文摘

溃疡性结肠炎(UC)的特征是一种慢性的促炎细胞因子的生产过剩。在急性期,内质网(ER)超载和蛋白质折叠过程受损,一个叫ER应激的条件。这种状态诱发响应(展开蛋白质反应(UPR)),由激活IRE1 / Xbp-1活跃/ eIF2α和ATF6通路,曾与肠道炎症在实验模型。ER应激和促炎的UPR激活触发激活,自噬和凋亡基因,除了促进蛋白质降解。因此,本研究的目的是评估ER应激的激活和UPR在UC患者结肠黏膜。患者和方法。转录ER应力分析,UPR-related基因是由qPCR从肠道粘膜的UC患者。我们也进行原位杂交(ISH)和免疫组织化学(IHQ)活跃/ eIF2α和IRE1 / Xbp-1通路和UPR-related陪伴。结果。我们第一次评估炎性基因通过qPCR,我们观察到,分析促炎的成绩单都是调节在UC患者。伊什和IHQ图像显示,通过活跃/ eIF2 ER应激激活α和IRE1 / Xbp-1通路不仅在肠道上皮细胞还在加州大学结肠黏膜固有层的细胞。转录分析证实EIF2AK3 UC患者的调节。UPR-related基因,如ATF3、STC2 DDIT3,陪伴和cochaperones DNAJC3, CALR, HSP90B1, HSPA5,也调节UC患者。此外,我们发现proapoptotic和自噬基因(分别伯灵顿和ATG6L1)也被调节。结论。我们的研究结果表明,ER压力和UPR确实是激活UC患者,这可能导致慢性炎症过程出现在加州大学。增加细胞凋亡和自噬标记进一步支持这些发现一旦他们被激活的激活平衡组织损伤。这些发现的分子机制提供新的视角,维护加州大学活动和打开新的可能性减弱肠道炎症。

1。介绍

溃疡性结肠炎(UC)是一种慢性炎症性肠病(IBD)的复发和汇款课程影响直肠和延伸到近段结肠。粪便的紧迫性,特点是腹痛和腹泻(1]。在过去的十年中,加州大学成为全球公共卫生问题一旦一年一度的直接和间接成本超过100亿美元在美国和欧洲Є15十亿(2]。尽管加州大学包括遗传方面的发病机制,免疫应答发挥相关作用在疾病的发病和维护3]。

促炎细胞因子的生产增长的众多原因之一,过载的内质网(ER),影响蛋白质的折叠和最后的构象。展开的蛋白质的积累状况ER腔导致命名的内质网应激压力(ER) [4]。

为了防止细胞毒性细胞ER宣扬的压力,展开的蛋白质反应(UPR)被激活5]。在真核细胞中,UPR信号通路主要是由三个跨膜蛋白:inositol-requiring跨膜激酶/核酸内切酶1 (IRE1) kinase-like内质网蛋白激酶(活跃),激活转录因子6 (ATF6) [6]。

一旦被激活,信使rna翻译是通过磷酸化eIF2放缓α(7]。的磷酸化eIF2α(p-eIF2α)选择性地提高翻译激活转录因子4 (ATF4)参与蛋白质折叠和ER应激细胞凋亡(8]。IRE1提出了两个亚型:愤怒α和愤怒β后,他们两人进行二聚作用和自身磷酸化激活。IRE1α能够减少新合成的蛋白质在ER的负载腔通过信使rna的降解(9]。此外,一旦激活,IRE1内切核糖核酸酶和激酶活性促进Jun-related激酶的活化(物)和NF -κB (10,11]和拼接的x - box绑定蛋白1 (Xbp1),负责监管关键基因的表达与女伴生产和ER-associated蛋白质降解(ERAD)组件12]。ATF6激活时,发生在高尔基体蛋白水解乳沟。然后,其发布的片段转移到细胞核为了激活有限数量的基因的转录与ER质量控制功能,其中许多已经引起Xpb-1 [13,14]。

研究利用Xbp-1基因和IRE1β基因敲除小鼠显示增加肠道炎症,以及肠道屏障受损,导致病原体入侵的增加(10,15]。IBD相关的活跃途径间接通过DDIT3激活(DNA损伤诱导转录3,也称为切/ GADD153),负责ER应激相关细胞凋亡(10,16]。ATF6基因敲除小鼠显示ER的表达减少chaperone-related基因(17]。此外,我们的研究小组最近的一项研究表明,EIF2AK3 ERN1基因和调节肠道粘膜的克罗恩病的患者,另一种形式的炎症性肠病(18]。

因此,本研究的目的是描述ER应激激活在UC患者的多中心研究中使用UPR-related基因的转录分析和原位杂交,以及确定UPR-related蛋白质利用免疫组织化学技术的存在。ER应激通路的激活在加州大学的识别可能导致更好的理解其生理病理学和治疗靶点的发展在未来可以探索。

2。材料和方法

2.1。病人和道德

这项研究是进行符合赫尔辛基宣言,并经伦理委员会批准的坎皮纳斯大学和医院的伦理委员会诊所。所有患者为研究提供了书面知情同意的形式参与。

UC组组成的样本影响肠粘膜取自患者呈现活跃在结肠镜检查中,加州大学。对照组样本组成的正常粘膜取自病人结肠镜检查疾病检测不到发炎的迹象。表1显示了人口和临床患者纳入研究的数据。加州大学活动证实了梅奥的分数。只有病人梅奥内窥镜 被包括在研究。UC患者正常粘膜(即。,without erythema and without erosions and/or ulcers), or the ones who presented a Mayo endoscopic ,被排除在研究之外。

这项研究是进行IBD研究实验室,从学校坎皮纳斯大学的医学科学由巴西、胃肠病学实验室,从8月π我纽约州立大学生物医学研究所(IDIBAPS),位于西班牙巴塞罗那。

2.2。RNA提取和互补脱氧核糖核酸的合成

总RNA提取使用RNeasy迷你包(试剂盒,猫没有。/ ID: 74104),根据制造商的指示。提取RNA的浓度和纯度测定采用紫外分光光度法在260海里。互补脱氧核糖核酸的合成进行了使用高容量cDNA逆转录工具包(应用生物系统公司、培育、城市、钙、美国)。

2.3。实时定量PCR (qPCR)

实时定量PCR反应进行使用TaqMan™系统(应用生物系统公司)。评估激活UPR的三个主要分支所使用的引物是EIF2AK3 (Hs_00178128_m1) ERN1 (Hs_00980095_m1)和ATF6α(Hs_00232586_m1)。评估炎性概要文件,以及凋亡和自噬基因,所使用的引物是il - 6 (Hs00174131_m1), il - 10 (Hs00961622_m1)、干扰素-γ(Hs_00989291_m1), il - 1β(Hs_01555410_m1) IL-23p19 (Hs_00372324_m1)、肿瘤坏死因子-α(Hs_00174128_m1) IL-17 (Hs_00174383_m1) IL22 (Hs01574154_m1)、bcl - 2 (Hs_00608023_m1),伯灵顿(Hs_00180269_m1)和ATG16L1 (Hs_00250520_m1)。评估UPR-related基因和陪伴,所使用的引物是ATF3 (Hs_00231069_m1) CALR (Hs_00189032_m1) STC2 (Hs_00175027_m1) DNAJC3 (Hs_00534483_m1) DDIT3 (Hs_0109850_m1) HSP90B1 (Hs_00427665_g1)和HSPA5 (Hs_99999174_m1)。目标基因的转录水平正常化使用GAPDH作为内源性基因的控制。基因表达是决定使用折叠变化,得到δCt方法。

2.4。苏木精和伊红())

Formalin-fixed和石蜡包埋(FFPE)肠粘膜样本在4μm和苏木精和伊红染色的染料。显微照片拍摄使用DFC345FX(德国徕卡)和控制软件(LAS V4.12,徕卡)。定量分析,三个随机全色目标领域的更高放大(40 x)每个样本进行扫描和分析由两个盲观察员(B.L.R.和R.F.L.)。

2.5。免疫组织化学(包含IHC)

Formalin-fixed和石蜡包埋(FFPE)肠粘膜样本在4μm。deparaffinization后,抗原进行检索使用柠檬酸缓冲溶液(pH值6.0)20分钟在95°C。内源性过氧化物酶被双氧水(3% H₂O₂10卷),其次是洗磷酸盐(PBS, 10毫米,pH值7.4)。主要的抗体被稀释1%牛血清白蛋白(BSA)解决方案(PBS稀释)和孵化一夜之间4°C。anti-phosphor——使用的抗体[Ser51] eIF2a (Abcam ab32157,兔单克隆)稀释1/50在BSA,纯化anti-Xbp-1(羧基末端)(555483年BioLegend,兔多克隆)稀释1/50在BSA, anti-GRP78 (Abcam ab21685,兔多克隆)中使用1的浓度μg / ml, anti-GRP94(圣克鲁斯生物技术、sc11402兔多克隆)稀释1/50在BSA和anti-DDIT3 (BioVision a1674 - 100),稀释BSA的1/100。信号检测是决定使用一个immunoperoxidase检测系统(向量实验室),然后孵化与民建联解决方案(Dako)。幻灯片被苏木精复染色、脱水和几个酒精浓度,和安装安装介质(Dako)。显微照片拍摄使用DFC345FX(德国徕卡)和控制软件(LAS V4.12徕卡)或蔡司Axioplan 2显微镜和数码相机(奥林巴斯dp - 72)控制软件(Cellsens)。规模酒吧的位置的数据,校准是保证结构进行准确的测量,通过协会的数量与细胞核(10像素μ米)。校准和放置的酒吧都是使用ImageJ程序执行。定量分析,三个随机全色目标领域的更高放大(40 x)每个样本进行扫描和分析由两个盲观察员(B.L.R.和R.F.L.)。

2.6。原位杂交(ISH)

原位杂交(ISH)都使用了显色RNAscope®2.5 HD-RED化验和HybEZ™杂交系统(美国先进细胞诊断,海沃德,CA)根据供应商的指令。FFPE粘膜样本在5μm和deparaffinized通过二甲苯和绝对浓度乙醇洗涤。组织被对待RNAscope过氧化氢溶液在室温下10分钟,RNAscope目标检索试剂溶液为15分钟船> 99°C,和RNAscope蛋白酶+ 30分钟40°C。组织被杂化与ERN1(497331)和EIF2aK3(541471)信使rna探针2 h在40°C。冲洗后洗缓冲区,放大的杂化探针信号通过串行应用Amp 1安培6。快红的解决方案是申请10分钟来检测目标rna。部分与苏木精复染色和安装EcoMount(热费希尔科学Inc .,沃尔瑟姆,MA)。ERN1和EIF2aK3信使rna信号评价的存在更加深点使用一个奥林巴斯BX51显微镜(日本东京)和CellF软件。

2.7。统计分析

所有的数据分析和报告使用中间值。评估正态分布,Kolmogorov-Smirnov测试。然后,非参数Mann-Whitney测试组之间进行。一个值小于0.05被认为是显著的。

3所示。结果

3.1。促炎细胞因子在溃疡性结肠炎患者的结肠粘膜

首先,确认性结肠炎结肠粘膜炎性信号,我们评估细胞因子的表达经常在IBD患者通过rt - pcr调制。在这项研究中,我们包含了14控制和18 UC患者。UC组提出了一个重要的促炎细胞因子转录如下:upregulation摘要意思β白细胞介素6、IL17 IL22 IL23p19,干扰素γ,肿瘤坏死因子α相比对照组( )。抗炎细胞因子il - 10也显著调制( ),显示一个反动的明显的促炎状态结肠粘膜受到加州大学(图的影响1(一))。图1 (b)显示一个热图的炎性细胞因子在两组。因此,1型(Th1)和17 (Th17)免疫反应,以及先天反应,在加州大学参与肠道炎症。补充图(可在这里)显示代表苏木精和伊红染色(圆))肠道粘膜固有层的说明细胞渗透加州大学和CTR组。

3.2。活跃/ eIF2α和IRE1 / sXBP-1但不是ATF6通路被激活的结肠粘膜溃疡性结肠炎患者

我们选择调查ER应激通路和UPR-related UC患者的基因被激活。对于这一分析,我们包括14控制和18 UC患者rt - pcr, 5控制和8 UC患者的免疫组织化学分析,控制和3和4 UC患者原位杂交。

第一个UPR途径评估是活跃/ eIF2α。我们进行rt - pcr技术调查EIF2AK3基因的表达,负责编码蛋白质。因此,我们观察到的一个重要upregulation ( )在UC患者与对照组相比(图2(一个))。

此外,利用原位杂交,我们调查EIF2AK3 mRNA的位置以及通过免疫组织化学,p-eIF2的蛋白表达α。EIF2AK3-positive细胞的转录表达在上皮细胞层和固有层的控制患者,和显著增加EIF2AK3 UC患者的固有层细胞观察(图2 (b))。免疫染色显示p-eIF2α表达在上皮细胞层和固有层的细胞,在UC患者相比更强烈的免疫反应性控制( )(数据2 (c)和2 (d))。

第二个UPR分支评估是IRE1 / Xbp-1通路。无统计差异ERN1转录水平的控制和UC组之间由qPCR ( )(图2 (e))。然而,伊什发现,ERN1调节固有层中,加州大学的样品(图2 (f))。由于Xbp-1是一个蛋白质表达IRE1激活后,其评估被认为是一个精确的形式确认是否确实IRE1已经激活。因此,我们使用一个特定的抗体进行免疫组织化学分析,认识到拼接的变体Xbp-1蛋白质(sXbp-1)调查sXbp-1的表情。然后,我们观察到的表达明显高于sXbp-1,主要在加州大学组织的上皮细胞,当相比CTR组( )(数据2 (g)和2 (h))。

评估ATF6通路是最后UPR分支。的ATF6α转录水平显示加州大学和对照组之间无显著差异( ),和转录水平的变化验证了病人(图2(我))。

3.3。陪伴和基因对UPR激活调节在UC患者

UPR-related基因的调节是由ER应激激活。因此,我们进行了这些基因的转录分析样品从加州大学和控制患者结肠黏膜。我们观察到的一个重要upregulation calcium-regulatory蛋白质stanniocalcin-2 (STC2) ( ),转录激活因素3 (ATF3) ( ),和DDIT3 ( )(图3(一个))。另外,我们观察到显著的免疫反应性DDIT3蛋白在UC患者的结肠上皮细胞(数字3 (b)和3 (c)),确凿DDIT3转录的发现。

UPR激活也可以增加监护人的生产来解决在ER展开蛋白质的积累。因此,我们评估,通过rt - pcr和免疫组织化学技术,无论是生产陪伴在UC患者肠活检调制。转录分析表明,UC患者显著增加( )DnaJ转录水平的热休克蛋白家族(DNAJC3)编码DNAJC3 cochaperone, CALR伴侣calreticulin编码,编码蛋白GRP78 /毕普HSPA5, HSP90B1编码伴侣GRP94(图3 (d))。此外,加州大学肠道粘膜固有层和上皮细胞表现出明显高于GRP78的免疫反应性(数据3 (e)和3 (g))和GRP94(数字3 (f)和3 (h))与对照组相比,确定转录的结果。

3.4。细胞凋亡和Autophagy-Related基因的转录分析UC患者

作为细胞凋亡可能发生由于炎症和/或ER应激激活,我们也评估赞成和凋亡基因的转录水平。伯灵顿与对照组相比显著调节UC患者( ),而bcl - 2没有显示组(图之间的调制4(一))。此外,我们评估是否存在自噬调制UC患者的活检。rt - pcr分析表明,ATG6L1 UC患者明显高于相比CTR组( )(图4(一))。这些发现强化,ER应激激活在UC患者中,自噬和凋亡等机制试图平衡组织损伤。图4 (b)说明了我们的发现。

4所示。讨论

ER应激激活和UPR在几种疾病与炎症通路,如自身免疫和感染性疾病(19]。内质网(ER)是一个重要的细胞器负责肠道内稳态及其压力和UPR保护肠细胞免受感染,是至关重要的。在一个实验模型(AA^IEC老鼠)不能使磷酸化eIF2α(活跃通路),曹et al。20.)易感性增加沙门氏菌感染沙门氏菌感染以及硫酸葡聚糖sodium-induced结肠炎。关于炎症性肠病,虽然触发ER应激激活的分子机制在这些感情并不完全理解,几项研究已经报道ER应激作为一个相关的组件在疾病的维护17,18,21]。大多数使用肠状的和colitis-induced动物实验研究已经表明肠上皮细胞(iec)是主要的细胞类型,ER应激激活(21- - - - - -24]。我们的结果指向这个发现和原位杂交和免疫组织化学图像也主要显示ER应激标记在iec,除了从固有层细胞。

只有少数研究评估ER应激在加州大学使用样本结肠镜检查。Treton et al。25)报道,IRE1和ATF6但不活跃UC患者的通路被激活。这些不同的研究结果相比,我们的结果可能是由于这一事实Treton等人只是分析noninflamed肠道粘膜,并发生积极的加州大学本身可能激活和炎症的加重ER应激,导致反过来通过NF-KB激活炎症通路的恶化。活跃通路激活转录因子的表达ATF4, DDIT3诱导物(26]。在我们的研究中,我们观察到活跃通路被激活在UC组。这激活导致的增加表达DDIT3 iec的UC患者。林等。27)表明,延长活跃活动有利于诱导细胞死亡。这些结果与我们自己的表明这些细胞激活细胞凋亡以恢复体内平衡。除了DDIT3通路,我们观察到巴克斯转录增加,proapoptotic基因,在UC患者。

虽然我们没有找到一个转录调制的白尾海雕qPCR、原位杂交和免疫组织化学图像显示ERN1信使rna的存在和sXbp-1,分别在肠道的UC患者样本。UPR启动时,所有三个途径被激活。然而,激活不同的持续时间。林和他的同事们(28)已经证实,在一个在体外研究,IRE1 ATF6反应减弱,而活跃的激活,当应力条件依然存在。尽管这种疾病的确切时刻进化这一转变在UPR调制发生尚不清楚,UC患者包括在我们的研究中,除了介绍疾病活动包含的时候,有一个扩展疾病持续时间(> 10年),表现为慢性炎症。关于白尾海雕转录水平的评价,它是基于先前的试验研究,分析了IRE1的激活α(ERN1)在肠上皮细胞而不是IRE1β(ERN2)。这激活导致自发结肠炎伴随着杯状细胞和上皮屏障功能特异表达的损失(16]。IRE1的作用α是建立在文学:被激活时,它可以绑定并激活TNFαreceptor-associated因子2在细胞质中,激活NF -κB,因此参与炎症反应和proapoptotic信号以响应ER应激(29日,30.]。此外,IRE1α可以与proapoptotic bcl - 2家族蛋白质(伯灵顿或贝克),从而导致凋亡细胞死亡(31日]。此外,IRE1α可能导致选择性微rna的降解通常压制caspase-2翻译,导致线粒体凋亡[32]。

ATF6缺乏转录调节,细胞因子的生产过剩,和疾病的长期活动完全表明这一途径可能是减毒而活跃,细胞命运IRE1持续推动细胞凋亡。此外,大多数的结果ATF6激活相关细胞适应性反应,以恢复体内平衡,包括其中,蛋白质折叠和/或蛋白质降解(通过ERAD) (33]。我们观察到在ATF6没有显著差异α转录水平加州大学和对照组之间,除了一个小变化的记录在病人,表明这个途径实际上可能不会被激活。另一方面,我们的结果表明细胞凋亡途径激活,但是,我们的研究条件下,它可能不是ATF6的结果α途径激活,而是激活其他的ER应激的结果树枝(切/ DDIT3)。

ER应激激活和尝试压力的决议都是由glucose-regulated蛋白质(GRP) 78年和94年,作为监护人,帮助ER恢复平衡(34]。在生理条件下,这三个不活跃的ER应激通路与GRP78,也被称为免疫球蛋白的蛋白质绑定(毕普)。在展开的蛋白质的积累,GRP78分离腔的域的所有三个ER应激通路,激活UPR [34]。在UPR GRP78也有助于推动展开蛋白质降解通过ERAD [35]。尽管GRP94最好的角色被称为一个ER应激相关免疫反应中介(36),它还帮助蛋白质折叠和目标错误折叠蛋白质ERAD [37]。在我们的研究中,我们评估这些UPR介质是否被激活,表明HSP90B1和HSPA5都表达的转录调节和UC上皮和固有层细胞组。UPR开始通过NF -诱发炎症基因的生产κB激活(38]。事实上,我们观察到高转录水平的促炎细胞因子在UC结肠样本。这些结果支持了促炎的剖面特征在UC患者(39]。我们还观察到IL17和IL22成绩单在UC患者调节。这个观点鲍威尔和他的同事们发表的最近的一项研究表明,IL17 IL22促进ER压力和导致iec体外细胞凋亡。作者也表明,这些细胞因子在体内降低ER的封锁反应结肠上皮细胞(40]。

的一个主要蛋白质降解系统自噬过程,这是激活后为了维持细胞内稳态应力状态(41]。全基因组关联研究(GWAS)在2006年确定了执行ATG16L1作为autophagy-related基因易感性开发CD [42]。自那时以来,相关研究报道,ATG6L1 CD,但不是加州大学(43]。我们观察到,通过rt - pcr,显著增加ATG6L1 UC组的表达,表明没有自噬缺陷UC患者。这个结果证实一些其他建议ER应激激活诱导自噬起始(44- - - - - -47]。

值得考虑研究的一些局限性:我们只评估患者长时间的疾病,这可能不同于最近在ER应激激活的模式诊断患者结肠黏膜。此外,患者接受不同种类的药物(免疫抑制和生物制剂),这可能会影响细胞因子的模式和不同的ER压力激发了通路。这是一项观察性研究,确定控制变量是不可能为了有足够的样本容量。尽管这些限制,我们的翻译研究带来了新的数据在UC ER应激通路的优势,有助于更好的理解这一慢性疾病。

5。结论

我们发现,两个三个ER应激通路(活跃和IRE1)被激活的UC患者结肠黏膜,这可能有助于维护这个组织的炎症。UPR一起增加标记的细胞凋亡和自噬增强ER应激激活,但他们并不足以控制UC患者的炎症和组织损伤。这些发现想象新的分子与潜在的治疗目标在未来的影响。这些可能包括策略阻止ER应激或促进UPR通路的活动。

数据可用性

所有相关数据支持本研究的发现可以在纸上。

信息披露

这个手稿的抽象,提出了在虚拟会议消化疾病周2021 (DDW)中所描述的。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

BLR、ID、枸杞多糖、JM和我进行实验,绘制和分析数据。二进行结肠镜检查,收集样品。采用树脂研究构思,设计研究,解释结果,修订后的手稿。所有作者的写作和修改了手稿。所有作者阅读和批准最终的手稿。

确认

这项工作是由FAPESP(圣保罗研究基金会)必须占州政府(格兰特数字# 2018/05584-4和# 2020/04407-1 R.F.L.)和国家科学技术发展委员会(CNPq)(批准号# 301388/2018-0 R.F.L.)。B.L.R.(作家)收到巴西的博士奖学金协调改善高等教育的人员(斗篷(Coordenacao de Aperfeicoamento de Pessoal de含量比),巴西),财务代码001。L.B.P.(合著者)收到资助的博士后奖学金教育、研究和推广支持(FAEPEX),坎皮纳斯大学(批准号# 2332/20)。我们感谢特里斯坦Torriani英语修订手稿。

补充材料

补充图:免疫细胞的渗透在UC患者的结肠粘膜固有层。(一)代表苏木精和伊红染色(圆))结肠粘膜溃疡性结肠炎(UC)和控制(CTR)患者。酒吧规模:50μm。(B)免疫细胞数量的加州大学和CTR的固有层组。加州大学, ;CTR, ; 。(补充材料)