文摘

背景。丰富的环境(EE)可以保护大脑免受损害造成的缺血性中风;然而,这种现象的潜在机制仍然是难以捉摸的。线粒体自噬和质量控制对缺血性中风的发病机制是有帮助的。在这项研究中,我们调查是否和线粒体自噬和质量控制的保护作用EE在脑缺血再灌注损伤的急性期。方法。我们暴露了短暂性大脑中动脉闭塞(tMCAO)老鼠EE或标准条件(SC) 7天,然后研究他们的神经赤字,自噬和炎症相关蛋白、线粒体形态和功能。结果。tMCAO老鼠SC组相比,那些EE组显示神经赤字减少,相对下调炎症,LC3表达更高,更高的线粒体帕金水平,较高的线粒体分裂因子dynamin-related蛋白1 (Drp1)水平,降低p62表达式,和更低的自噬抑制剂mTOR表达式。此外,我们发现EE组表现出更多的mitophagosomes和正常的线粒体,mitolysosomes减少,线粒体膜电位和相对增加。结论。这些结果表明,情感表达增强了自噬流量通过抑制mTOR并提高mitophagy通量通过招募Drp1和帕金消除线粒体功能失调,进而抑制炎症和缓解神经赤字。限制。EE促进自噬和mitophagy的具体机制和信号通路链接它们与炎症需要进一步研究。

1。介绍

在全球范围内,许多人死于或成为残疾人每年由于中风(1]。只有一小部分的中风患者得到有效的干预,因为潜在的不良反应和狭窄的时间窗口管理治疗(2]。减少中风患者的神经损伤和改善他们的生活质量,必须开发可行的卒中后康复方法。脑缺血再灌注损伤是一种病理过程,其特征是血液供应中断,从而导致组织缺氧。血流和组织再氧化的恢复通常是与组织损伤和严重的炎症3]。

丰富的环境(EE)是一种有效的康复干预,包括各种形式的神经刺激,如感官刺激、社会刺激,刺激和锻炼(4]。EE接触已被证明对负面影响发挥保护作用与脑缺血再灌注损伤(5];然而,潜在的机制仍然是难以捉摸的。几项研究已经表明,EE曝光可以减少脑缺血再灌注损伤引起的炎症反应和限制神经元细胞凋亡的程度6- - - - - -9]。类似于细胞凋亡,自噬是一种程序性细胞死亡;然而,相比之下EE-mediated抑制神经元凋亡,EE报道促进神经元自噬的发生在急性中风10]。据报道,自噬抑制了炎症的影响,从而发挥神经保护作用[11]。因此,自噬具有保护作用对急性中风;然而,EE促进自噬流量的机制仍不清楚。自噬调控(mTOR是经典的目标12]。大量研究报道,卒中后自噬通过mTOR-dependent监管途径(13- - - - - -15]。

脑血流量在缺血性中风的中断会导致脑缺血和缺氧,导致功能障碍的线粒体氧化磷酸化和一系列的后续缺血级联反应16]。因此,线粒体质量控制对减少缺血性脑损伤stroke-induced至关重要。此外,线粒体动力学和mitophagy参与线粒体质量控制。越来越多的证据表明,他们对缺血性中风的病理和被认为是主要的治疗目标17,18]。增强mitophagy可以保护神经细胞免受过度造成的损害线粒体功能失调的积累(19]。在缺血性中风,mitophagy主要由PTEN-induced假定的激酶1 /帕金信号通路(20.]。帕金可以招募到损伤线粒体和诱导mitophagy [21]。过量的活性氧(ROS)可以由线粒体后再灌注(22),ROS能诱导线粒体分裂(23]。Drp1是细胞质GTPase介导线粒体分裂(24]。在压力诱导的线粒体损伤,Drp1招募到线粒体,它扮演着一个重要的角色在mitophagy神经系统和能量响应在基线24,25]。可能会有一些线粒体分裂和线粒体自噬之间的联系。此外,线粒体裂变发生早于mitophagy [26]。

在这项研究中,我们调查是否EE起神经保护作用增强自噬流量通过抑制mTOR和mitophagy通量通过招聘Drp1帕金。我们相信这是第一个研究调查的影响EE在缺血性中风的线粒体质量控制和验证是否EE调节自噬通过古典mTOR通路。

2。材料和方法

2.1。动物

总共有105 C57BL / 6只成年雄性小鼠(年龄,8 - 12周,体重,24 - 28 g)是购自浙江河实验动物科技公司至关重要。所有的动物实验研究符合国家健康研究所的指导的实验室动物保健和使用;实验机构批准的协议是复旦大学动物保健和使用委员会中国(批准号。2020年华山医院js - 163)。

2.2。手术和动物组

首先,异氟烷麻醉诱导的小鼠(初始浓度5%,维持在2%)。颈总动脉和颈外动脉暂时阻挡,暴露和结扎颈内动脉。尼龙长丝(广州嘉陵江生物技术有限公司,序列号L2000)被引入颈内动脉之间通过一个小切口颈外动脉的远端和近端和帖子:封闭大脑中动脉的起源1 h。灯丝被移除,醒着的老鼠放在一个冷却箱。区域脑血流量(rCBF)在所有使用激光多普勒flowmetry tMCAO动物监测。动物死亡或未能显示≥80% rCBF减少相对于preischemic水平被排除在进一步的实验。在整个实验中,室温保持在25°C,和老鼠的体温仍维持在37°C。tMCAO-treated小鼠随机分为以下组:tMCAO-treated老鼠维持在标准条件下(tMCAO +标准条件(SC)组; )并维持tMCAO-treated老鼠EE条件下(tMCAO + EE组; )。其余小鼠受到虚假的操作组成的结扎颈外动脉异氟烷麻醉下,之后,他们被安置在标准条件下(假+ SC组; )。

2.3。住房条件

EE组放置在一个 笼子里(图1(一)),这是配备了一个有趣的房间,转轮,扭曲管,一个运动的房间,和彩色块等设施提供感觉运动和认知刺激。EE也提供了增强的社会刺激有11个老鼠住在一起。老鼠被允许主动锻炼。玩具和玩具配售是改变每三天来促进EE的新奇和探索。SC住房被放置在一个标准的笼子里的老鼠( ;图1 (b)包含六个老鼠每笼)。

2.4。行为测试

老鼠的行为测试1天,手术后7天,分别。

2.4.1。修改神经严重程度评分(mns)

mns是分级规模从0(无损害)14(严重损害)和由三个马达测试(尾提高、移动和平衡梁)和两个感官测试(耳廓和角膜反射)。mns更高分数反映了一个更严重的伤害。

2.4.2。Rotarod测试

在操作之前,老鼠连续三天训练,第三天是获得的测试值作为基线。只老鼠可能仍在旋转杆至少200年代被选为后续实验。的总时间小鼠成功仍在旋转杆被记录,和杆上的老鼠仍然被动地记录有下降。rotarod加速从4 - 40在300年代期间的rpm。

2.4.3。开放田地测试

老鼠分别放在四个自发活动箱(每箱: )每天30分钟三天来适应环境。的运动路径和距离都被记录下来。

2.5。组织病理学

手术后7天,小鼠麻醉与预冷灌注1%戊巴比妥钠和磷酸盐(PBS)通过心脏,然后用4%多聚甲醛内固定治疗。大脑很快被删除和4%多聚甲醛固定48 h。这些样品被嵌入在石蜡,切成5μ米部分使用切片机;这些部分被苏木精和伊红染色,甲酚紫观察大脑结构造成的任何伤害。我们计算每平方微米幸存神经元尼氏小体的形状和数量显示ImageJ,尼氏小体的密度是一样的幸存神经元的密度。

2.6。免疫荧光染色

大脑组织( )放入30%蔗糖溶液为24小时,切成30μ使用徕卡m日冕部分CM1950低温恒温器(徕卡微系统)。与PBS洗涤后,日冕部分密封与10%山羊血清(C0265 Beyotime)然后孵化主要抗体Drp1 (ab184247 Abcam)和帕金(JF82-09罗福斯)。10%的部分被密封的山羊血清1 h,然后孵化Tomm20抗体(H00009804-M01 Abnova)。之后,部分沾fluorochrome-conjugated二级抗体(zf - 0311, ZSGB-BIO)、胶质原纤维酸性蛋白抗体(1:5000;ab7260 Abcam)和电离钙结合适配器分子1抗体(1:500;和光)。019 - 19741年kouichi总之,石蜡切片与anti-nuclei应用(NeuN)抗体(ab177487 Abcam)在4°C在一夜之间,随后受到末端转移酶的dUTP使用原位缺口末端标记染色细胞死亡检测设备(猫。11号684 795 910)根据制造商的协议。最后,部分与4孵化 ,6-diamidino-2-phenylindole (C1002 Beyotime)核染料,和部分可视化使用共焦激光扫描显微镜(FV1000,奥林巴斯)。部分从前脑、中脑和后脑地区是随机挑选的,所以,缺血半影数进行统计分析。

2.7。量化Real-Time-Polymerase连锁反应(qPCR)

总RNA提取的梗塞的皮质三组使用一个RNAprep纯组织工具包(DP431, Tiangen)。总RNA是反向转录成cDNA FastKing RT工具包(KR116, Tiangen)。qPCR执行使用SuperReal预混料+根据制造商的指示(FP205, Tiangen)。引物序列表中列出1。所有数据归一化甘油醛3 -磷酸脱氢酶mRNA的水平。

2.8。免疫印迹

梗塞的皮层总蛋白提取使用蛋白质提取工具包(bb - 3101, Bestbio)和线粒体蛋白质的梗塞的皮质是孤立的使用组织线粒体隔离设备(C3606 Beyotime)。蛋白质的浓度测量使用bicinchoninic酸的方法,和加载缓冲区添加获得平等的浓度(3μ克/μL)。样品受到15%钠十二烷基sulfate-polyacrylamide 0.45凝胶电泳和转移μm聚乙二烯二氟化物膜。洗后与tris-buffered盐水渐变®20 0.1%,膜密封使用20分钟快速密封解决方案然后孵化主要抗体在4°C一夜之间,和相应的二次抗体(bs - 0296 g, bios)在室温下孵化2 h。

以下主要使用抗体:LC3B (L7543σ),p62 (18420 - 1 - ap, Proteintech) mTOR(# 2983,细胞信号技术),p-mTOR(# 5536,细胞信号技术),il - 1β(16806 - 1 - ap, Proteintech), il - 6(# 12153,细胞信号技术)、肿瘤坏死因子-α(BS1857 Bioworld技术)β肌动蛋白(# 3700,细胞信号技术),第四考克斯(ab202554 Abcam) Drp1 (ab184247 Abcam)和帕金(JF82-09罗福斯)。

2.9。线粒体膜电位检测

线粒体分离使用组织线粒体隔离设备,然后立即沾线粒体膜电位(MMP)分析工具包JC-1 (C2006 Beyotime)和流式细胞术检测出来。

2.10。电子显微镜

老鼠被随机选中的三组小鼠,分别有1%戊巴比妥钠麻醉。与2.5%戊二醛固定后,大脑被孤立,peri-infarct地区切成1毫米³块,用2.5%戊二醛固定治疗方案在一夜之间在4°C,然后四氧化锇固定为1%。与柠檬酸和铀醋酸双染色后,这些作品被削减为70纳米超薄部分并使用日立HT7800透射电子显微镜观察(日立、日本)。正常的线粒体的数量,mitolysosomes, mitophagosomes从七每张幻灯片图像计算为每个鼠标和三种不同的幻灯片。正常的线粒体被定义为拥有完整的内外膜和嵴排列整齐,像之前报道27]。mitophagosome有明显的双层膜结构,mitolysosome具有单层结构(undecomposed线粒体膜并不是一个完整的膜结构)。

2.11。统计分析

8.0数据分析使用GraphPad棱镜(GraphPad软件公司,圣地亚哥、钙、美国),和所有的结果表示为 。 使用双尾值计算测试或Mann-Whitney测试。一个< 0.05被认为是具有统计学意义的价值。Drp1之间的相关性,分析了帕金使用R语言; 被认为是表明他们之间的相关性。

3所示。结果

3.1。EE表现出神经保护神经功能的影响

我们使用一系列行为测试来评估小鼠的神经功能(图1)。与假+ SC组小鼠相比,tMCAO + SC组小鼠显示明显卒中后神经功能受损,这是证明了mns的增加(图1 (h)),减少延迟下降(图1 (f)),不愿移动和探索(图1 (g))。然而,与tMCAO + SC组小鼠相比,tMCAO + EE组小鼠显示显著提高神经功能(数据1 (f)- - - - - -1 (h))。

3.2。EE表现出神经结构的神经保护作用

接下来,我们研究大脑结构和神经细胞凋亡(图2)。无明显神经元凋亡的假+ SC组(图2 (b))。EE被发现显著促进缺血性中风后大脑结构的恢复数据2 (c)- - - - - -2 (e))。此外,EE减少神经细胞凋亡在脑缺血再灌注损伤(数字2(一个)和2 (b))。

3.3。EE表现出神经保护作用的神经炎症

我们还测试了炎症相关的因素(数字3和4)和卒中后发现炎症反应明显。tMCAO + SC组相比,然而tMCAO + EE组表现出显著降低水平的反应性星形胶质细胞,小胶质细胞(图3),炎症因子,包括il - 1β、il - 6和TNF -α(图4)。

3.4。EE增强自噬通过抑制mTOR通量

我们确定总蛋白质的表达与自噬相关。假+ SC组相比,其他两组显示更多的自噬和抑制mTOR表达式卒中后(图5)。然而,tMCAO + SC组相比,tMCAO + EE组显示明显高于LC3-II /β肌动蛋白比(数据5(一个)和5 (c))和显著降低p62水平(数字5(一个)和5 (d))和p-mTOR / mTOR比率(数字5(一个)和5 (b))。综上所述,这些研究结果表明,情感表达增强的自噬通过抑制mTOR通量。

3.5。通过招聘Drp1和帕金EE增强Mitophagy通量

接下来,我们调查了线粒体结构和功能(数据6和7)。很明显,线粒体的结构和功能的其他两组不同程度受损而假+ SC组(数字6和7)。然而,tMCAO + SC组相比,tMCAO + EE集团更加正常的线粒体和mitophagosomes和更少的mitolysosomes在电子显微镜下观察(图6)。我们也观察到,EE改善MMP(图7)。与此同时,我们确定线粒体蛋白(数据的表达8和9)。很明显,其他两组的线粒体分裂和mitophagy增加在不同程度上与假+ SC组(数字8和9)。正如预期的那样,帕金的蛋白质水平显著增加tMCAO + EE组相比tMCAO + SC组(数字8 (c),8 (d),9(一个),9 (c)),我们也发现增加LC3-II /第四考克斯比和减少p62表达式tMCAO + EE组(数字9 (d)- - - - - -9 (f)),这表明EE可以提高mitophagy通量通过促进帕金招聘。不同tMCAO + EE集团LC3和p62 tMCAO + SC组的蛋白质积累,表明mitophagy通量的tMCAO + SC组阻塞(数字9 (d)- - - - - -9 (f))。tMCAO + EE集团不仅增强mitophagy还增加了线粒体分裂通过促进Drp1招聘(数字8(一个),8 (b),9(一个),9 (b))。我们还演示了Drp1水平之间的正相关和缺血性中风后帕金tMCAO + EE(图组9 (g)),这表明EE增强通过招募Drp1和帕金mitophagy通量。

4所示。讨论

我们的研究表明,情感表达可以增强自噬流量通过抑制mTOR和增强mitophagy通量通过招募Drp1帕金;此外,它揭示了Drp1之间存在高度正相关,帕金,进一步抑制炎性因子的表达,从而导致抗炎和神经保护作用。我们的研究结果表明,通过mTOR-dependent EE促进自噬通路。然而,作为一个综合干预,情感表达可能促进自噬在许多方面,有必要与mTOR基因敲除小鼠来验证是否自噬也可以提升EE通过mTOR-independent通路的进一步研究。我们的研究结果表明,mitophagy被脑缺血再灌注损伤。尽管缺血性中风可以增加线粒体Drp1易位,帕金在某种程度上,下游mitophagy通量的堵塞导致mitolysosomes的积累和线粒体功能失调。我们决定支持计数正常线粒体而不是受损的线粒体因为轻度受损的线粒体可能正常化通过各种修复机制(28]。难以识别线粒体是是否真的完全损坏。更为正常的线粒体也显示少受损的线粒体。

在这项研究中,我们提供了证据支持通过自噬EE的神经保护作用。然而,目前尚不清楚如何通过mTOR-dependent EE调节自噬通路。(磷酸肌醇的3-kinase) - PI3K蛋白激酶B(一种蛋白激酶)和增殖蛋白激酶(MAPK) /细胞外signal-regulated激酶(ERK) 1/2信号通路被上调mTOR活动,而活化蛋白激酶和sestrin可以下调mTOR活动(29日,30.]。EE可能抑制mTOR通过抑制PI3K-AKT和MAPK / ERK1/2信号通路。EE激活自噬的机制,以减少炎症尚不清楚。以前的文献[31日,32)让我们推测mTOR通过一些炎症介导这些影响监管因素,如核factor-kappa (NF - BκB),我们将在未来的研究探索。EE据说会使炎症因子的表达在神经元,星形胶质细胞和小胶质细胞通过一些炎症相关的通路(33,34]。除了mTOR-dependent方法中,自噬可能是介导通过mTOR-independent方法,这可能与钙超载和Beclin-1通路的激活35,36]。此外,EE-enhanced自噬可能发生在不同的大脑细胞,这可能导致特异性效应。只有通过识别涉及的所有因素和途径我们可以获得更好的理解自噬在中风的作用。

脑缺血再灌注损伤和线粒体损伤是分不开的事件作为脑缺血再灌注损伤引起的级联反应与由受损的线粒体ROS的生成(37]。Mitophagy可以消除病态的线粒体和减少ROS缓解炎症的生产38]。Drp1和帕金位于细胞质中39,40),他们两人被雇来的线粒体对线粒体损伤,表明一些信号通路在细胞质中,如PI3k / AKT通路,可能参与mitophagy卒中后(41]。帕金是mitophagy上游起始分子的过程。

据报道,抑制线粒体分裂块Parkin-dependent mitophagy [42,43]。这是符合我们的研究结果的同步增加Drp1和帕金tMCAO + EE组。研究表明,帕金能促进mitophagy通过招募Drp1 [44]。然而,其他研究已经报道,Drp1徒上游的帕金45]。帕金是E3泛素连接酶,从而抑制线粒体融合(46]。短暂,线粒体分裂是必不可少的Parkin-dependent mitophagy,我们认为这可能会进一步鼓励mitophagosome形成和随后的溶酶体与线粒体碎片捕捉。基因小鼠模型之间的关系需要进一步阐明Drp1和帕金EE-induced mitophagy。在心脏ischemia-caused心脏衰竭,7天内可以观察到mitophagy,线粒体易位Drp1比赛的时候mitophagy [47]。然而,mitophagy和线粒体分裂和mitophagy是否同步缺血性中风后在不同的时间尚不清楚。我们目前的研究只显示一个高度正相关线粒体分裂之间Drp1and mitophagy帕金引起的缺血性中风后的第七天。除了Parkin-dependent mitophagy通路,BNIP3和FUNDC1也可以调解mitophagy [48],Drp1中也扮演了重要的角色在Parkin-independent mitophagy通路(49]。除了线粒体裂变,线粒体融合还参与线粒体的质量控制(50]。帕金抑制线粒体融合促进线粒体分裂,因此,mitofusions可能参与随后的线粒体的结构和功能修复后的间隙,多数线粒体功能失调。

除了mitophagy,自噬的细胞器,如内质网,也有助于维持细胞内稳态(51]。进一步研究EE-induced细胞器自噬与细胞自噬被要求澄清EE在缺血性中风的神经保护机制。

然而,我们的研究也有一些局限性。EE的具体机制促进自噬和mitophagy链接他们的信号通路和炎症尚不清楚。此外,自噬和mitophagy之间的关系以及它们如何相互影响仍然未知。在进一步的研究中,除了阐明保护机制与情感表达有关,我们希望确定新的治疗目标中风和阐明导致中风相关的损伤的病理生理过程。

综上所述,我们证实EE的神经保护效应在缺血性中风和展示了EE对自噬的影响,线粒体动力学和mitophagy。我们的研究结果为康复治疗的发展非常重要。

数据可用性

所有生成的数据在当前研究可从相应的作者在合理的请求。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

研究设计和概念被QQZ贡献,键槽,YW;文献检索和实验实现被QQZ完成,键槽,YW;数据采集是由QQZ、会和JFW;统计分析是由智友和MXL;稿件的写作是由QQZ完成的。所有作者都批准了最终版本的手稿。

确认

这项工作得到了国家自然科学基金(81972141号,82172544 (YW),和82072547(键槽))。我们感谢张宿迁深刻的讨论和同事帮助完成这个项目。