文摘
客观的。调查机制联接蛋白37 (Cx37)在动脉粥样硬化(AS)和Kv1.3通路。方法。ApoE- / -小鼠给予高脂饮食建立动脉粥样硬化(AS)模型,和巨噬细胞在小鼠分离和提取的转染Cx37向量与沉默或overexpressing和Kv1.3通道阻断剂被用来抑制途径活性。体重指数、血糖和血脂的老鼠收集。蛋白质和信使rna表达水平Cx37和Kv1.3检测到一(rt - pcr),免疫印迹和免疫荧光技术。采用油红O染色观察斑块面积。马森染色是用来检测胶原蛋白含量。趋化因子的浓度CCL7量化使用ELISA试剂盒。CCK8被用来检测细胞增殖。结果。Cx37和Kv1.3巨噬细胞中高度表达的小鼠,Kv1.3的表达和CCL7 Cx37沉默后,下降和巨噬细胞的增殖也降低了。野生型老鼠和老鼠模型处理Cx37超表达载体和Kv1.3通路阻塞,并发现Cx37超表达可以改善血脂和血糖水平并增加的面积一样的老鼠。然而,阻止Kv1.3通路的活动可以降低血脂和血糖的水平,增加小鼠的体重,减少该地区的老鼠。阻塞Kv1.3通路的活动可以减缓的斑块发展接近野生型老鼠老鼠和使其索引。和使用Kv1.3通道阻滞剂Cx37超表达的基础上显示,抑制Kv1.3途径活性没有影响Cx37的表情,但能抑制胶原蛋白含量斑块面积的老鼠,抑制趋化因子的表达CCL7,和反向Cx37进行靶向治疗的效果。结论。Cx37能提高巨噬细胞的活性,调节趋化因子的表达和Kv1.3途径在小鼠的活动,并丰富巨噬细胞在炎症组织,扩大斑块形成的区域。
1。背景
动脉粥样硬化(AS)是一种慢性炎症性疾病,其特征是免疫活动,容易斑块破裂和血栓形成,引起一系列的心血管事件和严重损害人类健康1]。抗凝、抗血小板、控制血压、血脂和血糖是主要的方法来预防和治疗动脉粥样硬化。(2]。使用上述治疗可以显著减少心血管事件的发生,但仍动脉粥样硬化冠状动脉心脏病和中风的主要原因,它占了一半的死亡原因在西方国家(3]。这仍然是一个巨大的挑战对心血管治疗阐明其机制,寻求更有效的治疗措施。
动脉粥样硬化斑块的不稳定发展形式易损斑,然后,脆弱的斑块的破裂导致血小板聚集和血栓形成,和大量的炎症细胞的浸润斑块内斑块破裂的主要原因,导致心肌缺血和梗塞[4,5]。易损斑块的进一步研究,我们发现单核/巨噬细胞在斑块的主要炎性细胞,不仅存在斑块内部也渗透到血管床外动脉在大量6]。牛的刺激下的低密度脂蛋白,monocyte-derived巨噬细胞被激活聚合,坚持,和迁移到血管壁内皮细胞和分泌细胞因子,趋化因子,金属蛋白酶和其他蛋白水解酶加速炎症反应的激活。与此同时,随着炎症反应加剧,巨噬细胞继续进一步激活和触发炎症反应,放大了炎症反应(7]。因此,巨噬细胞激活的发病机制中发挥着重要作用老年心脏病的突发。
联接蛋白37 (Cx37)是一种重要的蛋白介导炎症反应主要在血管内皮细胞表达。Cx37表达式也可以检测到表面的泡沫细胞和平滑肌细胞在动脉粥样硬化斑块8]。最近的研究表明,Cx37也表达了自由表面的单核/巨噬细胞在血液。先前的研究已经发现,Cx37基因表达强烈与冠心病的发病率(9]。为了进一步澄清Cx37的作用,研究人员选择小型猪的斑块属性非常类似于人类的体内实验,发现干扰Cx37基因表达与siRNA Cx37转染导致减少斑块纤维帽的体积和增厚,扭转不稳定斑块的形成(10]。这些结果表明Cx37可能发挥重要作用的发展作为脆弱的斑块,并抑制其表达能扭转脆弱的斑块。在后续的研究中,研究者进一步观察siRNA Cx37转染的影响部分fow猪心肌储备(FFR),后,结果表明,小干扰rna干扰,Cx37 FFR明显改善(11),这表明抑制Cx37表达可以抑制病情发展,提高整体心脏功能。因此,Cx37之间的相关性,证实了临床疾病基因检测和动物实验,和Cx37有望成为一个潜在的目标控制的发生和发展。
近年来,取得了很大的进步在巨噬细胞钾离子通道的研究,它已经发现,钾离子通道表面的巨噬细胞与细胞的激活有极其重要的关系。压敏电阻器钾离子通道的开放导致hyperactivation细胞膜,促进Ca2 +涌入,间接调节细胞增殖和细胞因子的分泌12]。同时,Kv通道在调节细胞体积中扮演着重要角色,电解质运输、细胞兴奋和收缩,酶激活等生命活动(13]。后激活的巨噬细胞,巨噬细胞的细胞膜上钾通道kv1.3影响巨噬细胞的激活和功能调节膜电位通路。激活的巨噬细胞贯穿动脉粥样硬化(14- - - - - -16]。因此,有许多研究影响巨噬细胞的活动通过阻断Kvl.3钾通道。
因此,基于之前的研究结果,我们推测,Cx37可能调节通过调节kv1.3频道的发展。在这项研究中,载脂蛋白e- / -小鼠被用于建立模型,改变Cx37的表达,探讨Cx37和KVL.3渠道的角色在老鼠。
2。材料和方法
2.1。建设Cx37表达载体
收集目标DNA片段,Cx37沉默表达载体(shRNA-1/2/3)使用pLVX-shRNA2-PURO向量构建质粒(湖南房峰辉9生物技术有限公司)。同时,Cx37超表达向量(pre-CX37)使用rAAV2/8构造向量(大脑的情况下生物科技有限公司,深圳)。沉默的表达载体转染293 t细胞,和稳定转染细胞系由亚文化。随后,蛋白质提取和免疫印迹检测执行表达式Cx37效率。Cx37沉默表达载体的序列如下:mCx37-1序列:5 - - - - - -GCCATCCAAGGACCTACATGT-3 ;mCx37-2序列:5 - - - - - -GCTCATGGGTACCTATGTGGT-3 ;mCx37-3序列:5 - - - - - -GCTCTCATCCACTGAGCAGAA-3 。
2.2。实验动物
八周大的载脂蛋白e- / -老鼠从北京购买Weitong利华国际公司,C57BL / 6野生型老鼠从南方医科大学实验动物中心购买。所有实验动物实验动物伦理委员会批准东莞人民医院和按照指南的美国国立卫生研究院的护理和使用实验动物。
在实验前,所有动物喂养标准饮食的环境温度20 - 25°C,湿度30 - 70%,光明/黑暗12 h。政府之前,所有C57BL / 6小鼠4周的正常饮食,和所有的载脂蛋白e- / -老鼠接受了高脂肪饮食为4周,建立模型。从第4周、C57BL / 6野生型小鼠喂养正常饮食和给定一个腹腔内注射等体积的生理盐水。ApoE- / -控制小鼠接受高脂肪饮食和给定一个腹腔内注射等体积的生理盐水。ApoE- / -给予pre-CX37组小鼠高脂饮食和尾静脉注射Cx37超表达向量(pre-CX37)解决方案。ApoE- / -老鼠ShK (L5)组被给予高脂肪的饮食和皮下注射Kv1.3阻滞剂ShK (L5)。喂养期间,体重的变化,血脂,血糖的老鼠在每组记录。8周后药物喂食,在每组小鼠麻醉和牺牲,血样和主动脉老鼠快速分离和保存样品。实验操作如图1。
2.3。处理实验标本
老鼠牺牲后采血,主动脉立即分开。血管环长约0.5厘米从胸主动脉,以4%的多聚甲醛固定,石蜡嵌入,最后教派。50 ~ 100毫克的其他主动脉组织被选中,在液态氮冷冻。小鼠动脉血液收集,从小鼠外周血单核细胞分离密度梯度离心法和壁粘附法(17]。孤立的单核细胞在完全培养基培养和分化成巨噬细胞经过5天的文化。
2.4。免疫印迹
收集细胞,血清总蛋白提取出来。BCA的解决方案(题咏生物学、杭州)准备检测蛋白质浓度的样品进行测试。准备的蛋白质样本,溶解在冰盒,然后添加到40分钟的电泳槽。PVDF膜相应规模的削减,分离胶紧密附着在PVDF膜和蛋白质转移到PVDF膜Bio-Rad Trans-Blot。膜转移后,删除PVDF膜,洗3次,并添加适量的5%脱脂奶粉1 h。膜与TBS-T洗3次,和相应的地带被添加到初级抗体溶液和孵化一夜之间在4°C。第二天,他们将与TBS-T洗3次,然后添加相应的二级抗体和孵化在4°C 4 h。发射极耦合逻辑发光的解决方案(Omiget制药技术有限公司,北京)准备和PVDF膜均匀下降,反应是在几秒钟的暗室。切膜完全覆盖在PVDF膜,暴露5 - 10秒钟,然后放入准备好的开发人员,使用IPP6.0软件为灰度值分析的电影。
2.5。一
巨噬细胞总RNA提取试剂盒试剂(Tiangen公司,北京),并使用PrimeScript互补脱氧核糖核酸是由逆转录合成RT试剂盒(豆类公司)。rt - pcr当时使用SYBR执行预混料交货Taq工具包(豆类公司)。使用的引物如表所示1。
2.6。油红O染色
首先,0.5%油红O原液(σ)准备,用蒸馏水稀释(稀释比例3:2),在室温下,站了10分钟。血管组织固定在10%中性甲醛溶液30分钟,然后删除,沐浴在水15分钟。组织样本添加到油红O解决方案和染色1 ~ 2 h。组织样本和70%乙醇冲洗,直到补丁是红色,背景是白色的。最后,样品是用蒸馏水洗净,使用显微镜观察染色(上海Caikon光学仪器有限公司)。
2.7。马森染色
主动脉组织石蜡标本,被脱蜡和水化。然后,片与苏木精染色解决方案5 - 10分钟。部分被用自来水冲洗和朱红色酸碱性品红染色5 - 10分钟。部分再次冲洗和1%的磷钼酸水溶液处理5分钟,其次是苯胺蓝5分钟。最后,组织部分处理1%冰醋酸为1分钟,用95%的乙醇脱水反复,并与二甲苯和中性胶密封。使用显微镜观察染色。
2.8。酶联免疫吸附试验(ELISA)
鼠标MCP3酶联免疫试剂盒(CCL7) (Abcam)被用来执行实验根据指令。CCL7抗体稀释碳酸盐缓冲和添加到培养板在一夜之间文化在4°C。第二天,文化井是丢弃的解决方案和PBS溶液清洗三次,和细胞样本测试被添加到文化井。这些细胞被孵化在37°C 1小时。生物素化的抗体工作方案和酶共轭被添加到反应,并且反应孵化后30分钟打扫干净了。添加颜色衬底三甲100μL都好,在黑暗的房间里酝酿了15分钟。100年停止添加解决方案μL为每个测量OD450年值后混合,并绘制标准曲线计算浓度。
2.9。CCK8
对数生长阶段细胞收集和计算,调整细胞密度,细胞接种于96孔板和孵化一夜之间在37°C。0.1毫升完全培养基含有10% CCK8 (Beyotime生物技术研究所、北京)添加到每个,37°C和5%孵化有限公司22 - 3 h。OD450决心使用标(北京Pulang新技术有限公司有限公司)。
2.10。免疫荧光技术
血管环来衡量与甲醇固定20分钟,和组织在室温下干了10分钟。血管组织和PBS溶液清洗3次,接受1% Triton解决方案25 - 30分钟。组织被放置在山羊血清和密封在37°C 20分钟。组织被放在主要解决方案如Cx37抗体和抗体Kv1.3抗体(Abcam)和孵化一夜之间在4°C。然后,组织被添加到一个fluorescence-labeled二级抗体解决方案(Abcam) 1 h反应。洗后组织与PBS溶液3次,幻灯片是干燥和密封,染色结果通过荧光显微镜观察。
2.11。统计分析
使用SPSS 20.0软件进行数据分析。所有的实验都设置了三个双井和至少重复三次。测量数据被表示为 ( )。分析了两组之间的连续变量由独立样本测试和多个组之间的平均值比较,方差分析分析。 被认为是具有统计学意义。
3所示。结果
3.1。表达式Cx37 Kv1.3的动脉粥样硬化
ApoE- / -小鼠高脂饮食建立小鼠模型,和巨噬细胞与WT老鼠和老鼠探测Cx37和Kv1.3的表达式。检测结果表明,Cx37和Kv1.3巨噬细胞中高度表达的小鼠(图2(一个))。蛋白质检测也显示,Cx37和Kv1.3蛋白高表达的小鼠(图2 (b))。
(一)
(b)
3.2。Cx37基因对扩散的影响和趋化单核巨噬细胞的功能
它已经从先前的研究已知Cx37高度表达单核巨噬细胞,和Cx37的表达密切相关的发展。因此,我们沉默的表达Cx37在巨噬细胞,构建Cx37沉默表达载体,并检测其表达效率由世行。发现这三个向量表达式可以有效地抑制Cx37的表达,和shRNA-2抑制效率最高(图3(一个))。因此,我们与shRNA-2沉默表达载体转染巨噬细胞。rt - pcr结果表明Cx37表达减少sh-CX37集团和转染成功(图3 (b))。随后,我们发现减少巨噬细胞导致减少Kv1.3 Cx37表达的蛋白表达和减少趋化因子CCL7浓度(数字3 (c)和3 (d))。同时,沉默Cx37表达式也可以抑制巨噬细胞的增殖活动(图3 (e))。Cx37的表达能促进巨噬细胞的活动。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
3.3。Cx37基因的效应和Kv1.3频道在小鼠静脉动脉粥样硬化
ApoE- / -老鼠接受了高脂肪饮食,其次是尾静脉注射Cx37超表达向量(pre-CX37)或皮下注射Kv1.3阻滞剂ShK (L5)。小鼠的体重和其他指标检测,并发现没有显著差异在老鼠的体重在4组前4周。4周的管理,所有老鼠的体重增加的速度减少,和老鼠的体重小于野生型老鼠。没有显著差异之间的体重增长趋势pre-CX37组和载脂蛋白e- / -新鸿基金融集团,体重增加(L5)组略高于载脂蛋白e- / -集团是接近的C57BL / 6组(图4(一))。
(一)
(b)
(c)
(d)
12周后,ApoE的血糖指数- / -在三组老鼠都比以前更高。12周后,小鼠的血糖指数pre-CX37组高于载脂蛋白e- / -组和小鼠的血糖浓度ShK (L5)组低,接近野生型小鼠(图4 (b))。小鼠血脂的四个测试表明,TG浓度(甘油三酯)、TC(总胆固醇),高密度脂蛋白胆固醇(高密度脂蛋白胆固醇)和低密度脂蛋白胆固醇(低密度脂蛋白胆固醇)的老鼠的三组明显高于野生型小鼠,虽然ShK (L5)集团的四个指标低于载脂蛋白e- / -集团和pre-CX37(图4 (c))。Cx37超表达了对的小鼠体重无显著影响,但阻止Kv1.3途径在小鼠的活动能有效降低血脂和血糖的增加的老鼠。油红O染色结果表明,Cx37过度增加了动脉粥样硬化斑块面积,而新鸿基金融(L5)减少动脉粥样硬化斑块面积(图4 (d))。这些结果表明,Cx37超表达的小鼠可以促进作为斑块的形成,而阻塞Kv1.3通路的活性可以抑制斑块的形成。
3.4。研究Cx37基因的机制促进动脉粥样硬化的发展通过促进Kv1.3开放
为了检测Cx37和Kv1.3通路之间的关系,我们选择添加Kv1.3拦截器根据Cx37文化老鼠超表达。首先,我们发现Kv1.3和Cx37高度表达的是老鼠。Cx37的表达增加,后Kv1.3的表达也增加;然而,当Kv1.3的表达被抑制,Cx37的表达没有明显改变(图5(一个))。免疫荧光rt - pcr检测也显示相同的结果:Cx37过度可能会增加Kv1.3表达式,但Kv1.3表达下降可能不会影响Cx37表达式(图5 (b))。马森染色显示斑块ApoE胶原蛋白含量- / -组增加的价格相比野生型群体。与ApoE相比- / -集团Cx37过度增加斑块胶原蛋白含量,添加Kv1.3拦截器的基础上Cx37过度降低斑块胶原蛋白(图的内容5 (c))。Cx37超表达能促进趋化因子CCL7的表达,而表达CCL7降低了后添加Kv1.3拦截器(图5(d))。
(一)
(b)
(c)
4所示。讨论
动脉粥样硬化(AS)是一种慢性疾病,大动脉血管的不断进展,及其形成机制的特点是血管平滑的积累细胞,巨噬细胞,和脂质在动脉内膜下的早期阶段,其次是不同特色的形成纤维帽等结缔组织的增生胶原蛋白、弹性纤维、蛋白聚糖(18]。相邻细胞间的缝隙连接是一个膜通道结构,及其基本组成单元联接蛋白(Cx)。在动脉粥样硬化病变的早期阶段,单核细胞和血管内皮细胞调节彼此通过分泌或表达各种粘附分子和趋化因子(19]。近年来大量的研究表明,缝隙连接细胞间通讯(GJIC)功能障碍引起的残雪表达变化密切相关血管病变(20.]。夸克et al。21)检测斑块在老鼠和人类的发展,发现,Cx37表达逐渐迷失在内皮细胞,平滑肌逐渐增加,增加单核细胞。原位杂交显示丰富Cx37表达式在巨噬细胞、泡沫细胞区域(22]。在这项研究中,Cx37检测巨噬细胞的小鼠中高度表达,与文献结果一致。
趋化因子是由内皮细胞或激活单核细胞分泌,可以调解大量单核细胞的迁移和浸润到内膜(23]。近年来,研究发现,趋化因子不仅在细胞招聘中发挥作用,也影响细胞内稳态和激活(24]。CCL7(趋化因子配体碳碳图案7)中扮演一个重要的角色在招聘的单核细胞,钙流入、肿瘤转移等生物学效应(25]。的高表达,CCL7可以促进炎症细胞的招聘和渗透,这是直接关系到巨噬细胞在斑块的累积损伤,形成一系列病变,甚至直接关系到冠状心脏病或心肌梗死的发生率[26,27]。因此,减少CCL7在单核细胞的分泌可以减少巨噬细胞的聚集和减缓斑块形成的区域。
在这项研究中,我们发现,Cx37和Kv1.3在巨噬细胞的小鼠中,Cx37表达沉默之后,表情Kv1.3和CCL7减少,巨噬细胞的增殖是降低了。野生型老鼠和老鼠模型处理Cx37过度Kv1.3通路阻塞,并发现Cx37超表达可以改善血脂和血糖水平并增加的面积一样的老鼠。然而,阻止Kv1.3通路的活动可以降低血脂和血糖的水平,增加小鼠的体重,减少斑块的面积。阻塞Kv1.3通路的活动可以减缓的斑块发展接近野生型老鼠老鼠和使其索引。和使用Kv1.3通道阻滞剂Cx37超表达的基础上显示,抑制Kv1.3途径活性没有影响Cx37的表情,但能抑制胶原蛋白含量斑块面积的老鼠,抑制CCL7的表达,和反向Cx37进行靶向治疗的效果。因此,Cx37能提高小鼠的巨噬细胞的活动调节趋化因子的表达和Kv1.3通路的活动,充实巨噬细胞在炎症组织的面积扩大空斑的形成。
相关的临床研究表明,增加Cx37的表达和趋化因子的活性CCL7可以加速炎性反应,促进的过程(10,27),这与本研究的结论是一致的。探讨抑制Cx37和CCL7表达具有重要意义治疗动脉粥样硬化和提供了一个新的治疗动脉粥样硬化的治疗目标。同时,由于动脉粥样硬化存在于各种各样的疾病,如冠心病、脑梗塞、外周血管疾病,针对Cx37 Kv1.3和其他基因可能对冠心病和其他疾病治疗的影响。本研究证明Cx37的表达可以调节Kv1.3通路的活性。然而,Cx37调节Kv1.3通路的机制仍不清楚,还需要进一步的研究来探索监管机制在未来。
数据可用性
使用的数据来支持本研究的结果包括在本文中。
的利益冲突
没有冲突要申报的东西。
确认
本研究重点项目支持的东莞科技局(202050715001179)、科学研究和发展基金东莞人民医院(k201906)。