文摘

背景。自然biflavone Amentoflavone,发挥抗炎、抗氧化、antiapoptosis对许多疾病的影响。然而,amentoflavone neuroinflammation-related疾病的机理尚未全面检查清楚。方法。BV2小胶质细胞治疗amentoflavone (10μ米),其次是脂多糖(LPS)。小胶质激活和迁移能力和促炎细胞因子的表达和其它信号蛋白测定使用免疫组织化学、免疫荧光、定量实时聚合酶链反应、免疫印迹,酶联免疫吸附试验和愈合化验。结果。Amentoflavone恢复LPS-induced小胶质细胞活化、迁移和炎症反应,取决于调节toll样受体4 (TLR4) / 88 (MyD88) /骨髓分化因素核转录因子(NF -κBκB)途径。此外,amentoflavone还增强核转录因子红细胞两个相关因子2 (Nrf2) /血红素oxygenase-1 (HO-1)水平LPS-treated BV2小胶质细胞。结论。Amentoflavone改善LPS-induced BV2小胶质细胞的神经炎症反应和氧化应激。这些数据提供了新的见解的机理amentoflavone neuroinflammation-related疾病的治疗。因此,amentoflavone可能是一个潜在的神经系统疾病的治疗选择。

1。介绍

神经炎症可以引发或加重一些中枢神经系统(CNS)疾病,如阿尔茨海默病(1),癫痫(2),和帕金森病(3]。长期反复的刺激炎症会导致神经系统损伤和神经退行性变的,导致进步和永久丧失神经元在大脑的特定区域(4]。主要发生在小胶质细胞和炎症会影响免疫系统的调节和神经系统疾病的恶化5]。小胶质细胞激活展品神经保护作用,扮演防守角色,以抵消有害的急性损伤。然而,长期和重复激活的小胶质细胞和神经毒性反应,诱发神经炎症可能引发或加剧神经系统损伤,导致循环细胞因子的释放,最终导致各种中枢神经系统疾病(6,7]。因此,抗炎治疗可能是一种有前途的战略或neurodegeneration-related疾病治疗神经炎症。

toll样受体(TLR)信号通路包含一个家族的受体,其为病原体识别的分子模式(pamp),能够抵御入侵的微生物检测先天和适应性免疫系统(8]。TLR4大多是小胶质细胞中表达,是一种最重要的pamp TLR家族(9]。TLR4激活已经证明负责慢性炎症出现在阿尔茨海默病(10),癫痫(11,12),帕金森病(13),和其他神经系统疾病(14]。TLR4激活的胶质会引发严重的神经炎症反应水平。重要的是要注意,TLR4可以激活下游信号通路,它们强烈与中枢神经系统疾病的发展,如骨髓分化主要反应88 - (MyD88)依赖和NF -κB信号通路;这些途径可以引发并加剧炎症反应释放各种促炎细胞因子和介质,如interleukin-1β(il - 1β)、肿瘤坏死因子-α(肿瘤坏死因子-α)、cyclooxygenase-2诱导一氧化氮合酶(间接宾语),以及随后生成一氧化氮(NO) (15]。因此,TLR4 MyD88 / NF -κB通路可能是一个有前途的目标或neurodegeneration-related疾病治疗神经炎症。

众所周知,天然化合物与抗炎活动可以最佳候选人开发有效的治疗策略。Amentoflavone是一种天然biflavone与各种生物属性(16]。我们先前的实验结果表明,amentoflavone调节NF -κB p65, TLR通路的关键成员或氧化应激通路,减少炎症反应,产生神经保护作用[17,18]。然而,amentoflavone的潜在机制和功能神经炎症还没有完全调查。在目前的研究中,我们分析了抗炎和神经保护作用的amentoflavone在脂多糖(LPS)诱导BV2小胶质细胞。确定的作用机制amentoflavone, amentoflavone的影响评估TLR4 / MyD88 / NF -κB通路和相关的炎症过程。为了进一步调查amentoflavone的神经保护作用,表达水平的变化的核因子红细胞两个相关因子2 (Nrf2) /血红素oxygenase-1 (HO-1)信号通路也被评估。

2。材料和方法

2.1。细胞系和文化条件

鼠标BV2小胶质细胞系(细胞系的国家基础设施资源,北京,中国)在DMEM培养(美国Gibco)包含10%的边后卫在37°C(美国康宁公司)5%的股份有限公司₂。BV2小胶质细胞被分为四组:对照组,治疗1% DMSO PBS紧随其后;有限合伙人,有限合伙人处理;有限合伙人+ AF组,治疗amentoflavone其次是有限合伙人;房颤组,治疗amentoflavone孤单。

2.2。化学品和抗体

Amentoflavone (THD256)购买Ronghe制药有限公司有限公司(上海,中国)。有限合伙人(L2630)从Sigma-Aldrich购买(圣路易斯,密苏里州,美国)。TLR4的主要抗体(ab13556) MyD88 (ab135693) iba-1 (ab178847)、肿瘤坏死因子-α(ab6671),伊诺(ab15323),和山羊antirabbit免疫球蛋白g h和l (Alexa萤石®488)(ab150077)从Abcam购买(美国旧金山,CA)。主要的il - 1抗体β(bs - 0812 r)》κB (bs - 2513 r), NF -κB p65 (bs - 0465 r), Keap1 (bs - 3648 r), Nrf2 (bs - 1074 r), PCNA (bs - 0754 r),β肌动蛋白(bs - 0061 r)从bios购买生物技术有限公司有限公司(沃本,MA)。HO-1 (10701 - 1 - ap)是购自ProteinTech集团(武汉,中国)。Peroxidase-conjugated山羊antirabbit免疫球蛋白(H + L) (zb - 2301)购买从中山金桥生物技术有限公司有限公司(中国,北京)。其他普通代理商用。

2.3。免疫荧光染色

BV2小胶质细胞治疗amentoflavone (10μΜ)1 h,其次是治疗有限合伙人(1μg / ml) 6 h。这些细胞被然后用4%多聚甲醛固定,然后用3%的过氧化氢进行处理10分钟,分别。与3% BSA孵化后10分钟,其次是anti-iba-1(1: 200)或il - 1β(1:500)隔夜孵化在4°C,随后细胞孵化与山羊antirabbit免疫球蛋白g h和l (Alexa萤石®488)(1:500)为1 h rt,细胞用封口机安装包含DAPI (ZSGB-BIO zli——9557年,中国北京),和图像捕获与徕卡一张路易十六时期的荧光显微镜(德国徕卡)。目标区域选择定量确定集成光密度(IOD)荧光染色使用ImageJ软件(美国国立卫生研究院)和计算平均光密度( )。

2.4。MTT试验

BV2小胶质细胞被播种到96孔板的密度 每amentoflavone在不同浓度(0、0.01、0.1、1、10、25、50、75和100μ米)在缺乏的边后卫。24小时孵化后,MTT比色细胞生存能力分析。总之,MTT(5毫克/毫升)被添加到为细胞培养板4 h在37°C。细胞上清液被移除和200年μl DMSO溶液的添加。光密度检测标在580海里。

2.5。免疫印迹分析

BV2小胶质细胞治疗amentoflavone (10μΜ)1 h,其次是治疗有限合伙人(1μg / ml) 6 h。总蛋白质或核酸蛋白质从BV2小胶质细胞制备和提取使用膜和胞质蛋白提取工具包(C510005 Sangon生物技术,中国上海)或核蛋白质萃取装备(C500009 Sangon生物技术)。蛋白质浓度测定采用BCA分析工具包(KGP902、注册机、江苏、中国)。等量的蛋白质(50μg每车道)解决12%十二烷基硫酸钠(SDS)聚丙烯酰胺凝胶(SDS - page),然后转移到0.22μ聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(美国微孔)。与5%脱脂牛奶阻塞后,兔子anti-TLR4 (1: 500), iba-1 (1: 1000), MyD88 (1: 2000)》κ我(1:500)κB (1: 500), NF -κil - 1 B p65 (1: 1000)β(1:500),TNF -α(1:1000),伊诺(1:1000),Nrf2 (1: 500), Keap1 (1: 500), HO-1(1: 1000),细胞核抗原(1:500)β一夜之间,肌动蛋白(1:2000)被孵化在4°C。膜清洗了PBST (PBS包含1‰渐变20)和随后孵化peroxidase-conjugated山羊antirabbit免疫球蛋白(H + L) (1: 5000)。执行检测与自动化学发光凝胶成像分析系统(美国通用电气公司Amersham成像仪600)和量化通过微ImageJ软件。所有实验进行了一式三份。

2.6。测量一氧化氮(NO)含量

BV2小胶质细胞治疗amentoflavone (10μΜ)1 h,紧随其后的是治疗有限合伙人(100 ng / ml) 24 h。上层清液的收集。蛋白质浓度是决定BCA蛋白质化验设备(注册机)。没有内容测量与分析工具包(建成、南京、江苏、中国)。

2.7。酶联免疫吸附试验(ELISA)

BV2小胶质细胞治疗amentoflavone (10μΜ)1 h,紧随其后的是治疗有限合伙人(100 ng / ml) 24 h。上层清液的细胞收集。il - 1β和肿瘤坏死因子-α在组织上层清液浓度测量与特定的酶联免疫试剂盒(Cusabio生物技术、武汉、中国)根据制造商的协议。吸光度测量的标540海里。

2.8。测量水平的谷胱甘肽、MDA和SOD

BV2小胶质细胞治疗amentoflavone (10μΜ)或0.5% DMSO 1 h,然后处理有限合伙人(100 ng / ml) 24 h。谷胱甘肽的测定,MDA和SOD测定测定试剂盒(南京建成,中国)按照制造商的指示。

2.9。愈合试验

如前所述(执行愈合试验19]。BV2细胞增长到80%在six-well文化汇合的盘子,然后有200人受伤μl吸管技巧。合成的细胞被移除,不断培养24小时的无血清培养基。领域的细胞运动在伤口闭合观察和拍照。在关闭的差距与ImageJ量化软件。移民的百分比 ,在哪里代表了区域和代表其余的伤口在计量点(20.]。所有实验进行了一式三份。

2.10。统计分析

使用棱镜8执行统计分析软件。结果给出了 偏差( )。单向方差分析是用于多个组间比较的统计差异,其次是Dunnett或图基的显著差异测试。所有实验进行了一式三份。

3所示。结果

3.1。Amentoflavone减轻LPS-Induced小胶质细胞的活化和迁移BV2小胶质细胞

最初,适当浓度的amentoflavone BV2细胞评估。我们之前的研究表明,合适的实验浓度amentoflavone [17,21)(图1(一)和1 (b))是10μ米,由3 - (4 5-dimethylthiazol-2-yl) 2, 5-diphenyl-2H-tetrazolium溴化分析(图1 (b))。过度激活的小胶质细胞加剧炎症的发展,进而促进各种神经系统疾病的发展。众所周知,iba-1是microglia-specific钙结合蛋白,这是常用的标记小胶质激活(22]。24小时LPS刺激后,iba-1的表达中检测出BV2细胞(数字1 (c)- - - - - -1 (f))。与对照组相比,LPS-treated细胞特点是大型和密集染色细胞的身体(图1 (c))。anti-iba-1的荧光强度显著增强了LPS刺激( ,图1 (d))。这些观察相比,预处理amentoflavone导致减少这个过程和细胞形态相似的控制细胞出现。然而,amentoflavone并不影响后小胶质细胞的活化与这种化合物单一治疗的细胞( ;数据1 (c)和1 (d))。此外,amentoflavone的影响进行的表达水平在BV2 iba-1小胶质细胞使用西方墨点法。Amentoflavone可以显著抑制LPS-induced iba-1表达式( );然而,这种化合物并不影响iba-1表达式( ;数据1 (e)和1 (f));这些结果是一致的与那些来自免疫荧光染色。

小胶质细胞运动与促炎反应的诱导有关。因此,本研究调查了amentoflavone能否调节LPS-induced BV2小胶质细胞迁移使用愈合化验。结果表明,有限合伙人治疗显著增加BV2小胶质细胞的迁移与对照组( )。Amentoflavone显著抑制LPS引起的迁移( ;数据2(一个)和2 (b))。这些数据表明,amentoflavone缓解LPS-induced小胶质细胞的活化和迁移BV2细胞。

3.2。Amentoflavone缓解LPS-Induced炎症反应在BV2小神经胶质细胞

随后,amentoflavone评估在神经炎症的影响。促炎细胞因子il - 1的表达水平β和肿瘤坏死因子-α在BV2检测小胶质细胞ELISA和免疫印迹,分别。结果表明,在BV2小胶质细胞,促炎细胞因子il - 1的表达水平β和肿瘤坏死因子-αLPS组明显高于对照组( )。然而,amentoflavone显著抑制il - 1的表达水平β和肿瘤坏死因子-αLPS刺激引起的,( )。此外,单一管理amentoflavone细胞并不影响这些细胞因子的表达水平( ;数据3(一个),3 (b),3 (f),3 (g))。

此外,amentoflavone的影响了伊诺表达式和没有的生产。后者是一个关键的炎性介质LPS-induced BV2小胶质炎症。类似于ELISA试验,在BV2 24 h与LPS刺激后小胶质细胞,未发现生产水平。结果表明,有限合伙人伊诺的表达明显增加( ,数据3 (f)和3 (g)),随后没有( ,图3 (c))与对照组相比。Amentoflavone的表达水平显著地抑制LPS-stimulated伊诺和随后的生产( )。然而,单一的细胞治疗amentoflavone并不影响伊诺和随后的表达没有生产( ;数据3 (c),3 (f),3 (g))。为了进一步证实了这些发现,il - 1的表达水平β在BV2小胶质细胞被免疫荧光检查分析。结果是一致的与ELISA和免疫印迹分析(数据3 (d)- - - - - -3 (g))。这些数据表明,amentoflavone缓解BV2 LPS-induced炎症反应的小胶质细胞。

3.3。Amentoflavone调控TLR4 / MyD88 / NF -κB轴改变LPS-Induced促炎细胞因子水平

LPS刺激与TLR4施加强有力的免疫和炎症反应。NF -κB是一个无处不在的和重要的核转录因子。它是一种TLR4信号通路的下游效应和调节各种炎症过程。不活跃的NF -κB是本地化在细胞质中,我结合κ磷酸化后的我κB和其退化,NF -κB把核,导致不同的促炎基因的转录,导致炎症的生产因素,如il - 1β和肿瘤坏死因子-α(23,24]。然而,amentoflavone可以缓解LPS-induced炎症反应在BV2小胶质细胞。因此,它是假设amentoflavone调控TLR4 MyD88 / NF -κB轴改变LPS-induced促炎细胞因子水平。因此,TLR4的蛋白质含量,MyD88》κB,我κB和NF -κB p65 BV2小胶质细胞被免疫印迹检测分析。刺激与LPS激活的细胞TLR4、MyD88,和我κB ( )。MyD88 Amentoflavone显著抑制LPS-induced TLR4的表达,和我κB ( ;数据4(一)和4 (c)),促进了NF -的转录κB p65核( ;数据4 (b)和4 (d))。这些数据表明,amentoflavone抑制TLR4 / MyD88 / NF -κB信号通路改变LPS-induced促炎细胞因子水平。

3.4。Amentoflavone增强Nrf2 / HO-1水平LPS-Treated BV2小胶质细胞

抗氧化剂发挥重要作用在神经系统疾病的预防。因此,当前的研究评估的抗氧化作用在LPS-treated amentoflavone BV2小胶质细胞通过评估活动水平和丙二醛(MDA)的含量、谷胱甘肽(GSH)和超氧化物歧化酶(SOD)。类似于ELISA试验,在BV2 24 h与LPS刺激后小胶质细胞、MDA的含量,发现谷胱甘肽和草皮。结果表明,LPS组MDA水平明显高于对照组( ;图5(一个)),而SOD和谷胱甘肽水平明显低于对照组( ;数据5 (b)和5 (c))。然而,单一的治疗与amentoflavone并不影响细胞活动和表达水平的MDA,谷胱甘肽和SOD ( ;数据5(一个)- - - - - -5 (c))。此外,本研究调查的影响amentoflavone Nrf2 / HO-1信号通路在LPS-treated BV2小胶质细胞。随后,蛋白表达水平的Kelch-like ECH-associated蛋白1 (Keap1), Nrf2, HO-1被免疫印迹分析(评估数据5 (d)和5 (e))。结果表明,有限合伙人治疗显著促进了Keap1的表达水平与对照组相比。然而,预处理amentoflavone显著降低LPS-induced Keap1表达式( ;数据5 (d)和5 (e))。此外,amentoflavone激活Nrf2和HO-1(的表达水平 ;数据5 (d)和5 (e))。有限合伙人也引起了轻微的表达水平增加Nrf2 HO-1。然而,细胞中的表达水平与有限合伙人和amentoflavone cotreated大大高于仅在细胞治疗有限合伙人和amentoflavone ( ;数据5 (d)和5 (e))。这些结果表明,amentoflavone激活Nrf2 HO-1和抑制Keap1表达,发挥抗氧化作用通过调节Nrf2 / HO-1 BV2小胶质细胞的途径。

4所示。讨论

在目前的研究中,amentoflavone缓解LPS-stimulated小胶质激活、迁移、炎症反应、氧化应激。这些过程都依赖TLR4的抑制和激活/ MyD88 / NF -κ分别为B和Nrf2 / HO-1通路(图6)。因此,这些发现表明,amentoflavone可能是一个潜在的各种神经系统疾病的治疗选择。

炎症在CNS-associated疾病的病理生理学中起着重要的作用。先天免疫的关键受体TLR4是免疫反应的一个关键推动力细菌感染和各异常炎症反应的重要一环。激活后,TLR4迅速引发NF -κB主要通过MyD88-dependent信号通路的激活炎症反应,导致促炎细胞因子的释放,包括il - 1β和肿瘤坏死因子-α诱导CNS-associated疾病的发展。TLR4的激活可以清晰的β淀粉样蛋白(一种β)在初始阶段积累;然而,慢性长期激活引起β在大脑中沉积,诱发或加重阿尔茨海默病(10]。高机动组框1的表达水平增加(HMGB1)和TLR4在人类由癫痫引起的组织。抑制HMGB1 TLR4阻碍发作降水和减少急性和慢性癫痫复发,这在一定程度上由ifenprodil-sensitive n -甲基- d受体(12]。HMGB1-TLR4信号通路似乎是最有前途的抗癫痫和抗癫痫药物针对炎症(目标25,26]。脑出血后,TLR4通过MyD88信号通路被激活引起氧化损伤大脑和认知障碍(27]。TLR4-mediated炎症也可能是其中的一个关键因素导致帕金森病的神经退化(13]。此外,TLR4介导创伤性脑损伤(28),脑海绵状畸形(29日),脊髓缺血再灌注损伤(30.),和其他神经系统疾病(31日,32]。所有这些疾病主要通过TLR4-mediated炎症发生,表明TLR4是一个重要的治疗目标。有限合伙人的破坏,是一种TLR4受体激动剂和与它交互TLR4-mediated内吞作用,可以抑制炎症反应的发生,从而减轻或治疗各种神经系统疾病(33]。我们之前的数据表明,amentoflavone发挥神经保护效应,抑制NF -κB-mediated炎症反应,这是关键的TLR4的函数(18]。在目前的研究中,amentoflavone神经炎症是检查的影响。有限合伙人成功地诱导促炎反应BV2细胞。然而,这些炎症反应明显抑制由amentoflavone由信使rna和蛋白质水平相应的标记和主要通过抑制TLR4的表达/ MyD88 / NF -κB通路标记,这与以前的研究结果是一致的(34,35]。这些数据表明,amentoflavone可以缓解或治疗各种神经炎症疾病主要是通过调控TLR4 MyD88 / NF -κB信号通路。

此外,氧化应激也起着重要的作用在神经系统疾病的发展。转录因子的激活Nrf2发挥神经保护作用,促进神经元存活;它还阻碍神经损失和在神经退化疾病进展和急性神经损伤(36,37]。Nrf2及其内源性抑制剂、Keap1进化保存细胞内的防御机制来对抗氧化应激(38]。Nrf2参与减轻氧化应激引起的细胞损伤。Nrf2的激活的转录调节基因的抗氧化反应,解毒,谷胱甘肽体内平衡和主要依赖于cytoprotective酶HO-1 [37,39]。Nrf2与氧化应激和炎症反应。Nrf2 / HO-1信号通路是一个不可或缺的抗氧化应激反应的信号通路,也影响神经炎症疾病的发生和进展(40]。在阿尔茨海默氏症(Amentoflavone发挥神经保护作用41),癫痫(17,18),和帕金森病(42]。它建立了amentoflavone展品抗氧化和抗炎反应,这可能通过抑制NF -行动κB信号(35]。在目前的研究中,人们发现amentoflavone发挥抗氧化效果通过激活Nrf2 BV2小胶质细胞。激活Nrf2抑制LPS-induced的促炎细胞因子的表达,如il - 1β和il - 6,特别是抑制NF -κB-mediated inflammation-induced转录(43]。换句话说,Nrf2的激活的转录抑制NF -κb是由当前的结果和之前的数据得出结论,amentoflavone可以激活Nrf2,它可以抑制LPS-induced NF -κ通过这一过程B激活。这可能是潜在的联系Nrf2 / HO-1和TLR4 / MyD88 / NF -κB信号通路。然而,进一步的实验,动物,应该执行和细胞的研究来证实这一潜在的关系。

在目前的研究中,与LPS刺激诱发严重的炎症反应和氧化应激在BV2小胶质细胞。然而,amentoflavone改善这些影响通过抑制TLR4 / MyD88 / NF -κB通路,通过激活Nrf2 / HO-1通路。这些结果表明,amentoflavone可能是一个有前途的治疗代理neuroinflammation-related疾病的治疗。

5。结论

Amentoflavone改善LPS-induced BV2小胶质细胞的神经炎症反应和氧化应激。这些数据提供了新的见解的机理amentoflavone neuroinflammation-related疾病的治疗。因此,amentoflavone可能是一个潜在的神经系统疾病的治疗选择。

缩写

TLR4:	toll样受体4
MyD88:	88年骨髓分化因子
NF -κB:	核因子k B
Nrf2:	核因子红色的两个相关的方面
HO-1:	血红素oxygenase-1
il - 1β:	Interleukin-1β
肿瘤坏死因子-α:	肿瘤坏死因子-α
伊诺:	诱导一氧化氮合酶
没有:	一氧化氮
DMSO溶液:	二甲亚砜
有限合伙人:	脂多糖
中枢神经系统:	中枢神经系统
ELISA:	酶联免疫吸附试验
PBS:	磷酸缓冲盐
RT:	室温。

数据可用性

所有这些数据集生成的研究包括在手稿。

同意

书面知情同意出版了从所有参与者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

TS和ZW参与的设计研究。老做了实验,分析数据,并写了手稿。ZW, CY,弗兰克-威廉姆斯分析数据和纠正了手稿。KS和YW进行实验。所有作者阅读和批准最终的手稿。Shikuo荣和杨Chunrong贡献了同样的工作。

确认

这项工作是支持的博士后科学基金会的广东省人民医院(BY012022014)、广东省自然科学基金(2020号a1515010127),广东省人民医院广东省杰出青年科学基金(没有。KJ012019441),中国国家自然科学基金(81460208),以及中国的宁夏自然科学基金(没有。NZ13163)。