文摘
目标。脓毒症的特点是作为一个特异表达宿主对感染的免疫反应,与肠道微生物密切相关。本研究旨在调查肠道微生物的壮族民族脓毒症患者。方法。十一壮族民族脓毒症患者和20名健康人(控制)在百色城市人民医院,被吸收了中国。他们的肠道微生物群落配置文件被16 s rRNA基因测序分析使用Illumina公司MiSeq系统。结果。脓毒症患者的肠道微生物群落相比显著改变的健康个体基于主坐标分析的结果和微生物生态网络。此外,观察微生物α多样性显著降低脓毒症患者比健康的人。特别是,浓缩的Bilophila,洋葱,棒状杆菌属,Porphyromonas以及大量的短链脂肪酸的丰富制造酸性物质微生物,包括Roseburia,双歧杆菌属,Faecalibacterium,Coprococcus,Blautia,梭状芽胞杆菌,瘤胃球菌属,Anaerostipe观察脓毒症患者与对照组相比。此外,脓毒症患者可以有效地分类的基础上,大量的这些细菌使用支持向量机算法。结论。本研究显示显著差异在肠道微生物之间壮族民族脓毒症患者和健康人。在未来,有必要确定这样的改变是脓毒症的原因或结果。
1。介绍
败血症危及生命的器官功能障碍综合征的特点是对感染的免疫反应(特异表达1,2]。这是一个重大的公共卫生问题,因为它占住院患者死亡的一个显著的比例在世界范围内,尤其是在重症监护室2- - - - - -4]。因此,脓毒症的发病机制近年来引起了广泛关注。大多数的研究旨在揭示脓毒症的病因都集中在宿主免疫反应的作用[5]。文化无关的方法如16 s rRNA和猎枪宏基因组测序表明,肠道微生物组是至关重要的发展和宿主免疫系统的成熟6]。一些微生物直接调节宿主免疫内稳态,提高免疫球蛋白生产和T-helper-17细胞分化[7]。此外,他们的一些产品,如脂多糖和短链脂肪酸(SCFAs),刺激toll样受体4 -(地)积极的上皮细胞和树突细胞(8和激活调节性T细胞的发展7]。
越来越多的证据支持肠道微生物之间存在的联系和脓毒症9,10]。几项研究使用临床前模型和住院病人报道,血液感染和重要疾病的风险增加,当肠道微生物体内平衡是中断11- - - - - -13]。曾庆红等人发现,一些肠道细菌可以诱导保护性免疫球蛋白的生产通过特定抗原的分泌,从而导致系统性感染的控制(14]。德斯穆克等人表明,肠道微生物调节在新生儿败血症小鼠的影响中性粒细胞内稳态(15]。此外,益生菌补充与脓毒症的风险降低病人择期胃肠手术(16),还可以减少早产婴儿晚发性脓毒症的风险(17]。最后,据报道,粪便微生物群移植可以恢复患者脓毒症的先天免疫反应,导致病原体间隙,和规范SCFA-producing微生物(18,19]。
总的说来,这些研究结果支持肠道微生物群之间的联系中断,脓毒症的风险。本研究旨在进一步研究这种关系在一群病人属于壮族的民族。为此,我们研究脓毒症患者的肠道微生物群的特点,使用16 s rRNA基因测序。
2。方法
2.1。研究群体
所有个人在这项研究是从百色城人民医院招募(广西壮族自治区、中国)从1月到2021年4月。他们提供书面知情同意。扣除后经历了器官移植的患者,长期免疫抑制治疗,或产生肿瘤,共31人被招募为个人分析。总共11个患者分为败血症(SEP)集团在20名健康的人收到任何抗生素或益生菌在过去的3个月分为健康控制(CTRL)组。根据脓毒症患者被诊断为败血症3.0指南(https://rebelem.com/sepsis-3-0)。临床资料收集和总结了训练有素的医生根据标准程序。研究伦理委员会批准的协议是百色市人民医院。
2.2。粪便样本收集和测序
在无菌容器,收集粪便样本snap-frozen干冰,存储在研究实验室−80°C到进一步使用。脓毒症患者的样本收集了抗生素治疗之前。总从粪便样本中提取细菌的DNA快速使用QIAamp DNA凳子迷你包(试剂盒、德国)后,制造商的指示。V3-V4地区16 s rRNA基因扩增的DNA提取使用PCR引物338 f (5 - - - - - -ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3 )和806 r (5 - - - - - -GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3 )。PCR产品混合在等密度比率。试剂盒凝胶萃取设备用于净化(试剂盒,德国)。准备库测序的Illumina公司MiSeq平台300 bp paired-end读模式。
2.3。肠道微生物群与统计分析
16 s rRNA基因测序分析,包括原始序列筛选和分类分类,如前所述执行(20.]。生物信息学软件包QIIME2(版本2020.11)被用来分析16 s rRNA基因序列(21]。成对的读取与DADA2包(组装和去噪22使用“qiime dada2 denoise-paired”QIIME2命令。命令“qiime feature-classifier classify-sklearn”被用来分配序列对绿色煤电数据库分类。香农指数指标,Pielou的均匀度指数,观察到的特征数,和未加权的加权UniFrac距离计算使用命令“qiime发展史align-to-tree-mafft-fasttree”和“qiime多样性core-metrics-phylogenetic”取样深度10000读。代谢功能的预测进行了使用PICRUSt2软件(23]“qiime picrust2正式管道”命令。
主坐标分析(PCoA)基于未加权和加权UniFrac距离被用来估计不同的β多样性,伴随着置换多元方差分析(PERMANOVA)评估社区不同的意义使用R包“素食主义者”。线性判别分析(LDA)被用来估计不同类群丰富的线性辨别分析效果两组之间(LEfSe)软件( )(24]。微生物生态网络构建使用SpiecEasi软件(25)并使用Gephi可视化软件。邮票软件被用于调查两组之间的明显不同的代谢途径(26]。
特征概括为手段(±标准差)连续变量并为分类变量比率(%)。这些特征的差异进行评估 - - - - - -测试和测试。所有分析使用R软件(v 3.6.3)。被认为是具有统计学意义的差异 。
脓毒症患者分类模型是建立分类的基础上显著不同属使用支持向量机(SVM)与10倍交叉验证算法。计算曲线下的面积(AUC)来评估模型的性能。
3所示。结果
3.1。研究参与者的特征
共有31个壮族民族人参加这项研究。所有参与者年龄在65年和98年。所有的参与者的社会人口和临床特点进行了总结表1。根据统计分析结果,没有明显的年龄或性别差异的群体。CTRL组相比,脓毒症患者有更高水平的c反应蛋白(CRP)、白介素- 6 (IL), heparin-binding蛋白质(HBP)。
3.2。肠道细菌群落的多样性总体结构
评估肠道微生物组的总体特征,α多样性估计等观察特征数,Pielou,香农指数进行了比较。如图1,观察到的特性CTRL组的数量 ,这是明显高于9月集团( , )。Pielou指数也显著降低9组( )比CTRL集团( , )。此外,脓毒症患者有显著降低的香农指数比健康人( 与 , )。
PCoA进行加权和不加权的使用PERMANOVA UniFrac距离。9月和健康组之间都可以看到明显的分离都未加权的( , ,图2(一个))和加权UniFrac距离( , ,图2 (b))。
(一)
(b)
3.3。细菌的分析9月和CTRL组
肠道微生物群落主要由门放线菌,拟杆菌门,厚壁菌门,Fusobacteria,变形菌门,Tenericutes, Verrucomicrobia两组(图3(一个))。两个组中含量最丰富的属Alistipes,拟杆菌,双歧杆菌属,Blautia,Collinsella,Coprococcus,Dorea,肠球菌,Faecalibacterium,Gemmiger,Oscillospira,Phascolarctobacterium,普氏菌,Roseburia,瘤胃球菌属,链球菌(图3 (b))。9组均值的相对丰度双歧杆菌属(0.08%比3.69%),Blautia(3.24%比6.91%),Coprococcus(1.59%比4.98%),Faecalibacterium(1.10%比4.48%),Gemmiger(0.64%比2.32%),Roseburia(0.25%比7.59%),瘤胃球菌属(5.37%比11.03%)链球菌(2.42%和3.53%)相比CTRL组下降。均值的相对丰度拟杆菌(10.23%和6.05%),肠球菌(27.9%比0.09%)普氏菌(5.53%和2.95%)相对增加了9组。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
此外,我们使用LEfSe软件调查之间的显著差异属个人,没有脓毒症。结果表明,相对丰富的Bilophila,洋葱,棒状杆菌属,Porphyromonas9组高于CTRL组,而Roseburia Oxalobacter,双歧杆菌、Faecalibacterium Coprococcus, Blautia,梭状芽孢杆菌,瘤胃球菌属,Gemmiger, Dorea, Paraprevotella, Butyricicoccus, Turicibacter Anaerostipes,SMB53是9月组低于CTRL组(图3 (c))。
接下来,探索基于这些分类的效果明显不同属9组,我们建立了一个分类模型使用一个10倍交叉验证的支持向量机算法。接受者操作特性曲线的模型如图3 (d)和的AUC为0.85。结合后CRP、il - 6和家庭血压水平,AUC增加到0.986(图3 (e))。
此外,皮尔森相关分析进行评估微分属之间的关联和CRP, HBP和白细胞介素6的水平(图3 (f))。丰富的属Bilophila呈正相关,c反应蛋白( , )和家庭血压( , )水平;的Porphyromonas呈正相关,il - 6水平( , );的拟杆菌呈正相关,c反应蛋白水平( , );和普氏菌呈正相关,il - 6水平( , )。
3.4。功能改变之间的SEP和CTRL组
我们分析了个体属于两组的代谢途径。使用PICRUSt2软件进行预测的功能。脂肪酸伸长通路显著富集的肠道微生物组比CTRL 9组。三羧酸(TCA)第六周期,辛烷氧化,精氨酸生物合成二世(乙酰周期)更高的肠道微生物的CTRL组(图4(一))。
(一)
(b)
(c)
3.5。9月和CTRL团体之间的不同微生物生态网络
肠道微生物生态网络构建一个稳定的共存,竞争,敌对的关系。探讨微生物属一级网络,我们使用了SpiecEasi软件。微生物生态CTRL集团的网络提出了84个节点和131个(图4 (b))。然而,脓毒症患者的微生物生态网络是简单,只有80个节点和77边缘(图4 (c))。
4所示。讨论
脓毒症是一个主要的公共卫生问题,有超过一百万sepsis-related死亡发生于2015年在中国(李et al ., 2018)。越来越多的证据支持,肠道微生物破坏容易使患者败血症,从而展示作为一个潜在的治疗目标在脓毒症管理(2,10]。作为壮族少数民族是中国最大的少数民族,在这项研究中,我们旨在描述患者的肠道微生物群属于壮族民族患有败血症。使用PCoA,我们表明,脓毒症患者呈现出明显不同的微生物群落,不同的微生物生态网络比健康的人。此外,脓毒症患者有显著降低微生物α多样性,这与先前的研究一致(27]。此外,一项研究报道,增强小鼠的肠道微生物的多样性可以提高脓毒症生存通过调节免疫反应(28]。因此,增加肠道微生物多样性可能是有益的治疗脓毒症患者。
增加肠致病性细菌和旺盛的免疫反应通常观察脓毒症患者(10]。在这项研究中,我们观察到,一般医院病原体肠球菌相对频繁的脓毒症患者,按照先前的研究的结果(29日]。此外,与健康人相比,有四个属大大丰富脓毒症患者,15属显著下降。基于大量的这些微生物,病人可以有效地归类为健康人或脓毒症患者使用一个支持向量机算法。在四个属的增加,Bilophila可以通过地产生脂多糖刺激免疫系统(30.]。Porphyromonas gingivalis可以调节宿主先天免疫信号和诱发炎症(31日]。在这项研究中,相对丰富的BilophilaCRP和家庭血压水平呈正相关,和相对丰富的Porphyromonas呈正相关,il - 6水平。他们的相对增加脓毒症患者可能主要免疫系统一个健壮的炎性反应。此外,在大大降低了属Roseburia,双歧杆菌、Faecalibacterium Coprococcus Blautia,梭状芽孢杆菌,瘤胃球菌属,和Anaerostipes可以产生SCFAs [32]。减少生产SCFAs能增强肠道上皮细胞的功能(33),激活调节性T (Treg)细胞的发展34),减少核因子k B - (NF -κB -)监管促炎细胞因子(35]。因此,显著降低SCFA-producing细菌败血症患者观察到在这项研究可能会对肠道的完整性和系统性免疫产生不利的影响。
从一个人出生,肠道微生物群,主人住在共生体内平衡,影响免疫功能,包括T细胞的分化和激活,细胞因子的生产,和当地的屏障功能2]。肠道微生物组在这项研究中观察到的变化可能会使人易患败血症(而非致病性细菌的增殖和减少SCFAs的生产,这将促进特异表达的免疫反应。然而,这项研究的结果应该被认为是根据其局限性,和更大的应进行前瞻性研究证实这一假说。在这项研究中,样本量相对较小,和所有的人在这项研究是从一个地理区域招募不考虑不同的人口统计数据。此外,改变微生物功能和这些微生物改变在这个研究是脓毒症的原因或结果不清楚。有大量的样本研究,包括个人来自不同地区,进行宏基因组和metaproteomic分析,实验研究应该在未来进行进一步回答这些问题。
本研究的局限性包括,例如,缺乏界定和特定的细菌和宿主免疫系统之间的互调;肠道微生物群和预后之间的关系尚未研究由于样本量有限,短期观察期;此外,本研究未能收集孕妇的活检为新生儿病例可能是重要的。上面的限制应该吸引关注,未来研究应该回答。
总之,我们发现肠道微生物的生态失调壮族民族脓毒症患者。破坏肠道微生物可以作为早期发现脓毒症风险的潜在生物标志物。我们的发现可能有助于改善肠道微生物的作用的理解在脓毒症病因预防策略和支持基于肠道微生物组的调制。
数据可用性
生成的数据和代码和分析在这项研究可从相应的作者的请求。
的利益冲突
作者声明,这个调查是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为潜在的利益冲突。
作者的贡献
LZM、JS和DGL本研究设计的。JYY, HPL JJZ收集样品并进行数据分析。YHH、慢性淋巴细胞白血病和PFY部分进行分析研究。揭阳市Yu Hongping李,赵Jingjie这项研究同样起到了推波助澜的作用。
确认
这项研究是由赠款从广西壮族自治区卫生健康委员会(# 20211814),从中国国家自然科学基金(# 31970745),广西,自费项目的健康和建设委员会(# Z20210467),从广西自然科学基金(# 2020 gxnsfaa259050),和右江民族医科大学研究项目(# yy2019bsky001)。