文摘

nod样受体(NLR)信号通路的激活可以促进下游细胞因子和促炎细胞因子释放,和炎症引起的营养过剩会导致肾代谢损伤。NLRs如何影响代谢过程,然后导致肾损伤的研究仍然不佳。与啮齿动物相比,minipigs更类似于人类和人类疾病研究的理想动物模型。在这项研究中,我们建立了一个糖尿病minipig模型通过高糖和高脂肪饮食结合链脲霉素(STZ)注入。血液生物标志物和肾病理标记,表达NLRP亚科成员(NLRP1和NLRP3)及其下游细胞因子(il - 1的前身β地震和成熟形式的il - 1β和地震),表达NLRC亚科成员(NLRC1、NLRC2 NLRC5)及其下游核因子-κB (NF -κB)信号通路的分子(IKKβ,我κBα和NF -κB p65)和炎性细胞因子(TNF -α白细胞介素- 6 (il - 6)和系统地评估。NLRP3的表达及其下游信号分子、细胞因子il - 1的前兆β和地震,il - 1的成熟的形式β和地震明显调节。NLRC1的表达水平,NLRC2 NLRC5和激活下游NF -κB通路分子phospho-IKKβ,phospho-IκBαNF -κB p65, phospho-NF -κB p65显著增加。肿瘤坏死因子-α在糖尿病和il - 6水平明显增加猪的肾脏。TGF -β/ Smad信号分子,TGF -β和P-SMAD2/3也增加。这些结果表明,代谢炎症激活NLRs可能在糖尿病肾损伤起着重要的作用。

1。介绍

糖尿病肾病(DN)的主要原因是终末期肾病(ESRD)。大约43.8% ESRD患者的第一诊断糖尿病(1]。DN是一种疾病,可能导致进行性肾纤维化或硬化,导致慢性肾功能衰竭(2]。尽管有很多相关的研究近年来,糖尿病肾病的具体发病机制尚不清楚。

目前,这两个先天免疫因素和适应性免疫因素被认为是2型糖尿病的发病机制相关(3]。先天免疫系统包括几个类的模式识别受体(ppr),包括膜结合toll样受体(通常),函数通过其分子模式(pamp)和nucleotide-binding寡聚化域nod样受体(NLRs),函数通过危险分子模式(抑制),调节促炎细胞因子和趋化因子的表达在细胞外空间(4,5]。NLRs可分为两个亚科,NLRP和NLRC6]。

的NLRP亚科包括14名成员。NLRP蛋白通过homomolecular oligomerizes交互和新兵PYD-CARD适配器蛋白质,ASC,蛋白酶caspase-1形成蛋白质复合体称为inflammasome [7,8]。inflammasome可以激活caspase-1 procaspase-1的蛋白水解乳沟。激活caspase-1转换细胞因子il - 1的前体形式β和地震到成熟的形式,这些细胞因子分泌到细胞外基质(9,10]。的NLRC亚新兵卡片与受体的蛋白激酶receptor-interacting蛋白2 (RIP2)受体识别脂多糖和细菌细胞壁的肽聚糖。这个分子激活增殖蛋白激酶(MAPKs)和核转录因子NF -κB (11]。研究已经证实,成员NLRP亚加剧坏死细胞的炎症反应在肾缺血再灌注损伤12),以及缺乏NLRC亚科成员可以通过减少肾细胞凋亡显著改善缺血再灌注肾损伤(13]。然而,这些NLR家庭成员扮演的角色在糖尿病肾脏损害的发展仍不清楚。

啮齿动物是糖尿病的经典动物模型研究[14]。然而,由于明显的体型差异,行为,寿命,和生活条件之间的人类和老鼠,有许多缺点啮齿动物的疾病模型。小型猪(minipigs)被认为是一个更好的选择比啮齿动物由于其高相似性对人类(消化系统和免疫系统)在解剖学(体型、心血管系统、皮肤、泌尿系统)和功能(15,16]。猪肾更类似于人类的肾脏形态学和功能。小萼收集系统的数量和双边或肾盂的镜像结构系统minipigs是类似于人类的17]。因此,猪,特别是minipigs研究人类肾脏疾病的理想模型。

在这项研究中,我们建立了一个糖尿病肾损伤模型通过使用低剂量链脲霉素(STZ)在巴马minipigs注入和高糖和高脂喂养。我们旨在系统地调查NLRs的变化在两个亚科和下游炎症反应信号通路的分子在肾组织minipig糖尿病模型。

2。材料和方法

2.1。动物和环境条件

总共14男中国巴马实验minipigs岁4个月了从动物学研究所国家重点实验室,中国科学院。住房条件如下:室温在18到22岁的°C,湿度30%至70%的人工照明8:00至20:00小时。所有参与实验的动物机构批准的动物保健和使用委员会中国人民解放军总医院。

2.2。实验小组和干预

Minipigs被随机分为两组:DM ( )组,这是美联储53%的高糖和高脂肪的饮食包括基底饮食、37%蔗糖、10%猪油和对照组(反对; ),这是美联储基底的饮食。每日喂食的量是3% minipigs的重量,一天两次。水是可以随意。DM组注射链脲霉素(STZ)的第一个月。我们混合28毫升的柠檬酸和22毫升的柠檬酸三钠的稀释100毫升的缓冲与蒸馏水pH值4.5。根据动物体重,一定是测量并提前准备。准备缓冲25 g / l STZ和过滤。禁食minipigs吃他们注射STZ前一夜之间。注射分为2剂量。50毫克/公斤剂量STZ是静脉注射到每个猪第一次在1 - 5分钟的时间。 The second injection was performed two weeks later with the same dose. The control group pigs were injected with the same dosage of citrate-sodium buffer.

2.3。血清生化分析

静脉的血液样本收集每月猪喂养期间测量空腹血糖(GLU)。收集的血清样本在3000转离心10分钟并存储在一个−80°C冷冻前分析。血清生化参数分析了在中央实验室由一个自动分析器(Cobas8000、罗氏、德国)。血糖检测邻甲苯胺法;胰岛素是由酶联免疫吸附试验检测到的。血尿素氮被diacetyl-oxime检测方法,肌酐检测由碱性苦味酸比色方法。TG、胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白GPO-PAP测定方法。

2.4。肾组织病理分析

Minipigs被连续的水合异氟烷吸入麻醉使用口罩,和肾组织切除。组织在4%多聚甲醛固定,石蜡嵌入式,分段在3 - 5毫米。周期性acid-Schiff (PAS)染色法被用来评估病变的肾脏结构minipigs。

2.5。免疫印迹

冷冻肾组织细胞溶解了radioimmunoprecipitation化验(里帕)裂解缓冲(55毫米Tris-Cl (pH值7.6),1% NP-40亮抑酶肽1μg / ml, 0.1% SDS, 0.5%去氧胆酸,和phenylmethyl-sulfonyl氟化物),离心机在4°C 12000 g 30分钟收集上层的细胞蛋白。蛋白质含量是由BCA蛋白质化验设备(热费希尔科学)。大约40μg从每个样本的蛋白质8% - -15% sds - page分离。样本从sds - page凝胶膜。膜被封锁和孵化抗体NLRP3(1: 1000年,Abcam ab264468) procaspase-1 (CST 1: 1000年,3866年),NLRP1(1: 1000年,Abcam ab36852) caspase-1 (CST 1: 1000年,4199年),pro-IL-1β春秋国旅(1:1000年,12703年),il - 1β(83186)1:1000年,春秋国旅pro-IL-18(1: 1000年,Abcam ab241528)地震(CST 1: 1000年,54943年),NLRC1 (CST 1: 1000年,3545年),NLRC2(1: 500年,Abcam ab31488) NLRC5(1: 1000年,圣克鲁斯生物技术、sc - 515668), phospho-IKKβ(1:1000年,Abcam ab59195) phospho-IκBα春秋国旅(1:1000年,9246年),NF -κAbcam Bp65(1: 1000年,ab31481), phospho-NF-Bp65 (CST 1: 1000年,3033年)、肿瘤坏死因子-α(1:1000年,Abcam ab183218), il - 6(1: 1000年,春秋国旅,12153),TGF -β(1:1000年,Abcam ab215715) P-SMAD2/3(1: 1000年,Abcam ab272332)β肌动蛋白(1:1000年,春秋国旅,4967)在一夜之间在4°C。这些墨迹随后被孵化与辣根peroxidase-conjugated anti-rabbit anti-mouse免疫球蛋白或稀释1:1000:4000。通过增强化学发光免疫反应性的乐队是可视化,微执行使用一个软件数量(Bio-Rad实验室)。ImageJ用于污点分析。

2.6。统计分析

统计分析采用SPSS 21.0统计软件包,和所有统计数据了 。学生的测试进行了比较两个独立的团体。的值 被认为是显示统计学意义。

3所示。结果

3.1。血和尿生化Minipig糖尿病模型的变化

8个月后注射STZ和进食高糖和高脂肪、血糖(GLU)、胰岛素(INS)水平的DM组minipigs显著增加( )相比正常的控制(CON)组。胆固醇(CHOL)和低密度脂蛋白胆固醇(低密度脂蛋白)也大幅增加( )DM组minipigs。然而,没有明显的变化之间的尿素氮和肌酐水平DM和反面组( )(见表1)。

3.2。病变在糖尿病肾脏Minipig模型

观察动物的肾脏组织病理和染色)和PAS染色。的肾脏minipigs DM组显示明显的病理变化,包括肾小球肥大、系膜基质增加,肾小管直径增大,而没有明显的组织学改变的肾脏CON组(见图1)。在上皮细胞足突的融合可以通过电子显微镜观察(见图2)。

3.3。的表达NLRP亚科和下游分子增加肾脏的糖尿病Minipigs

的NLRP亚科可以与procaspase-1 inflammasomes组装成高分子重量,然后,inflammasomes可以激活procaspase-1,通过酶转化为caspase-1乳沟。激活caspase-1可以促进pro-IL-1的成熟和分泌β和pro-IL-18内源性免疫反应中发挥重要作用。我们用免疫印迹分析评估NLRP1的表达和NLRP3代表的成员NLRP亚procaspase-1的表达和caspase-1, il - 1的前兆β和地震,il - 1的成熟的形式β和地震。

结果表明,NLRP3的水平在糖尿病肾脏组高于正常组( ),但NLRP1水平相比没有明显变化与正常组( )(图3(一个))。结果还表明,水平的procaspase-1, caspase-1 pro-IL-1βpro-IL-18, il - 1β,地震在糖尿病的肾脏组高于正常对照组( ),表明NLRP inflammasome增加在糖尿病肾脏损害(图3 (b)),激活下游的释放促炎介质(图3 (c))。

3.4。的表达NLRC亚科和下游信号通路的分子在糖尿病Minipigs肾脏的调节

的NLRC亚科可以激活NF -κB信号通路和调节炎症等因素的释放肿瘤坏死因子-α并在单核细胞il - 6。我们用免疫印迹检测NLRC1的表达的变化,和NLRC5代表NLRC2 NLRC亚科的成员。然后,我们进一步评估表达式或激活状态的NF -κIKK B信号通路分子β,我κB和NF -κB和炎性因子TNF的表达变化α和il - 6的下游NLRC。

NLRC2 NLRC1的表达水平,和NLRC5 NLRC亚科是高于正常对照组( )(图4(一)的水平),这表明NLRC亚科成员增加minipigs与糖尿病肾损伤。结果还表明,在糖尿病肾脏,NF -的水平κphospho-IKK B信号通路分子β(激活IKKβ),phospho-IκBα(激活我κBα),NF -κB p65, phospho-NF -κNF - B p65(激活κB p65)明显高于CON肾脏(图4 (b)),表明NF -κB信号通路被激活在糖尿病肾脏损伤的发展。此外,肿瘤坏死因子的水平α和il - 6在糖尿病的肾脏组高于正常对照组( ),这表明,炎症因子的释放肿瘤坏死因子-α和il - 6增加糖尿病肾脏受损时(图4 (c))。

3.5。表达式的TGF -β/ Smad分子信号通路在糖尿病Minipigs肾脏的调节

TGF -β(转化生长因子β)是一种多功能生长因子。作为一个效应分子,TGF -β已被广泛研究糖尿病肾病的主要中介。Smad蛋白质是下游中介细胞内信号转导的分子。我们用免疫印迹检测TGF -的表达β/ Smad信号通路的分子。

TGF -的表达水平β和P-SMAD2/3高于正常对照组( )(图5),表明TGF -β/ Smad信号通路被激活在糖尿病肾脏损伤的发展。

4所示。讨论

目前,全球糖尿病患者的数量正在增加,原因尚不清楚。许多实验动物用于糖尿病的研究。例如,灵长类动物猕猴类似于人类和适合研究糖尿病,但成本很高。啮齿动物,如老鼠和老鼠,是最常见的动物用于研究,但他们的器官和功能是完全不同的人。目前,minipigs已经越来越多地用于建立糖尿病模型。主要原因是minipigs非常类似于人类的功能和结构。INS多肽链的氨基酸组成minipigs非常类似于人类,只有一个氨基酸差异(位于30 B链的氨基酸;人类已经在这个位置,苏氨酸和猪有丙氨酸)18]。在心血管系统方面,形态结构、系统源代码,minipigs的生理特征也与人类相似的(19]。在饮食方面,猪是杂食动物,和人类一样,和它们的代谢特征,如碳水化合物和脂质代谢,也类似于人类的20.]。老鼠和其他啮齿动物相比,minipigs更类似于人类消化道的结构,皮下药物管理和胰岛细胞的形态和人类具有很多相似之处的代谢和药物动力学。因此,minipigs是理想的动物研究糖尿病及其并发症。

高糖和高脂喂养结合注射STZ诱导2型糖尿病是一种常见的方法模型(21]。小型猪喂食高脂肪的饮食和静脉注射STZ导致一个稳定的2型糖尿病动物模型22],它的特点是温和的高血糖,高血脂,高血压,和INS阻力。这种方法在minipigs可以被视为一个理想的选择建立糖尿病模型。这一发现是符合我们的方法建立疾病模型和观察到的现象。我们使用稳定的巴马minipigs给予高糖和高脂肪饮食结合注射STZ建立疾病模型。我们注意到,与正常对照组相比,血GLU水平和糖尿病minipigs INS水平显著增加( )。PAS染色结果表明,糖尿病模型组病理变化有明显的肾小球肥大和肾小管直径肿大为主要表现,这是符合两个相关型糖尿病肾脏损害的病理表现,而正常对照组显示结构没有明显变化。上述结果表明,我们建立了一个稳定minipig 2型糖尿病肾损伤的模型。

代谢炎症主要指的是一种炎症过程造成的过剩营养和新陈代谢。这一过程的分子机制和信号通路具有很多相似之处,这些传统的炎性反应,这种现象是不同于一个缓慢的炎症反应(23,24]。近年来,研究表明,免疫受体介导的信号通路中也扮演着重要的角色在代谢炎症在糖尿病(25]。nod样受体(NLRs)属于胞内传感器分子的类(26]。一些nod样受体,被刺激,激活后,形成一个大的蛋白复合物称为“inflammasome”[27]。inflammasome可以转化前体caspase-1 caspase-1激活,这可以进一步打通炎症因素如il - 1的前兆β和地震,生成成熟的形式,最后释放到细胞外空间,引发炎症反应。的NLRP亚科成员,NLRP1 NLRP3,参与inflammasomes的组装。慢性炎症可能是一个重要的2型糖尿病的发病机理。除了glucotoxicity lipotoxicity, NLRP3 inflammasome在这一过程中可能发挥重要作用[28]。我们检测到的表达NLRP亚科成员minipigs糖尿病肾脏的炎症组件procaspase-1 caspase-1, pro-IL-1下游炎症因素β和il - 1βpro-IL-18和地震。结果表明,这些蛋白质的表达显著调节糖尿病组,表明inflammasome被激活释放炎症因子在糖尿病肾损伤。身体处于代谢炎症状态。

代谢炎症免疫异常的主要原因引起的过度摄入的营养(29日]。的分子和细胞基础代谢炎症包括NF -κB, C-Jun n端激酶(物)通路,内质网压力。NF -κB,一个共同的因素,已经被多个研究证实炎症反应,它起着关键作用作为核心转录因子在各种监管途径。激活NF -κB是参与搬迁的巨噬细胞,进一步激活炎症反应通路。在受伤期间,抑制剂kappaB (IκB)将被分离后,进入细胞核NF -κB是刺激。这种分子可以调节基因转录的激活和诱导细胞合成途径如TNF -α特别是绑定后,il - 6和其他大分子DNA (30.]。研究表明,营养过剩会引起核转录因子NF -κB促进各种免疫炎症因子的表达,如肿瘤坏死因子-α和il - 6,触发组织进入高免疫炎症激活状态(31日]。我们检测到的蛋白表达NF -κB通路和下游minipigs糖尿病肾脏的炎症因素。我们发现phospho-I的水平κBα,phospho-IKKβphospho-NF -κB p65, NF -κB p65, TNF -α,il - 6显著调节糖尿病组与正常对照组相比,表明NF -κB信号通路被激活和炎症因素在糖尿病minipigs的肾脏被释放。

一些证据表明,TGF -β糖尿病肾病是一个重要的中介。在啮齿动物糖尿病模型,TGF -的水平β1信使rna和蛋白质在肾小球和肾小管增加(32,33]。TGF -β/ Smad信号通路,TGF -β结合TβRII受体磷酸化,然后形成一个TGF -β复杂的绑定到TβRІ受体。复杂的进一步激活下游信号蛋白Smad2 Smad3和最终运送到细胞核直接与DNA结合,调节靶基因的转录调节34,35]。与糖尿病肾病啮齿动物,细胞内Smad通路显著激活,TGF -电转换β信号(36]。我们检测到蛋白表达的TGF -β/ Smad通路因素在糖尿病小型猪的肾脏。我们发现TGF -的水平β和P-SMAD2/3调节糖尿病组与正常对照组相比,表明TGF -β/ Smad信号通路被激活在糖尿病minipigs肾脏,这与啮齿动物的变化是一致的。

5。结论

综上所述,我们成功地建立了一个糖尿病小型猪模型,并证明了两个NLR亚科,NLRPs NLRCs,被激活,然后提升下游炎症因子表达和分泌导致肾组织代谢炎症,最终导致糖尿病肾损害的发生和发展。这项研究提供了一个基础的未来发展目标NLR信号通路抑制剂分子和用于治疗糖尿病的肾损伤。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的结果包括在本文中。

的利益冲突

作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。

确认

这项工作是支持由中国国家自然科学基金项目(81670671和81670671号),中国北京科技项目(没有。D171100002817002),自然科学基金(81700629)。