形成和随后的冠状动脉粥样硬化性斑块破裂2- - - - - -4]。
据报道,特异表达mir-21实质上是涉及内皮功能障碍,早期促进动脉粥样硬化斑块的进展,形成重要的冠状动脉狭窄和血栓导致急性冠脉综合征通过激活不同的炎症细胞,细胞因子和信号通路包括巨噬细胞、肿瘤坏死因子-α(肿瘤坏死因子-α)、白介素- 17 (IL), IL - 1β、il - 6、磷酸酶和tensin同族体(PTEN), PI3K / Akt MAPK、血管内皮生长因子和TLR4 / NF -κB (5- - - - - -9]。
程序性细胞死亡4 (PDCD4)蛋白最初发现小说作为一个调节基因在细胞凋亡过程中,它充当一个监管机构影响基因表达的翻译和转录过程。它最近被证明PDCD4广泛表达于心肌细胞,血管平滑肌细胞和内皮细胞,并直接PDCD4监管各种炎症通路包括脂肪炎症,血管内皮功能障碍,泡沫细胞的形成,并通过改变动脉粥样硬化不同细胞因子表达式,如白细胞介素- 10”(il - 10), IL-17, il - 6、il - 1β,引发核factor-kappa (NF - Bκ肿瘤坏死因子-α(TNF - B)α),NOTCH1。此外,新兴证据表明PDCD4直接参与冠状动脉粥样硬化性斑块的形成,及其表达水平明显减毒在动脉粥样硬化冠状动脉疾病(5,10- - - - - -12]。
此外,我们之前的研究和其他研究也表明,循环mir-21表达模式显然是改变重不重要冠状动脉狭窄,不稳定性心绞痛、急性冠脉综合征与老化(与一个强大的关系7,8,13,14]。探索,hypoxia-reoxygenation——(人力资源)诱导人脐静脉内皮细胞(HUVEC)损害明显阻止通过调节SMAD7 miR-21表达的抑制作用。邵等人发现抑制剂mir-21显著减少了动脉粥样硬化病变区域的愤怒/ NADPH信号通路通过调节ADAM10表达式在老鼠模型中,提出一种新的治疗目标治疗动脉粥样硬化疾病。另一项研究表明,抑制mir-21保护心肌细胞凋亡和减毒梗塞大小细胞和小鼠模型的AMI通过调节PDCD4表达式,为AMI治疗提供新的治疗策略(15- - - - - -17]。
然而,mir-21之间的关系和PDCD4在冠状动脉病变的严重程度和HR-induced HUVEC细胞损伤还有待阐明。研究的目的进行管制的影响循环mir-21浓度在冠状动脉狭窄患者和分类披露其分子保护机制对H / R-induced HUVEC细胞损伤。
2。材料和方法
2.1。研究对象
血管摄影证实56 single-coronary动脉狭窄,92 dual-vessel狭窄,56 139多血管阻塞CAD患者和健康志愿者收集2016年1月至2017年5月从1圣附属湘雅医院,中南大学。CAD是认为如果观察冠状动脉封锁≥50%通过侵入性冠状动脉造影两种介入心脏病学家。艘船只的疾病定义当一个主要冠状动脉(小伙子、LCX和RCA)动脉闭塞,dual-vessel疾病被认为是当两个单独主要冠状动脉或左主干阻塞动脉闭塞(LM),和多支病变CAD患者分类当两个或两个以上主要包括他们的分支闭塞的冠状动脉。急性或慢性心力衰竭、急性冠脉综合征、中风、起搏器植入ICD,冠状血管再生的支架或心脏手术(CABG)、心肌病和肺动脉高压患者排除在本研究之外。个人没有心血管疾病的历史,慢性肾功能不全、慢性肝脏或其他多系统炎症性疾病或恶性肿瘤被招募为健康的参与者。在这项研究中,从所有人类研究对象,得到书面知情同意,这项研究是由人类研究协议后在《赫尔辛基宣言》。人类和细胞综述了本研究的调查和伦理委员会批准湘雅医院,中南大学,5毫升外周静脉血样在EDTA-coated通过经皮肘静脉穿刺管所有的参与者。
2.2。细胞培养、转染和Dual-Luciferase HUVEC的报告基因分析
主要的人类脐静脉内皮细胞(HUVEC)行购自中国科学院(中国上海)和培养12-well板的密度 细胞/使用杜尔贝科的修改鹰的介质(DMEM)补充20%胎牛血清的边后卫在细胞培养和维护常氧条件37°C, 5%的公司2,95%的空气。hypoxia-reoxygenation(人力资源)模型建立了收获HUVECs厌氧模块化孵化器中含95% N2,5%的公司2,1%的人啊2使用血清和glucose-free DMEM 12小时;之后,细胞在常氧孵化器reoxygenated 6小时。HUVECs与has-inhibitory-miR-21转染抑制(100 nmol / L),和has-inhibitory-negative控制(数控)mir-21 (100 nmol / L) (RiboBio、广州、中国)作为内部控制通过使用Lipofectamine 2000转染剂(美国表达载体);更多的细节都显示在我方之前的研究(14,18,19]。
荧光素酶报告基因分析技术被用来证实mir-21的目标基因。的互补序列3 - - - - - -UTR PDCD4的预测与mir-21 TargetScan (http://www.targetscan.org/)。Lipofectamine 2000试剂和has-inhibitory和消极controls-mir-21用于HUVECs的转染和dual-luciferase基因分析化学(Beyotime、江苏、中国)申请HUVEC的测定荧光素酶活动规范化Renilla和荧光活动被用于测量的比率。
2.3。细胞内ROS、Caspase-3活动和细胞生存能力分析
健康、hypoxia-reoxygenation和转染HUVEC细胞ROS浓度演示了通过添加5μM dichlorodihydrofluorescein二乙酸(DCFH-DA)解决方案到每个96 -黑色板适当增长的细胞,接种后30分钟37°C。之后,两次细胞被PBS清洗,最后,ROS值测量使用紫外线SpectraMax标(分子器件、桑尼维尔CA)在波长490纳米。
Caspase-3使用Caspase-3活动活动是由比色箱根据制造商的指导方针(Beyotime、上海、中国)。此外,100毫升水中caspase-3衬底被添加到每个正常和96孔板HUVECs治疗。所有的样品都在37°C孵化2小时,和caspase-3表达水平进行评估通过一个微型板块SpectraMax吸光度读者(分子器件、桑尼维尔CA)的波长405 nm。
细胞生存和扩散评估通过CCK-8工具包(Beyotime、上海、中国)遵循公司的协议。HUVECs被种植到96 -孔板;适当的治疗后,10毫升CCK-8试剂混合,接种在37°C 2小时;正常的,人力资源,人力资源+治疗HUVECs被PBS洗两次;随后,细胞活力检测的波长450 nm通过使用SpectraMax(分子器件、桑尼维尔CA)吸光度读者微型板块。
2.4。microrna的检测和mRNA水平
纯rna提取试剂盒解决方案从人血浆循环正常,人力资源,人力资源与转染HUVECs(表达载体、钙、美国)。hsa-mir-21,抑制和消极的控制(数控)mir-21, mir - 156 a和内部参考设计的引物被广州RiboBio(中国)。PDCD4和内源性引用的引物β肌动蛋白是从上海(中国)生物技术获得的。靶蛋白引物序列展示在表1。此外,总共4μL纯RNA (OD: 1.8 - -2.2,核酸浓度:50 - 500人μg)是reverse-transcribed (RT) cDNA 42°C 30分钟使用凸环miRNA-specific逆转录引物(RiboBio、广州、中国)按照制造商的指示通过RT - pcr系统(美国Bio-Rad)。随后,2μL互补dna作为模板的实时定量PCR反应的热参数:初始孵化15秒的95°C,紧随其后的是40周期在95°C的变性5 s和退火和延伸60°C为31。mir-21浓度的相对表达式和PDCD4水平进行了分析与掌握混合SYBR绿色存在试剂(豆类生物,大连,中国)通过一个7300实时PCR系统(美国应用生物系统公司,热费希尔科学。)。此外,RNA microrna的隔离和存在程序和mRNA表达更多的讨论在我们之前的研究(18,19]。
2.5。统计数据分析
在这项研究的所有数据都表示为 (SD)或扫描电镜,至少三个独立的实验研究为每个数据通过SPSS 22.0和8.0 GraphPad棱镜和分析。分析两组内的连续变异,2-tailed学生 - - - - - -测试和非参数Mann-Whitney测试进行分类的变化,费舍尔和卡方( )测试实施,以上两组之间的差异是由单向方差分析测量(方差分析)。mir-21的敏感性和特异性,考察了一个生化标记接受者操作特征(ROC)曲线分析方法。的值 被认为是表明一个统计上的显著差异。
3所示。结果
3.1。所有研究对象的基线临床和实验室信息
有56例(35岁男性,女性21日)与艘船只阻止CAD、92(52岁男性,40雌性)dual-vessel病变CAD患者,139例患者(76名男性,63名女性)多血管闭塞的CAD、56(28雄性,雌性28日)协调良好的性别和年龄健康个体参与这项研究的人,和他们的( )基线临床特征展示在表2。血脂水平(低密度脂蛋白,高密度脂蛋白、TC、TG)、血清肌酐和c反应蛋白值高出相当多血管冠心病患者比健康的主题。然而,其他临床资料中健康、单,双,和复杂的病变CAD对象并不显著(表2)。
3.2。mir-21的表达,在等离子体和HUVECs PDCD4
循环血浆的表情mir-21单水平逐渐升高,双核,多血管闭塞的稳定CAD患者与健康人相比。最高层mir-21 complex-vessel病变中发现了CAD组与双,艘船只的CAD课程相比,他们具有统计学意义( )(图1(一))。相对mir-21表达式在缺氧复氧-(人力资源)暴露HUVECs显著调节3.4倍( )相比在正常atmospheric-cultured健康细胞( )( )(图1 (b))。循环PDCD4逐渐减少的表情艘船只的狭窄和双,多血管闭塞的CAD组与健康受试者相比。的最低浓度PDCD4被记录在多血管冠心病组与双相比,艘船只的CAD组。此外,PDCD4表达式内不同CAD疾病组也明显显著( )(图1 (c))。在HR-induced HUVECs PDCD4水平明显下调了3.2倍( )相比在控制细胞( )( )(图1 (d))。
(一)
(b)
(c)
(d)
3.3。临床意义的等离子mir-21 CAD患者的评分
循环的临床作用mir-21检测CAD患者的严重程度是通过中华民国评估方法。艘船只的阻挡CAD课程、等离子mir-21表达式能够强烈歧视与健康受试者和突出的曲线下的面积(AUC)为0.893。在dual-vessel病变CAD患者中,循环mir-21水平显然是分开的健康参与者一个重要AUC为0.914。等离子mir-21浓度多血管阻塞CAD患者明显区别的对照组0.933 (AUC)具有高特异性和敏感性水平。等离子体的AUC曲线mir-21也明显重要和有很强的预测能力区分单、双、多血管阻塞CAD患者(图2)。这些研究结果表明,调节等离子体mir-21有重大的临床诊断作用CAD患者的严重程度进行分类。
(一)
(b)
(c)
3.4。表达谱mir-21 HUVECs和荧光素酶检测
的相对表达mir-21显著调节在HR-exposed HUVECs与健康相比控制细胞( )。相比之下,mir-21水平明显下调1.7倍( )在HR-injured HUVECs转染与抑制mir-21相比HR-incubated HUVECs ( ),但表达谱在消极的控制(NC)和HR-incubated组无意义的(图3(一个))。此外,目前的研究还表明,荧光素酶活性水平明显减少HR-incubated HUVECs 1.8倍( )与常氧细胞( ),但NC和人力资源组之间差异无显著意义。抑制mir-21强烈控制荧光素酶活动HR-injured HUVECs(图3 (b))。
(一)
(b)
3.5。抑制mir-21管制PDCD4表达和增强HUVEC的生存
PDCD4的相对表达水平显著下调在HR-injured HUVECs而他们显著调节接近控制抑制mir-21治疗。之间没有明显的效果被发现数控和hypoxic-reoxygenated——(人力资源)暴露HUVECs,表明PDCD4表达式在正常和强烈受抑制mir-21 HR-damaged HUVECs(图4(一))。
(一)
(b)
(c)
(d)
在HR-exposed HUVECs,细胞内活性氧的水平远高于正常培养细胞,而令人惊讶的是减少治疗HR-damaged HUVECs抑制mir-21。在人力资源和NC组没有显著影响了ROS的表情,表明抑制mir-21有重要作用,防止氧化应激HUVEC细胞伤害下人力资源情况(图4 (b))。Caspase-3活动显著升高HR-exposed HUVECs比正常细胞。相反,HR-induced HUVECs转染与抑制mir-21 caspase-3表达显著降低,但caspase-3表达式的活动无关紧要的NC和人力资源之间的表达,承认mir-21抑制本质上是对HUVEC细胞损伤保护参与人力资源条件(图4 (c))。HUVEC细胞生存能力显著降低HR-induced组相比,正常健康的细胞。另一方面,HR-exposed HUVECs mir-21抑制处理显著提高细胞生存能力而没有明显的变化被发现在数控和人力资源组;这些发现强烈建议抑制mir-21在细胞中起着基础性作用防止伤害在人力资源环境(图4 (d))。
3.6。等离子体mir-21表达式与衰老和性别
老年健康受试者(66 - 85年),循环血浆mir-21浓度相对高于年轻健康的参与者(男性年)( )(图5(一个))。在单、双、complex-vessel阻挡CAD老年年龄(66 - 85年)人,mir-21表情显著增加,相比之下,那些在年轻的年龄(男性年)人( )(数据5 (b)- - - - - -5 (d))。然而,在两性之间的健康和单、双、多血管狭窄和CAD组血浆mir-21水平是不重要的( )(数据5 (e)- - - - - -5 (h))。这些发现表明,调节mir-21表情一直积极和强烈与衰老有关。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(h)
4所示。讨论
促进健康的生活方式和早期评价直接适当的治疗可以显著下降CAD死亡发生率。内皮功能障碍和各种炎症介质的主要分子见解发展动脉粥样硬化性心脏病。在过去的二十年里,越来越多的证据说明,微起着至关重要的作用在调节内皮损伤,动脉粥样硬化,和细胞凋亡。
这项研究的临床意义进行了探讨mir-21 CAD患者动脉粥样硬化的严重程度,并与PDCD4及其预防的作用在HR-exposed HUVEC细胞损伤。目前的研究发现mir-21表情明显和稳定调节等离子体的单,双,和complex-vessel病变CAD患者与健康对照组相比。PDCD4的等离子体表达逐渐减少单一、双核、多血管狭窄CAD参与者与正常个体。重不重要冠状动脉狭窄的mir-21浓度高出显然被洗巴等人的研究小组(13]。我们之前稳定CAD研究对象表现出显著调节循环mir-21浓度相比,健康受试者(14]。此外,PDCD4 AMI大鼠模型中的表达水平与对照组相比显然是低周报告等。20.]。
等离子体的临床意义mir-21 CAD的严重程度的预测被ROC曲线评价分析。单、双、多支CAD狭窄患者能够显著分化(AUC为0.893、0.914和0.933,分别)从健康控制参与者和他们的差异具有显著的统计学在子组。这些研究结果表明,调节循环mir-21可以作为非侵入性诊断狭窄的临床检测潜在的标志物水平CAD主题,同时,类似的一些临床实验报告的结果是(14,21,22]。
目前的研究报道,多血管冠心病患者的血脂和血清肌酸值与健康对照组相比均有显著升高,但组内差异显著。c反应蛋白浓度的单,双,和complex-vessel病变CAD患者显著高于健康人群。我们之前的研究也表明,高c反应蛋白水平有一个强大的协会与稳定和不稳定心绞痛患者,需要进一步的分子研究发现他们的未开发的信号通路14,19]。
这项研究还显示,mir-21表情显然是增加与年轻人相比,老年学科提出一个重要的链接与衰老过程。王等人以及我们之前的研究已经确定了在老年人mir-21显著升高和协会cardiorenal综合症和老化14,23]。
它建立了PDCD4至关重要在调节氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)新陈代谢,泡沫细胞形成,冠状动脉粥样硬化,压力,缺血/ reperfusion-induced细胞损伤(10- - - - - -12,24]。从我们的荧光素酶分析实验结果,从TargetScan数据库,也从其他研究,证实PDCD4 miR-21的直接目标蛋白(20.,24,25]。本研究发现表情的mir-21 HR-exposed HUVECs是高度调节与对照组相比,但没有明显效果指出数控与人力资源组。张等人也适度支持本研究[15]。此外,目前的研究表明,PDCD4表情显然是减少HR-incubated HUVECs当他们与mir-21抑制使转染后明显升高。的细胞内活性氧的生产水平HR-induced HUVECs显著调节,但附近显著回落到正常水平后对待mir-21抑制。Caspase-3活动HR-cultured HUVECs极大地提升,但与mir-21抑制使转染后明显减少。周等人发现通过针对PDCD4 mir-21-regulated心肌细胞凋亡,相对支持本研究[20.]。除此之外,目前的研究证实细胞生存和增殖明显下降HR-induced HUVECs与正常培养细胞但相比显著提高mir-21抑制处理后细胞的可行性。所有这些结果证实mir-21抑制可以防止HR-induced HUVEC细胞损伤和提出了一个新的潜在的CAD患者治疗目标。
然而,分子mir-21与血脂水平和c反应蛋白之间的关系并不是调查在这项研究中,需要进一步的研究。此外,这是一个三级相对较小的样本容量单一医院一个民族人口研究。因此,不同种族multiregional大以人群为基础的临床队列的实验将在未来进行理性的临床重要性循环miR-21尽可能理想的有用的早期无创性诊断工具和缺血性心脏病的治疗管理代理。
5。结论
>增加等离子体mir-21表达水平可能是一种新型生物标志物对冠状动脉狭窄的严重程度和相关性与衰老,和mir-21抑制防止HUVEC细胞损伤下通过针对PDCD4 hypoxia-reoxygenation侮辱,暗示治疗动脉粥样硬化CAD患者的潜在目标。
数据可用性
数据请求。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
确认
这项工作是由院长以来Jouf大学科学研究在批准号域- 2021 - 01 - 03161。作者真诚地承认范李博士,夏柯博士教授杨添Lun,湘雅医院的心血管单位的优秀支持本研究也是感激Jouf大学内科系。