文摘
在这项研究中,繁殖力的Pomacea canaliculata研究通过收集鸡蛋质量使用字段从广东和湖南蛋收集和室内传播。RNA通过高通量测序(RNA-seq),我们分析了蜗牛的卵巢组织广东(G_O)和那些在湖南(H_O)使用转录的进行比较分析。此外,我们运用生物信息学方法筛选的关键途径和基因影响繁殖力蜗牛的两个位置。结果。结果表明,绝对繁殖力和体重与繁殖力的Pomacea canaliculata广东明显高于在湖南。我们发现1546个差异基因通过差异基因筛选(528个基因调节在蜗牛蜗牛从1018年广东和湖南)。核糖体的信号通路rpl23a,uba52至关重要途径和必要的基因影响蜗牛的繁殖力。结论。27个微分核糖体基因的信号通路,从H_O收集,都表达下调。因此,卵巢组织蛋白质合成受损,这是一个重要的机制,影响了蜗牛的繁殖能力。
1。介绍
入侵物种是生物多样性面临的主要威胁之一。许多淡水蜗牛可能会破坏生态系统的功能或结构(1]。然而,只有一种类型的蜗牛被列为全球100最入侵物种之一,国际自然保护联盟(2]。Pomacea canaliculata,也被称为苹果蜗牛,原产于亚马逊河流域。在1980年代早期,人们引入到中国和其他亚洲国家作为商业用途的高蛋白食物。然而,他们丢弃大量由于苦涩的味道和可怜的市场销售。最终,他们定居在自然环境。蜗牛严重危及水生作物,如水稻、和旱生植物作物,如蔬菜附近水域,造成相当大的农业经济损失和生态安全的严重威胁。
生物个体繁殖力的水平反映了物种或种群对环境变化的适应特征,它直接影响到种群的补充和扩散3]。蜗牛的至关重要的繁殖能力为入侵灾害的形成提供了有利条件4]。女性苹果蜗牛可以50 - 800个鸡蛋。平均每个女性苹果蜗牛可以躺在它的生命周期13764个鸡蛋和繁殖6070年轻的苹果蜗牛5]。女性蜗牛的喂养率高于男性蜗牛,所以更多的能量引入女性人口蜗牛。当食物是有限的,女性蜗牛将更多的能量用于繁殖。只有在食物供应减少50%以上将蜗牛的繁殖力下降和部分补偿增加孵化存活率(6]。的长期限制食物供应的80%,蜗牛仍然可以成熟,交配,产下的卵和发育(7]。此外,女性蜗牛蜗牛人口的数量往往比男性更蜗牛(5),和女性蜗牛可以产卵后多次交配一次(8]。这些生殖特征Pomacea canaliculata使他们能够快速适应环境的入侵,他们占主导地位。
本研究调查Pomacea canaliculata样本来自广东和湖南。生殖特性进行了研究使用实地调查采样和实验室产卵。差异表达基因进行了丰富和分析基于卵巢的转录组数据,和生殖相关基因筛选。多产的蜗牛可以帮助澄清研究人口增长的法律和生殖策略,这可能为预测它的传播提供一个特定的理论参考和提供科学指导预防和控制苹果的蜗牛。
2。材料和方法
2.1。实验材料
的P。canaliculata收集用于这项研究。的P。canaliculata收集广东省高要市地区稻田,广东省肇庆市。相比之下,p . canaliculata在芙蓉区湖南收集从池塘,湖南省长沙市。这两个蜗牛品种分别在水族馆饲养在室温下(即根据性。,男性和女性)。盒子里的水是自来水户外播出两天圆白菜和美联储。实验伦理委员会审查和批准的湖南农业大学,和此前所有保健的原则和使用实验动物。
2.2。蜗牛的生殖能力的确定
2.2.1。蜗牛的生殖能力的确定
2020年10月,我们随机收集30完成蛋收集网站的大量蜗牛蜗牛在广东和湖南。以避免损坏收集到的样本,我们把他们一起蜗牛卵质量的附件,领他们回到实验室。然后浸泡在2%的氢氧化钠溶液直到鸡蛋分开的附件,它帮助我们计算鸡蛋的数量。
2.2.2。蜗牛在实验室条件下的生殖能力的确定
使用一个塑料水桶( )作为实验容器,我们一起把蜗牛从广东和湖南一对交配。首先,我们选择蜗牛与正常活力和没有损害他们的身体表面。然后,我们吸收了水在身体表面用纱布和测量他们的质量(W, g)。最后,我们把男性和女性对一对交配实验桶。每个交配组有三个重复。实验持续了一个月。我们用白菜作为诱饵,每两天就改变了水,保持水温在生化培养箱 ,和桶的嘴用纱布覆盖防止蜗牛逃跑。我们也观察到蜗牛每天的生活条件并记录日期和数量的产卵鸡蛋。当鸡蛋的表面质量成为困难当它和附件之间的联系还湿,我们轻轻地剥掉小叶片。我们然后浸泡在2%的氢氧化钠溶液直到鸡蛋块完全分散,让我们数一数蛋粒子。
2.3。RNA提取和转录组测序
本研究把女性苹果蜗牛的转录组测序已完成产卵。蜗牛解剖后,迅速切除卵巢组织,在液态氮snap-frozen, RNA提取存储在-80°C。我们在广东G_O叫蜗牛,蜗牛在湖南H_O。我们生成的三个生物复制的蜗牛在每个区域。提取总RNA, RNA提取设备,和一个安捷伦2100生物分析仪检测的质量和浓度的总RNA。Novogene有限公司测序库,构造和转录组paired-end测序进行使用Illumina公司HiSeq2500平台。
2.4。筛选差异基因
我们获得清洁读取的序列包含连接器从原始序列和低质量的序列数据。参考基因组从NCBI数据库下载,与大礼帽的软件。DESeq2 R软件被用来筛选差异表达的基因,基因被定义为和微分 和 。
2.5。去微分基因的功能注释和KEGG通路富集分析
这项研究还使用了Cytoscape插件ClueGo + Cluepedia分析微分基因(基因本体)和KEGG(京都基因和基因组的百科全书)。分析参数设置采用软件默认设置,网络特异性选择中,结果显示当 。
2.6。差异基因的蛋白质相互作用网络分析
该研究使用字符串在线分析软件鉴别基因的蛋白质相互作用网络分析。为了使相关的蛋白质相互作用网络更接近真正的功能状态,只有节点交互得分大于0.9保留,和失败的节点基因符号识别被删除。蛋白质相互作用网络可视化使用Cytoscape软件和网络拓扑进行了分析使用CytoHubba插件的屏幕中心的基因。
2.7。统计分析
我们使用Microsoft Excel 2016软件,处理数据和结果表示为 。此外,我们还使用了SPSS 26和单向方差分析(方差分析)分析组之间的差异( )。计算公式是 ; 。
3所示。结果
3.1。蜗牛的生殖能力的比较
实验结果进行蜗牛从广东和湖南如表所示1。结果显示显著差异的绝对繁殖力Pomacea canaliculata广东和湖南。此外,数量没有显著差异产卵蜗牛在广东和湖南。然而,存在很大差异的数量鸡蛋和相对重量和繁殖能力(见表2)。
相同的字母表示差异不显著,而不同的字母表明,区别是重要的( )。
确切的数字和字母在同一列表明,差异是无关紧要的,和不同的字母表示显著性差异( )。
3.2。测序数据质量评估
处理后的测序数据,我们得到312760252清洁读取。基于数据,每个样品的清洁基地上方7.23 Gb,而映射的比率为80%以上。参考基因组的比较比率在80.51%和85.91%之间,和独特的比较比率高于77.91%(见表3)。
3.3。筛选差异表达基因
比较G_O和H_O通过微分表达式分析,得到1546个差异表达基因。与H_O相比,有528个基因调节和G_O 1018个基因表达下调。从火山的地图从G_O vs H_O(图差异表达基因1),我们可以很快看到更远的偏差从0 - - - - - -轴,更重要的表现的相当大的差异。为 - - - - - -轴,值越大,假阳性的可能性越小,结果越可靠。
3.4。差异基因功能浓缩和KEGG途径分析
66年5去条目KEGG渠道分为12组和连接到144年边缘。最重要的方面包括:铜离子绑定(0005507 ,浓缩7号),dre00480谷胱甘肽代谢( ,浓缩7),数量:1901564 organonitrogen化合物代谢过程( ,浓缩49),:0004725蛋白质酪氨酸磷酸酶活动( ,浓缩9号),
去:0030414肽酶抑制剂活动( ,浓缩13号)去:0020037 heme-binding ( ,浓缩22)数量,dre03008在真核生物核糖体生物起源( ,浓缩17),数量:0004222 metalloendopeptidase活动( ,浓缩16),数量:0043603细胞酰胺代谢过程( ,浓缩数量33),去:0008509离子跨膜转运体活动( ,浓缩10号),去:0061134肽酶监管活动( ,浓缩13号),dre03010核糖体( ,浓缩第27号)(见图2)。在三个途径,dre03010核糖体最高程度的浓缩。注意,27个微分核糖体途径都是调节基因。他们的表达水平调节和至少两倍的最调节(见图2.8倍3)。
3.5。蛋白质相互作用网络分析
基于字符串的在线数据库和Cytoscape软件,我们吸引了蛋白质相互作用网络图,其中包括112个差异基因(24个表达下调,88个上调)和608蛋白质相互作用网络,如图4。节点越大,越互动与其他节点之间的关系。如图4,rpl23a mrto4 uba52, rpl3最突出的节点。识别潜在的基因网络中心,Cytoscape插件,CytoHubba,使用了六个算法来计算和屏幕蛋白质相互作用网络和选择的十大基因算法(表4)。所有拓扑测量的结果有一个相对高度重叠。我们使用了维恩图相交六算法的结果,最后筛选出uba52 rpl23a,如图5。这两个基因有一个更健壮的交互关系比其他基因在整个蛋白质交互网络。他们可能会发挥更重要作用比其他基因在生殖过程中。
4所示。讨论
p . canaliculata引入广东饲养在1980年代早期(9]。然后,在1990年代早期,他们介绍了多个省市,分布区域逐步扩展到湖南和其他地方。苹果的繁殖蜗牛是受温度影响10,11]。育种和孵化的合适的温度是22-32°C,和鸡蛋通常不能孵化后的温度低于15°C。广东省自年平均温度大约是19到24°C, 1月平均气温约为16 - 19°C,苹果蜗牛可以在广东一年三代繁殖[8]。与此同时,由于湖南的年平均气温是16 - 18.5°C, 1月平均气温约为4 - 7°C,苹果蜗牛不能繁殖三代一年湖南,因为低温。苹果蜗牛消耗能量来适应低温环境中,所以他们的繁殖能量降低,这意味着他们的繁殖能力低于苹果蜗牛在广东。
苹果蜗牛的生殖特征显示种群之间巨大的差异,一定程度上是由于表型可塑性和一定程度上是由于遗传变异12,13]。蜗牛的繁殖是一个复杂的过程,涉及许多基因。在这项研究中,1546个基因被确定通过分析G_O H_O。KEGG浓缩的结果分析基于微分基因和蛋白质相互作用网络分析表明的核糖体途径rpl23a和uba52和两个ribosomal-related主基因影响生殖能力的重要途径和关键基因的苹果蜗牛。
核糖体是蛋白质合成的重要网站。真核生物的核糖体60年代大亚基组成的三、四十年代小单元。一个60年代大亚基包含三个核糖体rna分子(25 srrna 5.8 srrna, 5 srrna)和46个蛋白质,而40岁小亚基包含一个rRNA (18 srrna)和33个蛋白(14- - - - - -16]。核糖体蛋白(RP)是一个集体名词的所有蛋白质形成核糖体。广泛分布于各种组织和形式核糖体核糖核酸。它在蛋白质生物合成过程中起到了至关重要的作用。许多核糖体蛋白质形成核糖体,参与蛋白质生物合成和功能独立的蛋白质生物合成。研究表明,核糖体是密切相关的细胞生长,分化,胚胎发育17,18]。在本实验研究中,微分参与核糖体基因信号通路在H_O都表达下调,23的核糖体蛋白基因。核糖体蛋白基因的差别,对这些将减少相应的核糖体蛋白质的生产,从而减少细胞中的核糖体的数目。这一事实表明,苹果在湖南省蜗牛的卵巢,基因差异表达的差别,由于对这些影响卵巢组织的蛋白质生物合成,从而影响卵巢的正常生理功能和显示可怜的生殖能力。
的rpl23a(核糖体蛋白l23a)基因编码核糖体蛋白,它是一个组件的60 s亚基。作为真核核糖体不可或缺的一部分,rpl23a基因可以提高核糖体rna合成的催化能力的蛋白质(19),它在蛋白质合成中起着至关重要的作用,折叠,和安排20.]。Uba52(泛素52残渣核糖体蛋白融合产品1)基因是一个重要的泛素家族的成员。泛素是一个小的蛋白质与76氨基酸和大约8.6 kDa。它无处不在,在真核生物中高度保守的。泛素可以起到至关重要的作用在组织重构和开发中,配子发育和成熟,受精,怀孕早期通过ubiquitin-proteasome通路(UPP) (21]。小林对小鼠胚胎的研究证实uba52调节核糖体蛋白复合物,同时提供rpl40和泛素核糖体。Uba52 -缺陷的小鼠在胚胎期间死亡,这表明uba52可以维持胚胎的发育功能22]。毛泽东等人发现uba52基因对猪早期胚胎发生(至关重要23]。
通过比较转录组和生物信息学分析G_O H_O,我们预测,核糖体信号通路可能与蜗牛生殖密切相关。此外,我们确定rpl23a和uba52在蜗牛繁殖基因起着关键作用。当然,这些通路和基因的具体机制和功能需要通过许多生物实验验证为理解的生殖机理提供确凿的证据Pomacea canaliculata。
数据可用性
本研究的数据可从相应的作者。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
确认
这项研究得到了湖南省杰出青年项目的教育(20 b298),湖南省创业培训项目(S202110537007X),市自然科学基金(kq2014069),湖南省自然科学基金(2021 jj30320),和湖南省大学生创新与创业培训项目(S202010537081X)。