文摘
非酒精性脂肪肝炎是常见的肝脏疾病,其特征是肝脂肪变性、炎症和纤维化;没有批准的药物来治疗这种疾病,因为不完整的理解病理生理学机制的纳什。牛奶脂肪globule-epidermal增长factor-factor 8 (MFG-E8),多功能糖蛋白,显示抗炎和antifibrosis。在这里,MFG-E8被证明在纳什发展起到关键作用。使用蛋氨酸和胆碱不足(MCD)饮食的老鼠,我们发现MFG-E8淘汰赛加剧肝损伤和脂肪变性的增加血浆转氨酶活动和肝组织病理学变化,肝甘油三酯(TGs)和脂质积累。此外,肝纤维化和炎症引起的MCD加重在MFG-E8基因敲除小鼠。从力学上看,MFG-E8淘汰赛促进激活肝toll样受体4 (TLR4) /核转录因子(NF -κBκB)信号通路在MCD-fed老鼠。在体外实验中,TLR4特定对手tak - 242救了棕榈酸- (PA)启动脂质形成和炎症在初选MFG-E8敲除小鼠肝细胞。这些发现表明,MFG-E8参与纳什和可能的发展机制MFG-E8淘汰赛加剧了纳什在老鼠与TLR4 / NF -激活κB信号通路。
1。介绍
非酒精性脂肪肝病(NAFLD)是一种最常见的慢性肝脏疾病,发生在一般人口的25% - -30% (1,2]。非酒精性脂肪肝是指临床病理综合征,从简单的非酒精性脂肪肝到非酒精性脂肪肝炎(纳什)[3,4]。作为非酒精性脂肪肝的恶化的一个转折点,纳什会导致肝硬化的发展,肝功能衰竭,肝细胞癌,已经成为liver-related死亡率和肝移植的主要原因。纳什的特点是肝脂肪变性、炎症、纤维化肝细胞膨胀,和可变度[5]。然而,其分子机制仍不完全清楚,没有有效的控制措施是可用的。因此,迫切需要探索纳什的病理生理机制的发展。
越来越多的证据表明,过多的脂质accumulation-induced促炎介质的生产和先天免疫细胞的激活在纳什的发展扮演关键的角色。由于炎症介质如趋化因子的分泌,先天免疫细胞巨噬细胞和中性粒细胞被招募到肝脏和激活有关的分子模式(抑制)释放受伤的肝细胞,导致肝脂肪变性和纤维化加重(6,7]。作为一种重要的先天免疫模式识别受体(PRR), toll样受体4 (TLR4)已被发现是调节在非酒精性脂肪肝患者和动物模型和计算肝脂肪变性的发展,炎症和纤维化(8- - - - - -10]。众所周知,核转录因子(NF -κBκB),一个关键的下游分子TLR4信号通路,扮演重要的角色转换的从简单的脂肪变性到肝病(11,12]。在规范的途径,NF -κB蛋白被我束缚和抑制κB蛋白。抑制代谢产物,如自由脂肪酸,有限合伙人触发TLR4信号使磷酸化il - 1 receptor-associated激酶(伊拉克的)。按顺序,IKKβ我被激活的蛋白质,这些蛋白质磷酸化κB蛋白,导致我κ释放NF - B泛素化降解κB蛋白。释放NF -κB p65等蛋白质磷酸化激活修改和转移到细胞核中,关键的转录因子,诱导这些目标基因表达,如肿瘤坏死因子-α(肿瘤坏死因子-α),interleukin-1β(il - 1β),il - 6 (13,14]。因此,针对TLR4 / NF -κB信号可能是纳什的潜在机制和关键的治疗策略的发展。
牛奶脂肪globule-epidermal增长factor-factor 8 (MFG-E8),分泌糖蛋白与两个EGF-like域,包含一个能够桥的RGD主题对凋亡细胞磷脂酰丝氨酸和整合素αvβ3或αvβ5在吞噬细胞加速凋亡细胞的吞噬作用,导致炎症反应的抑制作用15- - - - - -17]。它已经表明,MFG-E8防止肝纤维化小鼠通过干扰转化生长因子的作用β1 (TGF -β1)(18]。最近的一项研究发现,MFG-E8高度表达在人类肝细胞癌(HCC)组织和积极调节肝细胞癌进展,并anti-MFG-E8抗体能有效地抑制肝癌进展和转移(19]。此外,它已经表明,血清MFG-E8可以作为wto的诊断,预后的生物标志物,肝癌和肝MFG-E8防止从肝脂肪变性和炎症的发展20.,21]。此外,据报道,MFG-E8可以减弱释放促炎细胞因子的免疫细胞通过抑制TLR4和NF -κB通路(22,23),是一个关键调节器的中性粒细胞浸润在急性肺损伤24,25]。然而,的潜在角色和机制MFG-E8 NASH的发病机理需要进一步阐明。因此,在目前的研究中,我们调查的影响缺乏MFG-E8 MCD-induced纳什小鼠模型的发展和探索其潜在机制。
2。材料和方法
2.1。化学药品和试剂
包的丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)和甘油三酯(TG)由南京建成生物工程研究所(南京,中国)。酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒TNF -α和il - 1β买来本德MedSystems(奥地利维也纳)。PE鼠anti-mouse Ly6G获得BD生物科学(美国新泽西州)。中性粒细胞和F4/80抗体获得热科学(美国罗克福德,IL)。兔兔anti-mouse TLR4抗体,anti-mouse phospho-IRAK1, phospho-p38 phosphor-IKKβ、IKKβ,phospho-IκBα,我κBα,p38 phospho-p65 p65,β肌动蛋白、核纤层蛋白B1和GAPDH买来Abcam(英国剑桥)。PE鼠anti-mouse F4/80, FITC鼠anti-mouse CD11b,和FITC鼠anti-mouse CD45抗体来自Biolegend, Inc .(美国圣地亚哥)。TLR4-specific拮抗剂tak - 242是从MedChemExpress LLC(上海,中国)。棕榈酸(PA)是从Sigma-Aldrich(圣路易斯,美国)。
2.2。动物和动物实验
雄性C57BL / 6 j小鼠(WT)(6 - 8周,20 - 25 g)是由重庆医科大学实验动物中心(中国重庆)。MFG-E8淘汰赛(KO)老鼠捐赠的崔Tianpen教授武汉同济医学院附属第一医院华中科技大学。实验动物是维持在一个特定的标准实验室条件(20 - 25°C, 湿度和一圈12 h光明/黑暗)和美联储定期和随意浇水。所有小鼠适应至少1周之前使用。依法执行的实验中小鼠动物保健和使用委员会的指导方针的重庆医科大学。
小鼠随机分为四组( 每组):CD-WT集团CD-KO集团MCD-WT集团和MCD-KO组。老鼠MCD-WT和MCD-KO组喂养MCD饮食(营养饲料购买的高科技有限公司,江苏,中国)5周诱导纳什。在同一时期,其他两组的老鼠被喂食标准食物饮食(CD)(从营养饲料购买高科技有限公司,江苏,中国)。5周结束时,所有的老鼠都牺牲通过七氟烷麻醉retroorbital窦收集血液样本,收集和肝脏组织下分析。
2.3。细胞培养和治疗
肝组织灌注了汉克的平衡盐溶液(HBS),其次是杜尔贝科修改鹰的第四媒介(DMEM)与0.05%胶原酶在37°C。主要鼠肝细胞是通过离心收集50克2分钟,然后被播种在涂敷胶原蛋白I型文化板块与10%胎牛血清的DMEM补充的边后卫。
主要从野生型小鼠肝细胞或MFG-E8基因敲除小鼠刺激了棕榈酸(PA)(0.5毫米)有或没有TLR4特定对手tak - 242 (10 nM) 24 h。细胞因子测定的上层清液收集;这些细胞被固定75%乙醇和沾油红O的解决方案。在其他的实验中,细胞与细胞内TG chloroform-methanol解决方案测量细胞溶解。
2.4。生物化学分析
收集血液样本从老鼠和离心获得血清。肝脏样本使用组织均质机均质,和上层清液离心获得的。血清中ALT和AST的活动和甘油三酯(TG)在肝脏测定使用商业分析工具根据制造商的指示。
2.5。组织学分析
肝脏组织在4%多聚甲醛固定,石蜡嵌入式,5片μ米厚度。随后,组织部分被苏木精和伊红染色(他)染色,马森的三色的染色,或天狼星红染色和评估使用光学显微镜(奥林巴斯、东京、日本)。脂肪变性、炎症和肝细胞膨胀在他染色肝得分根据NAS(非酒精性脂肪肝活动得分)。
2.6。油红O染色
肝组织是嵌入在最佳切削温度(10月)化合物,切割15岁μ米厚度,固定在75%乙醇。然后,冰冻切片是沾油红O解决方案并与苏木精复染色核。
2.7。免疫荧光的巨噬细胞和中性粒细胞
巨噬细胞和中性粒细胞在肝脏被免疫荧光可视化。简单地说,冻结部分(8μm)是孵化主要抗体FITC鼠anti-mouse F4/80或PE鼠anti-mouse Ly6G 37°C在黑暗中1 h。然后,肌动蛋白细丝被贴上ActinRed 555或488 ActinGreen(美国罗克福德热科学)37°C 1 h。最后,部分是复染色用4核,6-diamino-2-phenyl吲哚(DAPI),分析了荧光显微镜(奥林巴斯、东京、日本)。
2.8。流式细胞术
肝脏样本停飞和第四0.05%胶原酶消化在37°C的过滤和离心5分钟的上层清液的50克。然后,使离心沉淀得到的上层清液在5分钟和500克resuspended磷酸盐缓冲剂。接下来,肝脏nonparenchymal细胞(NPC)沉淀和CD45标记孵化,F4/80, Ly6G CD11b抗体4°C条件下和黑暗。巨噬细胞的浸润(CD11b+F4/80+)和中性粒细胞(CD45+Ly6G+通过流式细胞仪检测。
2.9。酶联免疫吸附试验(ELISA)
肿瘤坏死因子的水平α和il - 1β在肝脏和上层的衡量后的ELISA试剂盒制造商的协议。
2.10。反向Transcription-Quantitative聚合酶链反应(RT-qPCR)
简单地说,100毫克的肝组织和1毫升试剂盒试剂(表达载体、钙、美国)使用均质机均质。细胞溶解肝脏样本孵化为5分钟允许核蛋白质分离和增加了200μL氯仿混合,然后安全地帽管孵化为2分钟。样品在4°C离心机,15分钟12000克,混合内容转移600人μL的无色,上层水相含有RNA新RNase-free管。RNA混合物添加同等体积的70%乙醇漩涡。之后,上层清液小心丢弃,沉淀在室温下干燥,吸量200μL RNase-free水溶解的颗粒,和总RNA溶液混合后准备好。
互补DNA(互补)合成了PrimeScript RT工具包(豆类,大连,中国)。定量实时PCR进行使用SYBR绿色实时PCR扩增工具包(豆类、大连、中国)后,制造商的协议。所有的mrna的相对表达水平正常化GAPDH表达式。引物序列被列为表1。
2.11。西方墨点法
整个细胞溶解产物、细胞质和核从小鼠肝脏组织中可溶性蛋白质分离•瑞帕裂解和亚细胞蛋白质分离包(美国沃尔瑟姆热费希尔科学)根据指令。总之,正是重100毫克的肝脏和1000μL新准备里帕裂解缓冲或胞质提取缓冲(CEB)放入prechilled管在冰上,均质化完全在冰上。上层清液(完整的细胞溶解产物或胞质提取)转移到干净prechilled管使用。225年CEB添加颗粒μL核提取缓冲(内)含有蛋白酶抑制剂为15秒涡和孵化在4°C与温和搅拌30分钟。然后,管离心机在4°C, 5000 g 5分钟,上层清液(可溶性核提取物)收集。使用BCA的蛋白质浓度检测化验设备。
随后,受到电泳蛋白质通过polyacrylamide-sodium十二烷基硫酸盐(sds - page)凝胶和转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜。膜被屏蔽5%牛血清白蛋白(BSA)解决方案在室温下1 h。之后,一夜之间,膜被孵化在4°C适当稀释主要抗体,其次是孵化与辣根过氧化物酶(合)共轭二次抗体在室温下1 h。最终,抗体绑定显示使用ECL化学发光系统,分析了图像实验室软件。
2.12。统计分析
所有数据在本研究中被表示为 (SD)。学生的 - - - - - -测试是用来比较两组之间的差异。单向方差分析(方差分析)其次是图基事后测试是用于多个比较。值< 0.05被认为是具有统计学意义。
3所示。结果
3.1。MFG-E8击倒在纳什小鼠血清ALT和AST活动增加
血清ALT和AST活动是至关重要的生化指标的评价肝脏功能。如图1,血清ALT和AST活动MCD-WT组明显高于CD-WT集团( )。与MCD-WT组相比,MFG-E8淘汰赛明显增加血清ALT和AST活动( )。此外,没有显著区别CD-WT和CD-KO组,表明MFG-E8淘汰赛并不影响小鼠的肝脏功能。
(一)
(b)
3.2。MFG-E8淘汰赛加剧MCD-Induced肝损伤小鼠
为了进一步确认MFG-E8对纳什的影响,肝组织的组织病理学变化被他染色和NAS评分评估。如图2(一个),没有明显的病理变化在CD-WT和CD-KO组。相比之下,明显与小叶炎症病灶和弥漫性肝脂肪变性,以及一些膨胀观察肝细胞在肝脏MCD-WT集团的进一步加剧MFG-E8基因敲除小鼠喂食了。同样,NAS分数表明MFG-E8产生更严重的肝脏病理损伤的基因敲除小鼠比野生型老鼠MCD饮食5周后(图2 (b))。
(一)
(b)
3.3。MFG-E8淘汰赛恶化在纳什小鼠肝脂肪变性
评估MFG-E8在脂滴形成的影响,油红O染色和TG含量进行了测量。MCD饮食诱导明显脂质沉积和脂肪在肝细胞液泡积累,这是典型的脂肪变性的组织学特征。然而,MFG-E8淘汰赛显著恶化的大小和数量(图肝脂滴3(一个))。与此同时,如图3 (b),油红O染色阳性区域明显高于MFG-E8肝脏的基因敲除小鼠与野生型相比集团( )。同样,MFG-E8基因敲除小鼠显示肝脏TG含量显著高于控制老鼠MCD饮食( )(图3 (c))。
(一)
(b)
(c)
3.4。MFG-E8淘汰赛加剧MCD-Induced在小鼠肝纤维化
纳什与肝纤维化进步密切相关。因此,肝纤维化的程度是由马森的三色的染色和天狼星红染色。与食物的饮食小鼠(CD-WT)相比,MCD饮食小鼠(MCD-WT)显示更重要的肝纤维化,也大大加剧了MFG-E8淘汰赛,马森的三色的染色(数据做了演示4(一)和4 (b),蓝色显示胶原纤维)和小天狼星红染色(数字4 (c)和4 (d)红色代表胶原纤维)。
(一)
(b)
(c)
(d)
3.5。MFG-E8淘汰赛促进渗透纳什小鼠的肝巨噬细胞和中性粒细胞
巨噬细胞和中性粒细胞的浸润肝是纳什开发中最重要的事件之一。免疫荧光染色分析表明,MCD-WT组相比,MFG-E8敲除小鼠表现出增强F4/80的渗透+巨噬细胞和Ly6G+中性粒细胞为肝脏(数字5(一个)- - - - - -5 (d))。此外,正如所料,流式细胞术分析实验显示了相似的结果,肝脏炎症细胞(CD11b+F4/80+巨噬细胞和CD45+Ly6G+中性粒细胞)人数明显升高MCD饮食MFG-E8基因敲除小鼠与MCD-WT集团(数字5 (e)和5 (f))。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
3.6。MFG-E8淘汰赛增强肝脏的炎症介质的产生纳什老鼠
此外,促炎介质的表达分析了纳什的老鼠的肝脏ELISA和RT-qPCR。如数据所示6(一)和6 (b)MCD饮食5周后,肝肿瘤坏死因子的蛋白质含量α和il - 1β在MFG-E8高于野生型小鼠基因敲除小鼠(P< 0.01)。一致,炎症介质的mRNA水平TNF -α和il - 1β,以及il - 6、ICAM CCL2, CXCL2, TGF -β,表示进步的炎症反应和肝纤维化的肝脏明显升高MFG-E8基因敲除小鼠与MCD-WT组(图6 (c))。
(一)
(b)
(c)
3.7。MFG-E8淘汰赛促进MCD-Induced激活TLR4 / NF -κB信号在小鼠的肝脏
进一步探索潜在机制MFG-E8淘汰赛加剧纳什进展,利用免疫印迹检测TLR4 / NF -的激活κB信号通路。结果表明TLR4的水平,p-IRAK1, p-p38,和p-p65蛋白质的肝脏MCD-WT组明显高于CD-WT组,但总p38和p65蛋白水平并不重要。然而,MFG-E8淘汰赛明显调节肝TLR4的水平,p-IRAK1, p-p38, p-p65,表明MFG-E8淘汰赛增强MCD-induced TLR4信号激活(数字7(一)和7 (b))。因此,MCD-WT组相比,MFG-E8淘汰赛显著增加MCD-induced NF -κB激活,支持加强IKK的磷酸化β和我κBα我,以及增加κBα退化。此外,p65在亚细胞定位的分析表明,释放p65大幅转移从细胞质到核MFG-E8肝脏的基因敲除小鼠与WT组由MCD(数字7 (c)和7 (d))。
(一)
(b)
(c)
(d)
3.8。TLR4拮抗剂获救MFG-E8 Knockout-Enhanced TGs合成和促炎细胞因子由PA在原发性肝细胞刺激生产
评估是否TLR4介导MFG-E8 knockout-aggravated纳什MCD-fed小鼠表型,主肝细胞分离WT或MFG-E8基因敲除小鼠被爸爸有或没有刺激TLR4-specific拮抗剂tak - 242。与这些结果在活的有机体内动物实验中,MFG-E8淘汰赛肝细胞显示高脂滴的形成和TG合成,以及大量的炎性细胞因子TNF -α和il - 1β生产与野生型相比,在PA刺激肝细胞。然而,TLR4-specific拮抗剂tak - 242显著恢复MFG-E8 knockout-aggravated纳什表型,如所示降低脂滴的形成和TG合成,并削弱了炎性细胞因子的生产(图8),这表明TLR4可能参与在调制纳什MFG-E8发展的功能。
(一)
(b)
(c)
(d)
4所示。讨论
纳什,一个潜在的进步亚型导致肝硬化和肝癌的非酒精性脂肪肝与代谢综合征密切相关,负责全球相当大的经济负担26,27]。在目前的研究中,我们表明,MFG-E8纳什的发展起着重要的作用。我们的研究结果发现,MFG-E8淘汰赛明显增加血清ALT和AST活动,加剧了组织病理学肝损伤和肝脂质积累,促进肝脏炎症反应和纤维化引起的小鼠MCD饮食。
肝纤维化是一个主要的进步纳什的组织病理学特征,让患者肝硬化和肝细胞癌的风险。之前的一些研究表明,MFG-E8可能参与各器官和组织的纤维化的发病机制。例如,MFG-E8的表达显著下调僵化的皮肤损伤的系统性硬化患者皮肤纤维化,在周围的平滑肌细胞纤维化的呼吸道的哮喘患者,在肝硬化肝脏(18,28,29日]。表示,MFG-E8 KO小鼠患上严重的肺纤维化和皮肤纤维化在气管内的博来霉素管理局(28,30.]。同样,我们的结果表明,MFG-E8基因敲除小鼠相比表现出更严重的肝纤维化MCD-WT组。
越来越多的证据显示,脂质代谢的不平衡的主要病因肝脂肪变性和纤维化。肝脏中过多的脂质积累诱发代谢压力和lipotoxicity,导致肝实质细胞死亡。ppr的hepatocyte-death-released抑制激活先天免疫信号,触发持续炎症级联和进一步恶化代谢紊乱,最后,纳什进展。因此,脂质代谢紊乱的解剖和过度的先天免疫反应是重要的探索纳什的潜在机制和确定新药开发(31日- - - - - -33]。在这项研究中,MFG-E8敲除小鼠肝脂肪变性恶化在纳什,表明MFG-E8可能降低肝脂质生产通过直接或间接的分子机制。然而,先前的研究已经表明,MFG-E8促进脂肪酸的吸收,可能导致肥胖小鼠诱导CD36的易位和FATP1到细胞表面。这与我们现在的结果数据似乎是有争议的。然而,这份报告显示,MFG-E8主要影响脂肪细胞而不是肝细胞从血液中脂肪酸的吸收34]。此外,在我们的实验中,MCD饮食而不是高脂肪饮食- (HFD)诱导纳什模型使用。这两个纳什模型有明显不同的表现型和发病机理。MCD模型,缺乏蛋氨酸和胆碱在饮食中断VLDL组装,导致降低TG分泌,导致肝脂质积累(35]。事实上,脂质代谢紊乱参与肝脂质之间的不平衡输入和输出。最近,张等人报道,MFG-E8改善肝脂肪变性和炎症通过抑制细胞凋亡信号调节激酶1 (ASK1)和增殖蛋白激酶(MAPK)信号在肝细胞(21]。考虑到ASK1 MAPKs TLR4信号通路的下游分子,和脂质输出而不是其输入是MCD-induced纳什拒绝,我们推测,MFG-E8并不直接调节脂质代谢,但可能会阻止炎症cascade-worsened代谢紊乱通过抑制先天免疫TLR4信号。
这是承认代谢炎症是由先天免疫信号严格监管。肝巨噬细胞和中性粒细胞被确定为主要的先天免疫细胞在非酒精性脂肪肝36,37]。浸润的巨噬细胞和中性粒细胞分泌促炎细胞因子和趋化因子,促进肝脏炎症和纤维化的进展和加重肝脂肪变性38- - - - - -40]。建立数据建议MFG-E8可以抑制促炎介质的生产和减轻巨噬细胞和中性粒细胞浸润23,41- - - - - -43]。,在目前的研究中,通过免疫荧光染色和流式细胞术,我们发现MFG-E8淘汰赛表现出更严重的肝巨噬细胞和中性粒细胞浸润在纳什的老鼠的肝脏。此外,RT-qPCR和ELISA分析还表明,MFG-E8淘汰赛调节炎症介质的表达。
TLR4和NF -κB中发挥关键作用,固有免疫炎症反应密切相关的炎症介质和细胞损伤。它已经表明,激活TLR4 / NF -κB信号通路加剧炎症反应,促进纳什进展(10,44- - - - - -46]。我们之前报道的MCD饮食的老鼠表现出严重的炎症和肝损伤通过移植促炎细胞因子和趋化因子的表达,这正好与激活TLR4 / NF -κ在肝脏B信号通路(14]。此外,抑制TLR4和NF -κB激活可以发挥有益的治疗作用在几个纳什小鼠模型(47,48]。在其他炎症模型,MFG-E8还表示是有效衰减炎症反应通过抑制TLR4的激活/ NF -κB通路(22,23]。值得注意的是,一些以前的研究已经表明MFG-E8的表达是由激活的TLR信号表达下调在体外和在活的有机体内,这表明可能有负面的反馈TLR信号之间的相互交互,MFG-E8 [49,50]。在最近的研究中,应对TLR4 / NF -κB信号通路,以及炎症介质的水平升高,MCD-KO组的观察,表明MFG-E8在纳什的作用可能由TLR4 / NF -κB信号通路。此外,使用一个主肝细胞模型,我们发现特定的抑制TLR4可能有效救援MFG-E8 knockout-aggravated纳什表型。因此,我们的数据表明MFG-E8淘汰赛促进肝脂肪变性、炎症和纤维化MCD-induced纳什,这可能是通过激活TLR4 / NF -κB信号通路。
5。结论
总之,我们证实MFG-E8淘汰赛加剧了纳什的发展,和底层机制可能与TLR4 / NF -的激活κB信号通路,导致肝脏炎性细胞浸润和促炎介质生产。考虑MFG-E8击倒的角色在促进肝脏炎症和纤维化,是合理的期望目标MFG-E8改善纳什的结果可能是一个有前途的战略。
数据可用性
和/或使用的数据集分析在当前研究可从相应的作者以合理的要求。
伦理批准
所有动物实验的动物保健和使用委员会指南重庆医科大学。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
作者的贡献
所有作者的手稿和审查并批准了。XRY、JYW XG构思和设计实验。JH,高清,y, JL SWW进行了实验。分和JXY分析数据。JH, y, JYW XG收集文献和写的手稿。高清,JH, JYW XG修订后的手稿。所有作者已阅读及同意发布版本的手稿。所有作者阅读和批准最终的手稿。6月胡锦涛和回族Du贡献同样这项工作。
确认
我们感谢魏黄博士,同济医科大学,华中科技大学,动物和实验技术支持。这项工作是由中国国家自然科学基金的资助(批准号81600455)。