文摘

格列本脲显示抗炎反应各种肺部疾病,但其确切作用在脂多糖(LPS)诱导急性肺损伤(ALI)和急性呼吸窘迫综合征(ARDS)是未知的。在此,我们旨在探讨格列本脲的作用在活体内和体外LPS-induced阿里在小鼠模型的发展。LPS刺激导致肺损伤评分增加,干/湿比、肺毛细血管通透性,以及总蛋白浓度,炎症细胞和炎症细胞因子包括il - 1β地震在支气管肺泡灌洗液(BALF)和肺组织,而格列本脲治疗减少了这些变化。同时,NLRP3蛋白质的增加和Caspase-1 / p20 LPS滴剂后肺部被格列本脲表达下调。同样,在体外实验中还发现,格列本脲政府抑制LPS-induced upregulations在细胞因子il - 1的分泌β和地震,以及组件的表达NLRP3 inflammasome在小鼠腹腔巨噬细胞。值得注意的是,格列本脲对肿瘤坏死因子的分泌——没有影响α体内和体外,暗示其抗炎效应是相对特定NLRP3 inflammasome。总之,格列本脲减轻LPS-induced阿里的发展在一个小鼠模型通过抑制NLRP3 / Caspase-1 / il - 1β信号通路,这可能提供一种新的治疗策略LPS-induced阿里。

1。介绍

急性肺损伤(ALI)和急性呼吸窘迫综合征(ARDS)中的一个常见疾病重症监护室(ICU),有偏见的炎症反应的结果是各种原因包括脓毒症、创伤,和通风1- - - - - -3]。尽管支持性治疗和重症监护发展,没有有效的药物治疗和临床预后的ALI / ARDS仍然贫困具有高发病率和死亡率(1,3]。因此,进一步探索底层机制和潜在的治疗方法对ALI / ARDS是必要的和紧迫的。

NLRs NLRP3,属于一个家庭,是一个直接的先天免疫系统的反应。是假定一个两步机制所需的全部激活NLRP3 inflammasome [4]。是一个启动的第一步,是由其分子模式(pamp)或有关的分子模式(抑制),导致pro-IL-1 upregulationsβ、pro-IL-18 inflammasome的组件。第二个是一个激活步骤这些组件的装配成inflammasome结构,然后生产成熟的促炎白细胞介素。最近的研究描述的功能NLRP3 inflammasome在各种肺部疾病,包括呼吸道感染、慢性阻塞性肺病、哮喘(5,6]。目前的角色NLRP3 inflammasome发展的多种类型的阿里也报道,和主要致病机制包括以下几点:(1)渗透率的增加肺泡上皮屏障功能障碍;(2)生产过剩的细胞因子il - 6、il - 1β和肿瘤坏死因子-α;和(3)参与组织重构和肺纤维化晚期的阿里7- - - - - -9]。这些结果暗示NLRP3 inflammasome参与ALI / ARDS的发病机制。

格列本脲,除了作为一种降糖药物,显示抗炎作用在许多呼吸道疾病,泌尿,心脏和中枢神经系统10]。鉴于ALI / ARDS视为炎症紊乱和格列本脲的抗炎活性,因此,格列本脲可能对ALI / ARDS的发展理论。事实上,大量的研究表明,格列本脲涉及炎症的规定在阿里的不同动物模型,包括油酸、臭氧、辐射、出血性休克和ventilator-induced阿里(11- - - - - -14]。但是,没有这样的研究报告涉及的角色在LPS-induced阿里格列本脲。有限合伙人,革兰氏阴性细菌的外膜的主要组成部分,作为一个常见的原因在脓毒症的发病机制,感染性休克,sepsis-related ALI / ARDS [15]。此外,动物模型LPS-induced阿里被广泛用作临床相关的革兰氏阴性bacteria-related ALI / ARDS模型(16- - - - - -18]。因此,这将是重要的临床意义探讨格列本脲能否改善LPS-induced阿里。

综上所述,我们提出的假设格列本脲对LPS-induced ALI / ARDS有保护作用,可能与其抑制关联NLRP3 inflammasome信号通路。因此,我们在此试图通过体内和体外实验证实这一假说的小鼠模型LPS-induced阿里和首次发现,格列本脲缓解LPS-induced阿里的发展在一个小鼠模型通过抑制NLRP3 / Caspase-1 / il - 1β信号通路,这可能提供一种新的治疗策略LPS-induced阿里。

2。材料和方法

2.1。动物和研究设计

雄性C57BL / 6小鼠(6 - 8周)从上海购买SLAC实验动物有限公司有限公司(上海,中国)。所有实验程序依法进行了浙江大学动物实验室的伦理委员会。老鼠被分为四组( ):控制(Con)组、格列本脲(g)组,LPS组和有限合伙人+格列本脲(有限合伙人+ g)组。格列本脲(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)在DMSO溶液稀释100毫克/毫升浓度根据说明书。格列本脲LPS腹腔内3天前政府,而DMSO作为车辆。有限合伙人(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)与微量调节注射器注射到老鼠的气管建立ALI模型,在PBS用作车辆。在气管内的滴剂,老鼠一直垂直至少1分钟,以确保PBS的分布或有限合伙人在肺部。有限合伙人管理后24小时后,老鼠实验牺牲。支气管肺泡灌洗液(BALF)和PBS收集通过气管导管如我们之前所述研究[19]。离心后,上清液和细胞分离为进一步实验。肺组织收集进行进一步分析。

2.2。肺组织学和免疫组织化学分析

肺组织固定在4%多聚甲醛是嵌入在石蜡切片的厚度4μ米的苏木精和伊红染色())。组织学评分系统是用来评估肺损伤(11]。四个病理参数得分如前所述:(1)肺泡充血,出血(2),(3)白细胞浸润,和(4)肺泡壁厚度/透明膜形成。每个类别分级使用4-pointscale: 0:最小损伤,1:轻度损伤,2:中度损伤,和3:最大伤害。总组织学得分是表示为得分的总和为所有参数。每个鼠标准备评估的三个幻灯片。

免疫组织化学(包含IHC)来确定执行NLRP3的蛋白表达。石蜡部分为30分钟在62°C进行预处理,然后在二甲苯脱蜡、水化和清洗。过氧化氢溶液被用来抑制内源性过氧化物酶。一夜之间,部分被孵化在4°C anti-NLRP3抗体(Abclonal、武汉、中国)(1:100)。然后,膜是用磷酸盐生理盐水彻底清洗。二次抗体(图里,杭州,中国)添加和孵化30分钟的37°C。Diaminobenzidine补充道,与苏木精复染色反应形象化的部分产品。所有的部分都是半定量的分析了ImageJ软件。集成IOD /区域(密度的意思)是衡量评估染色在×200放大图像。每个鼠标准备评估的三个幻灯片。

2.3。实时定量聚合酶链反应(RT-qPCR)

从肺组织或细胞总RNA提取使用试剂盒(热费希尔科学)。互补脱氧核糖核酸合成使用互补脱氧核糖核酸合成装备(豆类、大连、辽宁、中国)后,制造商的指示。信使rna检测,β肌动蛋白是用作参考看家基因。实时PCR进行使用SYBR绿色(豆类)应用生物系统公司7500实时PCR系统(热费希尔科学)。使用的引物序列如下所示:鼠标NLRP3底漆:5 - - - - - -TCACAACTCGCCCAAGGAGGAA-3和鼠标NLRP3反义底漆:5 - - - - - -AAGAGACCACGGCAGAAGCTAG-3和鼠标β肌动蛋白上底漆:5 - - - - - -GGCTGTATTCCCCTCCATCG-3和鼠标β肌动蛋白反义底漆:5 - - - - - -CCAGTTGGTAACAATGCCATGT-3 。

2.4。免疫印迹分析

细胞或组织溶解产物在5×resuspended SDS加载缓冲区,随后在100°C的环境5分钟和离心机12000 g×10分钟。蛋白质浓度检测用BCA试验设备(热费希尔科学)。总共有20μg蛋白的组织或细胞溶解产物分离了sds - page凝胶(热费希尔科学),然后转移到聚乙二烯二氟化物(PVDF)膜(微孔)。膜被使用5%脱脂牛奶在室温下2 h,然后用适当的孵化主要抗体:anti-NLRP3 (Abclonal、武汉、中国)(1:1000)和anti-Caspase-1 (Abclonal、武汉、中国)(1:1000)在一夜之间阻断缓冲区4°C。反β肌动蛋白(HuaBio、上海、中国)(1:2000)是用作加载控制。与PBST洗涤三次后,细胞膜是孵化HRP-conjugated二级抗体室温为1.5 h。乐队被发现使用ECL工具包(MultiSciences,杭州,浙江,中国)。

2.5。ELISA检测

il - 1的水平β、地震和TNF -α在肺组织中浓度、BALF和细胞上清液进行了分析使用酶联免疫试剂盒(BioLegend、圣地亚哥、钙、美国),根据制造商的协议。

2.6。小鼠肺湿/干比率分析

24小时后气管内的有限合伙人的滴剂,小鼠死亡,右叶的肺切除后去除多余的血液,然后重获得“湿”的重量。随后,肺部干在烤箱60°C 72 h为“干”的重量。

2.7。BALF的测量

BALF数,总细胞数和总蛋白浓度BALF决心用BCA分析工具包(热费希尔科学)根据制造商的指示。BALF的炎症细胞分析Cytoflex机器(贝克曼库尔特)和以下fluorescence-conjugated抗体被用于实验:PE-conjugated anti-mouse CD11b (BioLegend、圣地亚哥、钙、美国),FITC-conjugated anti-mouse F4/80 (BioLegend、圣地亚哥、钙、美国),和BV650-conjugated anti-mouse LY-6G(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA)。

2.8。鼠标Alveolar-Capillary泄漏试验

有限合伙人管理24小时后,小鼠注射20毫克/公斤伊文思蓝尾静脉的解决方案。两个小时后,老鼠通过心与注射器抽血。然后,肺被放置在100毫克/毫升甲酰胺(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)。组织在60°C 24 h,孵化和甲酰胺的吸光度测量在620海里。

2.9。小鼠腹腔巨噬细胞的分离和纯化

在8-week-old C57BL / 6小鼠腹腔注射2毫升3%无菌thioglycolate介质(BD生物科学、火花、MD)和腹膜巨噬细胞(PMs)提取三天后。分离和净化PMs,每个鼠标安乐死40毫克/公斤戊巴比妥钠和浸泡在75%的乙醇为3分钟。腹膜的外层是用剪刀切割;15毫升RPMI 1640小鼠腹腔内注入20毫升注射器。腹腔内液体收集到管与20毫升注射器轻轻按摩后腹膜和离心机在4°C 250 g×5分钟。上层清液被丢弃,泥沙悬浮在RPMI 1640中补充10%胎牛血清和1%的青霉素和链霉素。细胞被添加到12-well细胞培养板,需要获得一个密度 细胞/好,培养2 h在37°C的5%的二氧化碳。然后,不依从细胞被温和的洗涤与PBS三次。孤立的巨噬细胞体外准备实验。

2.10。细胞增殖实验

细胞计数Kit-8工具包(CCK-8 TransGen,北京,中国)被用来评估点扩散。经前综合症被镀成96孔细胞培养板的密度 细胞/ 24 h在37°C,然后用不同浓度的格列本脲(0 ~ 200μ米)24 h。可行性化验在24小时通过细胞计数Kit-8化验(TransGen,北京)。

2.11。Inflammasome激活化验

经前综合症被播种在 在12个well-cell文化板块。隔夜介质取代了第二天,和细胞的被试2μg / ml有限合伙人6 h。然后,介质添加格列本脲(50μ米)或DMSO(1: 1000) 6小时。细胞终于刺激inflammasome活化剂:2毫米三磷酸腺苷(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)1 h。上层清液使用ELISA包被和分析根据制造商的指示。收集细胞进行免疫印迹分析。

2.12。统计分析

使用Graphpad棱镜进行了统计分析。数据被表示为 。未配对的学生 - - - - - -测试是用于比较两组。差异被认为是重要的 。

3所示。结果

3.1。格列本脲减弱LPS-Induced肺损伤

在气管内的有限合伙人的滴剂,小鼠表现出更大的弥漫性肺泡损伤,肺泡壁变厚,出血,炎症细胞浸润,而预处理与格列本脲缓解这些病理变化(图1(一))。相应地,格列本脲治疗减少了LPS-induced增加炎症评分,干/湿比率,alveolar-capillary肺、泄漏和BALF中总蛋白的浓度(数字1 (b)- - - - - -1 (e))。这些结果表明,格列本脲变弱LPS-induced肺损伤。

3.2。格列本脲降低LPS-Induced肺部炎症

与LPS组相比,预处理与格列本脲显著降低总细胞数和BALF中中性粒细胞和巨噬细胞的百分比(数字2(一个)- - - - - -2 (c))。促炎细胞因子包括il - 1的水平β和地震-回答e在BALF(数据也明显下调2 (d)和2 (e))和肺组织(数字2 (g)和2 (h))。令人惊讶的是,格列本脲治疗并不影响TNF - LPS-mediated增加生产α要么在BALF(图2 (f))或在肺匀浆(图2(我))。

3.3。格列本脲抑制NLRP3和Caspase-1活动的表达

基于格列本脲的下游产品可以减少NLRP3信号方式,我们认为格列本脲能直接抑制激活NLRP3 inflammasome。因此,我们发现NLRP3的表达,inflammasome的主要组件之一,和Caspase-1 / P20 Caspase-1的生物活性形式。与对照组相比,信使rna和蛋白质水平的NLRP3 LPS组明显增加(数据3(一个)- - - - - -3 (e))。同样,蛋白质水平Caspase-1 / P20也调节了LPS刺激(数字3 (b)和3 (c))。然而,表达升高NLRP3和Caspase-1 / P20 LPS组被格列本脲治疗抑制(数据3(一个)- - - - - -3 (e))。

3.4。格列本脲施加体外抗炎作用

自保护功能的格列本脲LPS-induced阿里已经验证了体内,然后我们进一步确认其效果的体外模型。巨噬细胞是关键协调器的肺部炎症和修复反应20.]。体外炎症模型建立了LPS刺激的巨噬细胞包括巨噬细胞细胞系(21)或主巨噬细胞(22)可以模拟体内炎症过程和机制的研究中经常使用抗炎药(21,22]。,小鼠腹腔巨噬细胞(PMs)用作体外细胞模型。首先,我们测量了格列本脲的体外细胞毒性经前综合症。随着浓度的增加,细胞生存能力下降了大约36.9%,至100μ格列本脲与控制(图4(一))。因此,50μ米被推荐为实验剂量为格列本脲浓度没有明显的细胞毒性。经前综合症与LPS首次启动,然后使用格列本脲,最后与NLRP3刺激刺激ATP。LPS刺激促进了NLRP3信使rna和蛋白质的表达在经前综合症,而这些upregulations被格列本脲治疗(数据抑制4 (b)- - - - - -4 (f))。同样,格列本脲抑制Caspase-1激活(数字4 (c)和4 (d))和il - 1的释放β有限合伙人管理局(数据和地震增强4 (g)和4 (h))。相比之下,LPS-induced TNF的表达增加α格列本脲治疗后仍不下降(图4(我)),这是与体内的结果(数据一致2 (f)和2(我))。

4所示。讨论

在目前的研究中,我们发现一个以前从未发现过的格列本脲对LPS-induced急性肺损伤的保护作用。格列本脲可以改善肺的病理损伤,削弱肺部炎症的小鼠模型LPS-induced阿里。从力学上看,这种保护作用相关的表达和激活downregulations NLRP3 / Caspase-1 / il - 1β信号通路在体内和体外。此外,抑制炎症反应的格列本脲部分是特定于目标NLRP3 inflammasome没有影响生产/等炎性细胞因子的分泌TNF -α。

众所周知,ALI / ARDS的特征是持续的炎症,氧化应激过度,和损失alveolar-capillary膜完整性,导致肺微血管通透性增加,肺泡水肿、白细胞外渗(1- - - - - -3]。到目前为止,已经有相当大的出版物中描述的干预措施,以防止ALI / ARDS [23- - - - - -25]。其中,格列本脲的抗炎特性在ALI / ARDS日益关注和验证有效地在各种动物模型的阿里,包括油酸、臭氧、辐射、出血性休克和ventilator-induced阿里(11- - - - - -14]。在我们的研究中,格列本脲抑制管理LPS-stimulated肺部水肿,血管研究损伤和炎性细胞浸润。这些结果表明,除了阿里的各种模型在先前的研究报告(11- - - - - -14),格列本脲也产生一种保护作用在当前LPS-induced ALI模型。

基于我们之前的研究,总结了格列本脲潜在的抗炎作用机制如下(10):(1)抑制NLRP3 / il - 1的激活β信号,(2)表达下调活性氧的生成,和(3)抑制炎症细胞的迁移,如中性粒细胞和嗜酸性粒细胞。在当前的研究中,LPS-induced增加促炎细胞因子如il - 1的水平β地震和中性粒细胞和巨噬细胞等炎性细胞明显降低BALF的格列本脲和肺组织。作为il - 1β和地震被称为指标NLRP3 inflammasome感应(26- - - - - -28),我们假设格列本脲的保护性反应,可能与其抑制关联NLRP3炎症。事实上,大量的研究发现,NLRP3 inflammasome扮演着一个重要的角色在阿里14,29日]。一致,NLRP3 / Caspase-1 / il - 1β信号被激活体内和体外有限合伙人或有限合伙人+ ATP后治疗,而激活NLRP3 inflammasome抑制了格列本脲在我们的研究中。因此,我们证实了格列本脲对其抗炎作用主要通过阻断NLRP3信号通路。

此外,我们注意到的分泌TNF -α视为一个inflammasome-unrelated细胞因子,并不受格列本脲。与先前的研究一致(30.,31日),结果发现,格列本脲并不影响LPS-stimulated TNF -α生产,排除了更一般的抗炎效应,格列本脲。这些结果表明,格列本脲的抗炎效果特别相关NLRP3 inflammasome信号通路在LPS-induced阿里,尽管它可以抑制Th2细胞因子在ovalbumin-induced哮喘小鼠模型在我们之前的研究32]。

目前的研究也存在一定的局限性。首先,我们没有确定格列本脲的作用在其他inflammasome复合物,如NLRP1 NLRC4, AMI2。第二,我们没有建立的模型LPS-induced阿里NLRP3 - /小鼠,所以格列本脲在多大程度上阻止了NLRP3 inflammasome没有更好的澄清。第三,肿瘤坏死因子-α是多个炎症信号通路的激活产品包括通用增殖蛋白激酶(MAPK)信号通路33),Janus激酶(激酶)/信号传感器和转录激活(STAT)途径34),和Hedgehog途径35]。尽管肿瘤坏死因子的分泌α的格列本脲治疗,我们没有观察到格列本脲是否有作用,这些提到的多种炎症信号通路的激活。因此,这个想法的证据,格列本脲的抗炎效果相对特定于NLRP3 inflammasome似乎不太稳定。最后,我们没有测量血糖浓度老鼠在当前的研究中。尽管小鼠模型在当前的研究中不同于前一个ovalbumin-induced过敏性哮喘,我们使用相同的治疗剂量之前40μ摩尔/公斤LPS-induced ALI / ARDS的治疗,我们没有快速预处理之前,格列本脲政府我们的先前的研究表明32]。根据我们以前的工作,我们观察到小鼠的血糖浓度没有影响在这个浓度没有快速预处理之前,格列本脲管理局(32];因此,我们认为,格列本脲的剂量在40μ摩尔/公斤对小鼠的血糖没有影响的研究。

5。结论

我们证明了格列本脲减轻LPS-induced阿里损伤通过抑制炎症反应,这是由于抑制NLRP3 inflammasome(图5)。综上所述,我们的研究结果提供的证据表明,格列本脲可能是一种很有前途的候选人LPS-induced阿里的辅助治疗。

数据可用性

本研究的所有数据都可以从第一作者杨G或如果需要给出相应的作者张G。

的利益冲突

没有竞争的利益要申报的东西。

作者的贡献

杰杨,杨Jiawen,小芳黄设计研究中,执行的大多数实验,分析数据,和写的手稿;Huiqing秀,Songjie呗,和李Jiahui进行实验和分析数据;下Cai提供技术援助专家,临床建议,和批判性讨论的工作;上半期陈、张Shufang Gensheng张设计研究,监督项目,并修改了手稿。杰杨,杨Jiawen,小芳黄了同样工作。

确认

这项工作是由格兰特从浙江省医疗卫生研究项目(青年人才项目)(第2019号rc038科幻张),部分是由中国国家自然科学基金(81901941号科幻张、81971871 GS张)。