文摘

客观的。一些产品的相对贡献与生命起源以前的效果,如菊粉,加上药物特定于人类肠道微生物组还没有全面的研究。本研究确定潜在的操纵人群肠道微生物组单独使用菊粉和结合其他代理在代谢综合征患者(大都会)。研究还评估是否存在关系变化在多个临床参数反映-干预法与肠道环境的变化。参与者/方法。这只有单盲随机社区试点试验随机分配60名患者(平均年龄46.3 y和男性,43%)与大都会接收菊粉,菊粉+中国传统医学(中医),或菊粉+二甲双胍为6个月。血脂、血糖、尿酸(UA)水平进行分析在经过一夜之间快速的采集静脉血样本8 h在基线和随访期结束。微生物群粪便样本的分类学的分析使用16 s RNA扩增子测序,进行微生物和响应能力和综合分析数据在6个月。结果。16 s rRNA测序的结果表明,菊粉导致更高比例的拟杆菌的端点与菊粉+中医和菊粉+二甲双胍( )。更多的Romboutsia ( ),链球菌( ),和Holdemanella ( )被发现在菊粉+中医和菊粉+二甲双胍样本。我们进一步发现肠道微生物群与脂类的关系,UA和葡萄糖,影响发展的大都会。结论。在团体中,菊粉单独或结合二甲双胍或中医改变特定的肠道微生物群分类单元而不是一般的多样性。因此,我们分析代谢物相关的微生物群,可能提供更多的信息关于内在的差异。因此,一个可靠的方法可以在未来开发治疗代谢综合征。

1。介绍

非传染性代谢综合征(大都会)是一个日益增长的全球公共卫生问题。代谢综合征是一个星座的代谢疾病,特点是腹部肥胖,dyslipidaemia,低水平的高密度脂蛋白胆固醇(高密度脂蛋白。(C)、高血压和胰岛素抵抗1]。代谢综合征直接影响健康通过心血管和cerebrovascular-related疾病的发展,会增加癌症的风险2]。的口服药物可以改善病人的结果在代谢指标方面,对肠道微生物群在这类病人的状态3]。

人类胃肠道房屋成千上万的细菌种类(4]。失调的肠道微生物群和/或结构改变会引发疾病和破坏上皮屏障,它抒发内毒素的释放的增加,脂多糖,从革兰氏阴性细菌细胞壁进入体循环,进而促炎细胞因子分泌(5]。因此,许多研究肠道微生物的拱形突出(6]。研究人类和其他动物的证据揭示了肠道微生物之间的联系和各种组件的大都会7,8]。益生元被定义为基质由主机有选择地利用微生物和带来健康方面的好处9]。ILSI欧洲生命起源以前的专家组和生命起源以前的专责小组提出了生命起源以前的影响的概念定义如下:选择性刺激增长和/或活动(ies)的一个或一个有限数量的微生物种属(时代)/物种带来的肠道微生物群(s)健康的好处在主机(10]。产品生命起源以前的影响被评估在临床试验中为了改善肠道微生物生态失调(10]。此外,肠道微生物群的操纵通过生命起源以前的干预提供了证据表明,肠道微生物调制有助于提高组件或代谢综合征的并发症(7]。

益生元有利有益的细菌的增长,尤其是那些产生短链脂肪酸(SCFAs)。SCFAs增加肠道与体重增加放缓,防范系统性炎症通过增加肠道屏障功能,和改善葡萄糖和脂类代谢11]。菊粉,non-digestible膳食纤维,是一种常见的生命起源以前的。

传统中药(TCM)是一种复方用药有几千年的历史。天然药物及其产生的生物活性被认为是对疾病的治疗策略(12),包括大都会(13]。一些中药明显影响葡萄糖和脂类代谢的调节肠道微生物群,尤其是细菌降解粘蛋白,有消炎作用,产生脂多糖和SCFAs,或胆汁盐水解酶活性(14]。即时药膳包在当下研究的黄连,白术macrocephala、陈皮、焦麦芽、药用叶子(炒)、山楂(烧焦)根据一个特定的公式(补充表1)。黄连(Huang-Lian),一个常见的中医草药,是临床上有效治疗dyslipidaemia和鸡蛋15]。山楂也被广泛应用于管理hyperlipidaemia和心血管疾病(13]。药用树叶通过抗氧化和抗炎活动提高人体免疫力,导致监管的肠道微生物区系平衡(16]。

二甲双胍与肠道微生物群的构成(17),即使在人类健康(18]。它也适用于治疗或预防hyperlipidaemia和心血管疾病19]。

生命起源以前的混合的能力调节微生物群落在主机和受益于菌株之间的共生关系改善的效果进行了调查(20.]。这里,仅仅是生命起源以前的组合的组合产品有益于宿主健康与生命起源以前的影响。然而,我们所知,对菊粉的影响当结合其他代理在改善肠道患者大都会的小群体。总的来说,我们认为生命起源以前的组合将增强的主机和利用微生物多样性共生的生物体之间的关系带来更多好处。

本研究旨在确定这些产品的影响主要是针对人类肠道微生物群的结构和组成患者大都会。微生物群的形象可能会提供一个更完整的画卷更清晰的优先治疗代谢紊乱,为进一步研究铺平了道路。

2。方法

2.1。诊断标准的大都会

临床大都会时被诊断出至少三个符合以下5个条件: 分别在男人和女人或≥80厘米;血压,120/80-140/90毫米汞柱;甘油三酸酯,150 - 200 mg / dL。高密度脂蛋白,< 40或< 50 mg / dL在男性和女性,分别和空腹血糖100 - 125 mg / dL。

2.2。研究人群

天津的居民> 5年,年龄在35 - 65年包括如果他们没有炎症性胃肠病或胃肠道手术后5年的历史,没有规定用抗生素或其他药物(质子泵抑制剂和H₂受体拮抗剂)或膳食补充剂(益生菌和益生元)或抗酸药,可能会影响肠道微生物群在招聘前6周。他们提供了一本小册子,在体检过程研究,要求参与如果根据上述标准的资格。书面知情同意参加从资格获得60个人表示感兴趣,符合入选标准。

2.3。干预

所有的参与者被随机和同样分为口服菊粉,菊粉+中药配方,菊粉+二甲双胍( 每组)6个月。他们被指示不改变他们的生活方式,饮食,和往常一样在学习和体育活动为6个月每月两次电话联系或入户访问监测副作用和遵从性。没有参与者抱怨的胃肠道不良反应。所有参与者返回空或者剩余分配数据包来验证兼容性的端点。

2.4。数据收集

人口统计信息和身体活动问卷调查收集。身体活动评估是基于参与者是否每天锻炼。体重、身高、腰围和血压测量现场的护士。使用校准身高-体重身高和体重测量仪。腰围测量在肚脐上方0.5 - 1厘米的层面上使用卷尺。血压是计算从三个读取相同的胳膊上5分钟休息后semiupright位置。空腹血浆样品也收集基线和研究结束的。血清葡萄糖、总甘油三酯(TGs)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、总胆固醇(T-CHOL),尿酸(UA)使用一个自动分析仪测定。

收集粪便样本的干预。粪便收集工具包提供的参与者与指令的正确方法收集粪便样本。代表整个细菌组件/结构,大力大便的均质,和一汤匙的粪便样本被放置在一个标签无菌锥形管,放置在一个生物危害袋子,送到实验室在冰上,储存在-80°C。

2.5。宏基因组的措施

2.5.1。基因组DNA的提取

浓度和纯度的总从粪便样本中提取细菌的DNA使用CTAB / SDS法(Novogene生物信息学技术有限公司,北京,中国)在1%的琼脂糖凝胶进行电泳。样本的DNA被稀释1 ng /μL无菌水。

2.5.2。扩增子生成和净化

细菌基因组DNA是放大使用特定的引物515 f (GTGCCAGCMGCCGCGGTAA)和806 r (GGACTACHVGGGTWTCTAAT) V4 16 s rRNA基因的变异度高的地区。所有聚合酶链反应(PCR)在30μL卷包含15μL (Phusion®高保真PCR主混合(新英格兰生物学实验室Inc .,伊普斯维奇,妈,美国),0.2μM正向和反向引物,大约10 ng模板DNA。1分钟的循环条件由98°C,紧随其后的是30 98°C的周期10年代,50°C 30年代,30年代72°C, 72°C 5分钟紧随其后。PCR产品在同等体积的1 x加载缓冲区(包含SYB绿色)是解决2%琼脂糖凝胶电泳。样品与明亮的主要乐队在400 - 450年英国石油公司在同等密度和纯化混合使用基因喷气凝胶萃取设备(热费希尔科学Inc .)、沃尔瑟姆,妈,美国)。

2.5.3。宏基因组测序和分析

DNA测序图书馆使用Illumina公司生成TruSeq PCR-Free图书馆准备工具包(Illumina公司Inc .)、圣地亚哥、钙、美国)所描述的制造商,和索引代码添加了。图书馆评估使用的质量(电子邮件保护)2.0荧光计(热费希尔科学Inc .)和一个安捷伦生物分析仪2100系统。图书馆是测序的Illumina公司NovaSeq平台,和250个基点paired-end读取生成。原始的16 s rRNA基因序列读取过滤站,合并,和集群为操作分类单元(辣子鸡)≥97%相似,和嵌合序列识别和移除。代表每个OTU序列筛选进一步注释。每个样本的测序质量包括DNA的纯度是补充表所示2。

2.6。体外试验

微型板块分析、琼脂扩散试验进行测试配方和特定的细菌之间的关系。

2.6.1。微型板块分析

剂含有1% Romboutsia、链球菌或Holdemanella是放置在LB培养基(表达载体,# 10855001),在乘96 -孔板。同时,相同体积的菊粉,添加了菊粉+中医,或菊粉+二甲双胍入井。生长动力学被标仪监测(Tecan无限M200)每两个小时。两个波长(700 nm和520 nm)被用来避免/减少干扰背景信号。

2.6.2。琼脂扩散试验

霜含菊糖、菊粉+中药或菊粉+二甲双胍,分别放置在6毫米孔穆勒辛顿琼脂板(ThermalFisher # R01620),接种Romboutsia之后,链球菌,或Holdemanella,盘子被孵化一夜之间在35°C。直径的孔周围明确区测量和比较。

2.7。统计分析

所有数据使用SPSS统计分析软件(版本26.0;、IBM、美国纽约Armonk)和表达 。连续和分类变量使用基线特征进行分析 - - - - - -测试和分别测试。肠道微生物群异形intent-to-treat基础上,无论参与者执行或完成这项研究。序列分析使用R软件(3.5.2)版本。不同组间使用克鲁斯卡尔-沃利斯卡方检验进行分析。所有的值与 被认为重要。

3所示。结果

3.1。参与者的特征

60参与者的基线特征相似(表1)。的干预,所有与会者都包括在分析中。

3.2。改变肠道微生物群

5382635可用的序列使用Illumina公司NovaSeq从所有样本获取的平台,3899784是高质量的,收益率平均每样64996序列。OTU的结果分析表明,细菌的数量并没有改变在菊粉,菊粉+中医,菊粉+二甲双胍组( 和 ,分别;数据1(一)和1 (b))。然而,加权主坐标(PCoA),非度量多维标度(nmd)(数据1 (c)和1 (d)),未加权的加权/ UniFrac分析3组显示显著差异之间的细菌类群在肠道微生物群组成的组( 和 ;数据2(一个)和2 (b))。分析组相似(ANOSIM)也显示三组之间的显著差异( , ,补充图1)。

进一步确认操作的三组肠道微生物群落,主要菌种门,家庭,和属水平调查通过测序和分析16 s rRNA。图3在这些水平显示栏块相对丰富。与先前的研究一致,拟杆菌、厚壁菌门和变形菌门的主要类群,其次是放线菌。丰富的拟杆菌门水平相对增加( )菊粉的比其他两组(24.6%)vs。分别为12.4%和16.7%),而变形菌门( )菊粉和中医治疗武器是10.1%,21.2%,和9.7%,分别。厚壁菌门细菌没有显著差异( )。类杆菌( )和Ruminococcaceae ( )是最丰富的菊粉组家庭,而肠杆菌科( )和Veillonellaceae ( )是最丰富的菊粉中医组,和链球菌科( )是最丰富的菊粉+二甲双胍组。我们分析了前15属进一步评估调制的微生物群落在属水平。拟杆菌的相对比例高( )菊粉的比其他两组,但丰富的Romboutsia ( ),链球菌( ),和Holdemanella ( )在菊粉+中医大,菊粉+二甲双胍样本,分别。

团体之间的微分丰富评估使用线性判别分析效果(LEfSe)化验( )(数据2 (c)和2 (d))。肠道微生物群中不同组;拟杆菌门(门)、类杆菌和Ruminococcaceae(家庭)和拟杆菌(属)更丰富的菊粉组。变形菌门(门),肠杆菌科和Veillonellaceae(家庭),和Romboutsia(属)是占主导地位的菊粉+中药组。链球菌科(家庭)和链球菌和Holdemanella(属)在菊粉+二甲双胍组明显升高。

总的来说,这些结果显示类似的数字但显著差异的类型的细菌在肠道微生物群在三组。

3.3。细菌丰度和大都会风险因素之间的相关性

丰度之间的相关性,存在不同的细菌和参与者在每组的临床参数进行分析来识别主机响应和细菌丰度之间的联系。图4总结研究结果,详细的补充图1。

几个协会重要的菊粉组(图4)。

中细菌丰度显著和呈正相关临床参数,高密度脂蛋白水平的丰度密切相关拟杆菌门( , ),类杆菌( , ),和拟杆菌( , )。一些细菌负相关临床参数的菊粉组。例如,大量的放线菌与T-CHOL负相关( , )和低密度脂蛋白( , ),而UA积极相关( , )。类似地,厚壁菌门丰度显著负相关,与高密度脂蛋白( , )。

图4显示了细菌丰度之间的相关性和菊粉+中药组临床参数。Romboutsia之间的相关性和高密度脂蛋白和Veillonellaceae和WC之间负( , 和 , ,分别)。

更少的重要细菌丰度和临床参数之间的相关性被发现菊粉+二甲双胍的患者大都会比其他两组(图4)。

4所示。讨论

这项前瞻性研究分析肠道微生物群的特点及其对危险因素患者大都会处理各种配方。对这些特点和相关性;因此,特定的细菌产生和干预措施的影响微生物群需要理解发展基础进一步调查大都会的最佳治疗方法。

LEfSe结果表明Ruminococcaceae家族和拟杆菌属更丰富的菊粉组。Ruminococcaceae家庭扮演着重要的角色在膳食纤维退化和参与生产提供能量的SCFAs结肠上皮和系统性的营养21]。SCFAs影响葡萄糖稳态、脂质代谢、免疫系统的调节,炎症反应(22]。然而,我们没有确定SCFAs和大都会特征之间的联系,这可能是由于饮食不平衡。

拟杆菌属包括革兰氏阴性、专性厌氧,不动的,nonspore形成棒组件中最普遍的人类肠道菌群与重要的多糖降能器在人类肠道(23]。结肠微生物可以分解“耐”不是生物新陈代谢的多糖通过小肠在运输途中。多糖衍生物的适当修改后的结构可以提高多糖的免疫活动。他们可以积极增强免疫细胞和调节免疫功能24]。例如,硫酸多糖可以提高多糖的作用在巨噬细胞吞噬作用和促进il - 6的分泌,il - 1β和其他由巨噬细胞(白细胞介素25]。

更高比例的肠杆菌科和Veillonellaceae家庭和Romboutsia属与菊粉+中医。一些疾病与明显高于丰富的肠杆菌科和Veillonellaceae26,27]。此外,这两个分类单元通常是发现在一起(26]。肠杆菌科的增加内脏相关的微生物种群的微生物签名上皮功能障碍(28]。丰富的Veillonellaceae与葡萄糖反应的变化呈负相关和生命起源以前的摄入量后il - 6水平29日]。Romboutsia、肥胖生物标志物相关积极和显著的体重指标(包括腰围和体重指数)、血清脂质(低密度脂蛋白,TGs和T-CHOL)和UA在人类30.]。属Romboutsia还积极与高密度脂蛋白相关啮齿动物模型(31日]。

链球菌和Holdemanella属相对更丰富的菊粉+二甲双胍组。链球菌可能增加叶酸的生产水平和血清叶酸浓度通过的upregulation folate-mediated一个碳代谢和脂肪酸氧化途径。这将导致快速和显著减少肝脏脂肪含量和其他代谢疾病危险因素(32]。然而,链球菌与多种代谢紊乱的发展,包括动脉粥样硬化性心血管疾病(33,34]。Holdemanella和性别脂肪分布之间的关系已被确认。Holdemanella属有关积极的和消极的android脂肪比率在男性和女性中,分别是(35]。二甲双胍负责大部分的肠道微生物群的变化和代谢改善与生命起源以前的干预(36]。

这项研究有一些局限性。干预措施的影响仍不确定的大小,因为研究对象是极其微小的排除机会发现的可能性。一段本事没有应用,因此,先前的肠道细菌的特性可能会影响结果。需要更大规模的研究来确认结构改变后相差的干预措施。变化可以确定在实验动物环境系统的控制。分类单元而言,我们没有获得更多的细菌物种信息与生理角色密切相关。饮食/生活方式之间的相互作用可能发生肠道微生物和微生物之一。肠道细菌和相应代谢物之间的关系并没有分析。

有趣的是,我们的在体外研究表明,Romboutsia密度、链球菌和Holdemanella没有被使用的草药配方改变在这项研究中,由微型板块分析和琼脂扩散(补充图2)。这表明草药需要消化,中间产品或副产品诱导肠道微生物群的改变。就有必要澄清的产品在未来研究(s)。

总之,信息是不足以得出不同的干预措施在大都会的风险因素的影响。生命起源以前的混合成分是否单独行动或组合调节肠道微生物组仍不清楚。还需要进一步的研究来进行澄清的分子机制,确定影响生命起源以前的在人类肠道微生物组。然而,代谢产物来源于微生物群可能促进更好的描述大都会的微生物群与风险之间的关系。与微生物相关的代谢福利变化需要进一步的调查,他们将提供洞察微生物代谢物的角色作为潜在候选人生物标志物在患有代谢综合症。

数据可用性

原始测序数据和代码生成或在本研究分析可从相应的作者在合理的请求。

的利益冲突

作者声明,这个调查是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。

作者的贡献

明,Lingzhang孟,豫章设计了这个研究。剑歌帮助设计。Ruiping田、香港、和Jingjie赵收集活检和测序。Jingjie赵和Ruiping田进行数据分析。Dengyuan周、刘杨臣Zhenshan焦部分数据进行分析。剑歌部分数据进行分析和由该手稿。Ruiping田、香港、和Jingjie赵本研究同样起到了推波助澜的作用。张于修订后的手稿。

确认

这项研究得到了天津市科技计划项目(# 17 zxmfsy00030)。

补充材料

补充1。补充表1:草药的构成公式。草药的构成公式描述的表,其中每个组件的数量信息。

补充2。补充表2:每个样本的测序质量。每个样本的测序质量测试,并提供进一步的构象。

补充3。补充图1:分析相似之处(ANOSIM)表明,组间均有显著差异( , )。小提琴的情节显示不同群体之间的相似性分析肠道微生物群。

补充4。补充图2:在体外试验表现出特定的细菌没有改变。(A)微型板块分析表明,Romboutsia链球菌,Holdemanella没有改变不同的治疗方法。从5个重复实验获得的数据表示类似的结果。NS:不重要。每组包含8个样本。(B)琼脂扩散试验显示Romboutsia,链球菌,Holdemanella没有改变不同的治疗方法。从5个重复实验获得的数据表示类似的结果。NS:不重要。每组包含8个样本。