文摘
探索的作用和可能机制microrna在心力衰竭(HF) - 212。腹主缢痕的大鼠模型,观察心肌形态学的变化hematoxylin-eosin(他)染色和hypertrophy-related标记分子被定量实时聚合酶链反应检测(存在)。在细胞水平上,去甲肾上腺素和血管紧张素ⅱ诱导心肌细胞肥大。mir - 212建立了腺病毒的过度表达,mir - 212的表达中,及其对心脏肥大的影响(CH)检测到免疫荧光和存在。然后,mir - 212规范CH的机制是网站预测,验证了荧光素酶报告基因检测,存在,免疫印迹分析。成功建立大鼠模型中的腹主缢痕和心肌细胞肥大、ANP和myh7大幅度增加,myh6表达减少,microrna - 212表达增加。过度的microrna - 212在心肌细胞可以促进心肌细胞肥大,推倒mir - 212在心肌细胞可以部分逆转细胞肥大。此外,mir - 212目标TCF7L2,抑制这个基因的表达。microrna TCF7L2 - 212目标,抑制这个基因的表达,可能通过这种途径,促进心肌细胞肥大。
1。介绍
心血管疾病,尤其是心力衰竭(HF),一直是一个严重威胁人类健康1]。高频是心脏结构和功能失调的综合征引起的各种生理因素,表现为心室收缩射血或舒张期功能障碍,从而导致临床症状如端坐呼吸、夜间阵发性呼吸困难、下肢凹陷性水肿,和疲劳2]。尽管治疗心衰的发展,其高发病率和死亡率仍影响公众健康和社会经济发展的重要问题3]。根据分析,高频住院的主要原因之一老人65多岁了,这是要解决的主要健康问题之一(4]。各种心血管疾病,它最终会导致心力衰竭,包括心肌梗死后压力过载(主动脉瓣狭窄和穷人的控制高血压),炎症(心肌炎)和过载能力的肥厚性心肌病(瓣膜返流),基因遗传性心肌病,和药物因素(如酒精和毒品如可卡因,与心脏损伤副作用阿霉素)(5]。心力衰竭的机制是一个复杂的信号级联反应细胞和分子生理学变化之间的监管疾病:心肌细胞,心肌肥大(MH),电生理变化,收缩功能障碍,氧化应激,代谢紊乱,细胞外基质重塑,细胞凋亡和坏死。最后,它会导致心肌病的理性重建,与心输出量减少、血瘀,容量负荷增加,慢性填充压力增加,缺氧、水肿。与心力衰竭的发病机制研究的深入,细胞和分子信号的监管已经吸引了越来越多的关注(6]。
非编码RNA (ncRNA) RNA的家庭是一个重要的监管RNA,包括各种不同的子组,如小微RNA序列(microRNA, tRNA,核内小RNA和snoRNA),大长非编码RNA序列(lncRNA)和circularRNA (circRNA),可以参与心力衰竭过程重要监管因素(7]。microrna基因在进化过程中高度保守的和可以作为独立的转录单位转录基因间或者蛋白编码基因的内含子和外显子区域8]。研究表明,microrna在每一个环节起到至关重要的监管作用的心脏疾病的发生和发展,参与调节血管生成,MH,心肌细胞和间质纤维化炎症反应、细胞凋亡、坏死(9]。
心力衰竭的病理过程涉及CH。MH在细胞体积增加;蛋白质分泌增加肌节组织的病理过程的特点;可能会导致血液动力学、缺血性损伤和神经内分泌失衡,各种病理条件下,如胎儿基因表达,其内部机制兴奋收缩偶联的变化,能量代谢,平衡,分子机制参与2 +依赖的方式,和PI3K / Akt通路10]。研究表明,许多microrna在积极或消极的方式调节的分子机制CH。例如,miR-23a的表情,miR-27b, mir - 125 b, mir - 195在早期阶段调节主动脉瓣狭窄造成的CH (11],虽然miR-23a的表情,miR-23b miR-24, mir - 125 b, mir - 195, mir - 199 a,和mir - 214是调节在以后的阶段,虽然mir - 93的表情,mir - 133 a, mir - 150, mir - 181 - b表达下调(12),而miR-34a miR-28, mir - 148 a, mir - 93是调节和mir - 126和其他的microrna表达下调对高频肥大引起的肺动脉狭窄(13]。当前研究表明miR-1、miR-18 miR-19, mir - 133, mir - 378, mir - 185,和mir - 155可以抑制各种类型的CH, mir - 208家庭,mir - 100, mir - 125 b, mir - 214, mir - 212, miR-23, miR-24, mir - 195, mir - 199 a能促进CH (14]。
目前已知的高频BNP和中位数水平以上病人诊断标记,具有灵敏度高,但特异性较低。microrna的深入研究,microrna可能成为一个高频的新标志。大多数microrna存在于心肌细胞但也可以检测到在体液(血清、血浆和尿液),专门与高频和高特异性的生理过程14]。福岛等人发现,等离子体mir - 126的表达在慢性心力衰竭患者较低的中位数水平以上病人的表达升高,表明它可能被用作高频的标志(15]。其他的研究发现,miR-18a-5p的表达水平,miR-26b-5p,在急性心力衰竭和miR-30b下降,而mir - 499是高表达(14]。然而,由于小样本大小等因素有限,缺乏标准化的检测方法,microrna的诊断作用仍需进一步探讨。microrna在转录后的水平中扮演一个重要的监管作用,因此潜在的治疗目标。
研究表明,在促进CH mir - 212起着作用,但其机制尚未完全揭示[16,17]。本研究选择mir - 212为研究对象,探索microrna的功能和机制- 212在MH的过程。
2。材料和方法
2.1。动物实验
SD大鼠,重约200 - 220克,都从Weitonglihua购买公司(中国,北京)和美联储的动物中心医院。老鼠禁食12小时后适应环境和浇水3天后定期喂养。腹腔开放在无菌的环境中,和腹主动脉与钳钝角与筋膜分离。腹主动脉注定分离,与0.6毫米针形管(南京建成,中国)与丝线,针形管取出,腹部后缝合皮肤被关闭。腹主动脉不结扎的虚假的集团,和其余的操作是相同的。喂养的大鼠4周后,大鼠的心脏功能是由超声心动图检查(飞利浦、埃因霍温、荷兰)在老鼠牺牲之前。麻醉后,大鼠心脏很快被删除从左心室和孤立。血彻底洗了磷酸盐(PBS)解决方案(Beyotime、上海、中国)消除了血液和存储在-80°C冰箱以备后用。本研究动物伦理委员会批准沭阳县医院中医动物中心。
2.2。细胞培养
新生儿喂奶老鼠和75%的酒精消毒(南京建成,中国)喂奶老鼠的皮肤表面1 - 3天。皮肤的肋缘下喂奶的老鼠被切断了超级干净的桌子,心脏被曝光,和钳被移除。它很快就被放置在预冻D-Hanks解决方案(Elabscience,武汉,中国),心房被移除时,血液在心脏洗,心室都切成小块的大小< 1毫米3眼科剪(Belevo(北京)医疗科技有限公司,有限公司,北京,中国),和血液进一步洗。获得的心肌组织放置在培养皿中直径6厘米,稀释1%胶原酶(Elabscience,武汉,中国)和1 x D-Hanks解决方案(Elabscience,武汉,中国)比1:4,放置在一个冰箱在4°C。15个小时后,组织块被浑浊的悬架用吸管。获得的悬架被添加到15毫升离心管,紧随其后的是一个完整的杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM;生命科技,武汉,中国文化解决方案终止消化。悬架是离心机为5分钟1000转的速度,和上层的删除。这些细胞被加上一个完整的DMEM培养液10毫升,转移到10厘米培养皿。1小时后,培养基被轻轻敲了敲门,动摇了。培养基被转移到另一个10厘米培养皿。前面的过程重复。 After 24 hours, Brdu (Elabscience, Wuhan, China) was added at a concentration of 1% to inhibit the proliferation of nonmyocardial cells, and the culture was continued in a CO2恒温培养箱。更换后的48小时内DMEM解决方案(不含血清和链霉素),进一步确保一致性的心肌细胞。心肌细胞在无血清培养条件下12小时后,100微米加入苯肾上腺素的浓度(PE、Tianpu生化制药、广州、中国)和最终浓度的趋势1 / L Angⅱ(Tianpu生化制药、广州、中国)刺激肌细胞;48小时后在荧光显微镜下观察细胞形态,提取RNA,拯救-20°C的冰箱的实验。
2.3。蛋白免疫印迹技术
细胞培养板用PBS, 50 - 70μL radioimmunoprecipitation化验(里帕;热费希尔科学、沃尔瑟姆,妈,美国)溶菌产物被添加到每个好,和冰磨杆为20多岁的3倍,其次是30年代的涡匀浆。细胞被左派在冰面上5分钟,然后离心3次为4°C g在14000×30分钟。上层的拍摄,和总蛋白浓度由bicinchoninic酸(BCA)蛋白质浓度测量设备(南京建成,中国)。总蛋白加载20 ~ 50μg是由钠十二烷基sulphate-polyacrylamide凝胶电泳(sds - page)和分离蛋白被转移到一家聚乙二烯二氟化物(PVDF;热费希尔科学、沃尔瑟姆,妈,美国)膜。5%的脱脂奶粉密封后1小时,这是一夜之间孵化主要与相应抗体(美国TCF7L2, Abcam、剑桥、马,兔子,1:2000;美国GAPDH、Proteintech Rosemont, IL 1: 2000)在4°C,洗PBST 0.1%解决方案,和coincubated二级抗体(山羊anti-rabbit免疫球蛋白抗体,Yifei雪生物技术,南京,中国,1:2000),和增强化学发光(ECL)技术是用于开发免疫印迹乐队,和灰度分析软件用于定量分析。
2.4。定量实时聚合酶链反应(存在)
microrna的具体反转录引物结合相应的microrna是reverse-transcribed成互补脱氧核糖核酸的逆转录酶反应系统,和模板片段被放大。反应过程是:16°C, 30分钟,42°C 90分钟。反转录后的产品由40倍稀释,根据指令执行PCR(热费希尔科学、沃尔瑟姆,妈,美国)。反应过程如下:95°C, 20年代;58°C, 15秒;和72°C, 20年代,40周期。GAPDH作为一个内部参考使用的反应系统,和分析的结果中存在。表达的结果相对倍数比较每组目标分子的相关内容。使用引物如表所示1。
2.5。Hematoxylin-Eosin(他)染色
移除心脏与PBS溶液洗了三次,固定在4%多聚甲醛(化学试剂国药控股、上海、中国)来维持细胞的初始形状。组织与PBS洗和低浓度酒精脱水先后高浓度的酒精逐步消除心肌组织中的水。酒精在心肌组织被二甲苯(上海化学试剂国药控股,中国)。组织被熔化的石蜡(化学试剂国药控股、上海、中国)约2 - 3小时,然后凝固成块。然后,我们用切片机包切成薄片。部分被浸泡在二甲苯(化学试剂国药控股、上海、中国)约5分钟,然后,部分被浸泡在梯度乙醇多次,每次约5分钟。与苏木精染色后(化学试剂国药控股、上海、中国)大约10分钟,用苏木精冲洗,然后加入酸醇10年代分色,与PBS冲洗,然后用1%伊红染色(化学试剂国药控股、上海、中国)10分钟,然后用蒸馏水清洗去除曙红。又纯酒精脱水,二甲苯的部分是透明的。添加胶透明片,盖上盖玻片,密封片与相应的标签。
2.6。免疫荧光
常规隔离后,大鼠心肌细胞接种密度 在24-well细胞培养皿中,刺激的体育和Angⅱ实验组和那些不刺激对照组。DMEM和PBS溶液吸收和洗3次。然后,4%多聚甲醛加入修复心肌细胞,这是固定在室温下约30分钟。然后,PBS加入浸泡清洗,他们放置在一个振动台大约15分钟。10% BSA(牛血清白蛋白、热费希尔科学、沃尔瑟姆,妈,美国)被密封在室温下10分钟,用PBS溶液洗一次,一夜之间孵化与抗体a-actinin(美国Abcam、剑桥、马,兔子,1:1000)在室温下。用PBS含有0.1%吐温为3次,每次大约10分钟。孵化与荧光标记二次抗体为2分钟。重复上述步骤清洗。
2.7。Double-Luciferase报告基因分析
完整的DMEM用于文化293 t细胞(写明ATCC马纳萨斯,弗吉尼亚州,美国),Lipofectamine2000年(1 UI /孔;研发系统,明尼阿波利斯,美国)和opti介质(50 UI /孔)彻底整合,mir - 212过表达质粒(400 ng /孔;研发系统,明尼阿波利斯,美国),opti介质(50 UI /孔)彻底整合,pGL3重组质粒(200 ng /孔;研发系统,明尼阿波利斯,美国)和opti介质(50 UI /孔)彻底整合,让站了5分钟。三个混合系统被彻底混合,室温下休息20分钟。然后,他们统一添加到细胞培养菜肴和继续经常在细胞培养箱培养24小时。293 t细胞被完全溶解,细胞溶解产物。10μL细胞溶解产物了,40岁μL荧光素酶检测试剂(研发系统,明尼阿波利斯,美国)添加到生成萤火虫荧光信号。萤火虫荧光素酶报告基因的荧光检测器测量值,我们终于添加40μL海肾荧光素酶底物样本,混合10秒后,终止上述反应,开始海肾荧光素酶反应。最后,我们测量的荧光信号。
2.8。统计分析
数据被表示为 。所有的实验都重复3次。 - - - - - -测试是用于比较两组。我们默认的 ,这是一个显著差异。
3所示。结果
3.1。鉴定大鼠的腹主动脉缩窄模型和肥大
腹主动脉结扎后,SD大鼠心脏后负荷增加,为了维持正常的血液供应,同时,老城系统被激活,由于心脏收缩蛋白质合成增加,发生代偿性肥大,心脏重量/体重(毫克/克)增加(图1(一))。他心脏的左心室的染色显示,心脏急剧增加的外观腹主动脉结扎后4周。与此同时,他的纵切面染色显示,与虚假的集团相比,左心室壁肥厚组显著增厚,左心室腔是减少,呈现向心肥大(图1 (b))。CH重构过程中,一些胎儿基因表达。常用的分子标记在文献中包括心房利钠肽(ANP)、肌凝蛋白重链6 (myh6)和肌凝蛋白重链7 (myh7)。这些分子的表达水平通常可以反映CH或心力衰竭的程度。因此,在这个实验中,我们会发现这些标记分子的表达水平存在。中存在的研究结果表明,与虚假的集团相比,ANP表达显著增加,myh6减少,myh7增加4 w结扎后,可能与心脏的代偿机制(图1 (c))。总的来说,结果表明,该模型是成功的。
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3.2。主要MH模型的识别
在这项研究中,我们使用古典(PE)和去氧肾上腺素和II诱导心肌细胞肥大。经过2天的感应通过体育和Angⅱ,心肌细胞击败。a-actinin标记的特异性并行细胞免疫荧光染色后,我们可以看到图2(一个):贴壁心肌细胞是三角形或梭形,控制细胞相对持平,PE组心肌细胞完整,显然增加了表面积,而在对照组和PE诱导CH组视觉的10个领域里的100个细胞被随机选择和他们的面积测量。体育组,细胞表面面积较对照组增加(图2 (b))。与100年细胞被刺激μM PE和10μM Angⅱ12 h饥饿诱导后,和RNA提取传统文化来检测后48小时内ANP的信使RNA表达水平,myh6和myh7分别。结果表明,ANP的表达式在PE组和Angⅱ组显著增加,而myh6的表情和myh7没有显著改变了体育组(图2 (c)),myh7的表达水平增加Angⅱ组,有统计学差异(图2 (d))。总的来说,结果表明成功的细胞模型。
(一)
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3.3。mir - 212促进CH
microrna的特定高的丰富性表达心中经常扮演着一个极其重要的生物功能在心力衰竭的发生和发展。mir - 212的表达水平检测肥大模型,并发现mir - 212的表达增加大鼠模型为4周腹主缢痕,mir - 212的表达也显著肥大心肌细胞诱导的模型增加了体育和Angⅱ(图3(一个)),这表明mir - 212可能参与调节CH。然后,腺病毒空载体(Ad-vector)作为对照组,和mir - 212过表达腺病毒转染成心肌细胞作为实验组。在荧光显微镜下,我们观察到,大多数心肌细胞可以释放强大的绿色荧光,这证明腺病毒转染是有效的(图3 (b))。我们发现mir - 212的表达水平存在转染主要心脏细胞,和结果表明,mir - 212的表达水平增加了转染后的广告- mir - 212(图3 (c)),这证明了过表达腺病毒的建设是成功的。首先,存在被用来检测ANP的表达变化,myh6, myh7细胞的两组。饥饿后的结果表明,相同压力、细胞的转染与广告- mir - 212在ANP和myh7大幅上升,并减少myh6与对照组相比(图3 (d))。因此,我们推测,mir - 212超表达促进初级CH。此外,在细胞免疫荧光检测,mir - 212的超表达主要心肌细胞促进心肌细胞肥大(图3 (e))。与PE-induced CH组相比,mir - 212表达显著下调后PE-induced转染mir - 212抑制剂(图3 (f))。此外,ANP水平也降低(图3 (g)),这表明击倒mir - 212 a的表达在肥厚性心肌细胞可以有效地扭转肥大心肌细胞的水平。
(一)
(b)
(c)
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(f)
(g)
3.4。针对TCF7L2 mir - 212调节CH
我们使用了Targetscan网站(https://www.targetscan.org/vert_80/)预测的潜在目标基因mir - 212。通过检索,我们发现老鼠TCF7L2 mir - 148 a的可能行动网站3UTR区域,及匹配情况图(图中所示4(一))。作为T细胞因子/淋巴细胞增强因子(TCF /中位数)的家庭,TCF7L2是下游核转录因子的古典Wnt /β连环蛋白信号通路,并参与调节细胞增殖和分化18]。最近的研究发现了一个重大TCF7L2基因多态性与糖尿病之间的联系。TCF7L2参与分泌的规定,胰岛细胞的增殖和凋亡[19]。然后,mir - 212与TCF7L2交互的序列插入到3UTR区域记者质粒。与广告- microrna - 212,转染后293 t细胞显著抑制荧光素酶表达TCF7L2行动网站(图4 (b))。接下来,我们中mir - 212在初级心脏细胞,检测到的表达变化TCF7L2存在和免疫印迹。后发现,过度的microrna - 212, TCF7L2(减少数据的表达4 (c)和4 (d))。进一步的证据表明,mir - 212可能调节CH通过瞄准TCF7L2(图5)。
(一)
(b)
(c)
(d)
4所示。讨论
我们建造了一个模型的MH组织细胞水平。结果相互验证,证实了模型的成功建设;它可以为进一步的研究提供良好的实验基础,平台在microrna的表达和功能在MH - 212。与此同时,我们进一步确定,mir - 212的表达水平的调节高频模型。然后,心肌细胞动作电位mir - 212的表达是人为干扰与过表达腺病毒转染和抑制剂。然而,击倒mir - 212可以逆转细胞肥大引起体育在一定程度上。然后,我们预测microrna的下游靶基因- 212通过网站和验证mir - 212的规定,针对TCF7L2 CH的荧光素酶报告基因实验中,存在和白平衡。
心室重塑是慢性心力衰竭的病理基础。根据实验的结果,大鼠心脏显示明显的左心室肥大和心室扩大经过4周的建模。他染色显示心肌细胞肥大和无序排列的特点,心肌间质纤维化,核增厚,增加心肌肌小节。此外,对老鼠的心力衰竭的症状都表明,腹主模型是一个成熟和可靠的方法。心力衰竭的原因有很多,和模型的选择往往是决定根据疾病的原因。腹主缢痕是由于CH压力负荷过度造成的,和心脏逐渐从代偿阶段到失代偿阶段。因此,这个模型相对应的临床疾病更类似于高频由高血压引起心肌病(20.]。
肌球蛋白是心肌的生理结构的一个重要组成部分,也起着重要的生物功能;肌球蛋白重链(MYHC)起着至关重要的作用在心脏收缩功能。相对应的编码蛋白质myh6和myh7分别a-MYHC p-MYHC。虽然这两个位于同一染色体的基因,其表达调控是相互独立的。当心肌细胞的年龄,由于胎儿的基因表达的变化,相比舒张和收缩功能降低正常心肌细胞。在基因层面,SERCA2的表达降低,转化为myh7 myh6, ACTA1的表达水平增加(21]。因为高频往往伴随着心肌结构的变化,myh6 myh7变化的表达水平也可以是一个很好的代表心脏功能的变化。
研究表明,高频的过程中,大量的microrna的表达特异表达,起着至关重要的作用在调节心肌重构的过程。纠正microrna的表达将有一个重要的反转效应在MH。microrna的使用作为心力衰竭的诊断标志物在临床被广泛报道22]。Sinfield等人提出,mir - 423 - 5 - p可以用作高频(诊断标记23]。此外,miR-1, mir - 133, mir - 499,在急性心肌梗塞和mir - 208都是显著升高,并进一步分析了验证microrna的作用[24]。造成的受损心脏收缩性失衡的钙泵高频的过程中是一个重要的标志。研究发现,mir - 765高频样本中,可以增加蛋白磷酸酶的活性PP-1和增加钙循环的去磷酸化蛋白质通过抑制内源性inhibitor-1。miR-25也被认为在高频抑制钙泵SERCA2a并导致高频(25]。抑制miR-25的表达可以有效地恢复心脏收缩功能和改善心力衰竭病人的存活率。此外,microrna在MH的过程中可能被用来作为一个新的生物标志物预测和诊断心力衰竭。从这个意义上讲,mir - 212的功能研究在临床工作也很重要。然而,本研究仍存在一些局限性。例如,我们没有测试击倒或超表达mir - 212是否会影响心肌肥大在动物模型。更重要的是,在我们预测TCF7L2 mir - 212可能的目标基因,我们没有进一步的验证目标基因的准确性通过干扰TCF7L2的表达。在未来,我们的研究小组将进一步开展上述未完成的实验的前提下足够的资金,以便更好的说明这个研究的临床价值。
5。结论
microrna TCF7L2 - 212目标,抑制这个基因的表达,可能通过这种途径,促进心肌细胞肥大。当前研究的结果可以为心肌细胞肥大的治疗提供新的见解。
缩写
| 心力衰竭: | 心脏衰竭 |
| 他: | Hematoxylin-eosin |
| 存在: | 定量实时聚合酶链反应 |
| CH: | 心脏肥大 |
| MH: | 心肌肥厚 |
| ncRNA: | 非编码RNA |
| lncRNA: | 长非编码RNA |
| circRNA: | CircularRNA |
| microrna的: | 微 |
| 一种蛋白激酶: | 磷脂酰肌醇3激酶(PI3K) /蛋白激酶B |
| 法国巴黎: | 脑利钠肽 |
| SD: | Sprague-Dawley |
| PBS: | 磷酸盐 |
| DMEM: | 杜尔贝科修改鹰的媒介 |
| 体育: | 苯肾上腺素 |
| 里帕: | Radioimmunoprecipitation化验 |
| BCA: | Bicinchoninic酸 |
| sds - page: | 钠十二烷基sulphate-polyacrylamide凝胶电泳 |
| PVDF: | 聚乙二烯二氟化物 |
| GAPDH: | Glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶 |
| 发射极耦合逻辑: | 增强化学发光 |
| PBST: | 磷酸盐saline-tween |
| 互补脱氧核糖核酸: | 互补脱氧核糖核酸 |
| BSA: | 牛血清白蛋白 |
| 写明ATCC: | 美式文化收藏 |
| 老城: | 肾素血管紧张素醛固酮系统 |
| ANP: | 心房利钠肽 |
| myh6: | 肌凝蛋白重链6 |
| myh7: | 肌凝蛋白重链7 |
| TCF /中位数: | T细胞因子/淋巴细胞增强因子 |
| MYHC: | 肌凝蛋白重链。 |
数据可用性
使用的数据集和分析在当前研究可从相应的作者以合理的要求。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。