文摘
肠上皮细胞是一种重要的人类胃肠道屏障,和上皮愈合伤口是许多肠道疾病的关键过程。α-酸(ALA)被证实有抗氧化和抗炎作用,这可能是有用的在肠上皮损伤修复。阿拉巴马州的影响在人类结肠上皮细胞NCM460和人类大肠癌细胞腺癌Caco-2进行了研究。阿拉巴马州显著提升NCM460和Caco-2迁移,增加粘膜紧密连接因素ZO-1和OCLN表达式,阿拉巴马州和加速伤口愈合的细胞损伤修复细胞试验。免疫印迹分析表明,阿拉巴马州抑制多种增殖蛋白激酶(MAPK)信号通路在上皮细胞。总之,阿拉巴马州是有益的肠道上皮损伤的修复调节MAPK信号通路。
1。介绍
肠上皮细胞形成一个从底层分离腔的内容组织选择性障碍。伤口愈合后肠上皮损伤是一个动态的微环境的生物过程由一个复杂的网络监管1]。研究表明,多种细胞因子(如α辅肌动蛋白和toll样受体(2)、监管肽和饮食因素(3调节肠上皮伤口愈合。值得注意的是,氧化还原平衡是肠内稳态的关键,和生产过剩的活性氧引起的氧化upregulation或起伏的线粒体功能与肠上皮损伤(4]。
α-酸(ALA),一种天然植物dimercaptan抗氧化剂,线粒体是一种常见的化合物,在线粒体代谢中扮演着重要的角色5]。阿拉巴马州的酶的辅因子参与葡萄糖和脂类代谢和调节基因转录6]。代谢的抗氧化剂,阿拉巴马州调节NF -κB信号转导和防止氧化损伤(7]。此外,阿拉巴马州可以下调促炎redox-sensitive信号转导过程和具有一定的抗炎作用[8]。基于上述属性,阿拉巴马州应用于阿尔茨海默氏症、糖尿病性多神经病,和肥胖9]。目前,阿拉巴马州在肠道损伤的干预中的应用是越来越受欢迎。阿拉巴马州Guven等人的研究表明,预防缺血/再灌注损伤大鼠小肠通过清除ROS和RNS (10]。阿拉巴马州一个体外Caco-2细胞模型,补充证明提高上皮细胞增殖,从而避免破坏肠上皮的完整性(11]。在小鼠体内实验,阿拉巴马州保护肠道对溃疡性结肠炎和相关的系统性损害(12]。
本研究旨在探讨ALA对肠道上皮损伤修复的影响及其机制,为临床治疗提供理论依据。
2。材料和方法
2.1。细胞培养和试剂
人类结肠上皮细胞NCM460和人类大肠癌细胞腺癌Caco-2从美国购买类型文化(美国马纳萨斯写明ATCC)集合。细胞培养在罗斯威尔公园纪念研究所DMEM / F12培养基补充10%胎牛血清的边后卫。细胞保持在37°C孵化器有限公司为5%2。所有的细胞系检测支原体为阴性。α硫辛酸(ALA)从Solarbio购买(中国,北京)。根据阿拉巴马州在其他研究的浓度范围和传输Caco-2 ALA对映体的细胞(13,14),并结合pre-experiments的结果,阿拉巴马州和DMSO溶液溶解,制定到50,150年和300年μ正式实验。
2.2。伤口愈合实验
定位标志是用记号笔底部的细胞培养板,以确保相同的观察伤口。NCM460 Caco-2细胞培养,直到6-well细胞培养板90%的融合。的伤势造成与200 -细胞单层膜μl吸管技巧。然后用特定浓度的细胞被孵化阿拉巴马州在无血清培养基。在孵化过程中,观察细胞迁移与奥林巴斯FluoView™300共焦显微镜(日本东京)。伤口与ImageJ软件测量的区域。剩下的伤口面积计算使用以下公式: 。每组至少五个领域进行了分析。
2.3。实时定量PCR(存在)
从组织总RNA提取使用试剂盒试剂(美国热费希尔)根据制造商的指示。然后用1 RNA是反向转录cDNAμg总RNA,用逆转录酶和益生元dT引物(豆类、日本)。那时的cDNA放大与特定PCR引物。中存在的条件如下:95°C 3分钟,其次是40周期10 s在95°C, 10 s 60°C和15 s在70°C,紧随其后的是加热从65°C到95°C。引物如下:列出了存在ZO-1正向引物5 - - - - - -棉酚注册会计师GGC ATC ATC有条件现金援助AA-3 ,反向引物5 - - - - - -GAG CGG ACA AAT有条件现金援助CTC TG-3 。OCLN正向引物5 - - - - - -TTT GTG GGA CAA GGA ACA CA-3 ,反向引物5 - - - - - -柠檬酸TTC TTG CCA TTG GA-3行动 。GAPDH正向引物5 - - - - - -棉酚GGT棉酚GGT CGG AGT颈- 3 ,反向引物5 - - - - - -棉酚手枪GGT手枪GGG攻击力TC-3 。
2.4。免疫印迹
细胞用冰冷的PBS和细胞溶解里帕缓冲区。样品含有相同数量的总蛋白质决定15% SDS聚丙烯酰胺变性凝胶和转移到硝化纤维膜。阻塞后5%的脱脂牛奶TBST 1 h,一夜之间,细胞膜被孵化在4°C以下主要抗体:一种蛋白激酶(Abcam 1: 1000年,英国),物(Abmart 1: 1000年,中国上海),和p38 (Abmart 1: 1000年,上海,中国。山羊anti-rabbit免疫球蛋白二次抗体(1:5000)(Servicebio,武汉,中国)是用于在室温1小时孵化。污点是可视化使用ECL化学发光工具包(Epizyme、上海、中国)。每个乐队都通过ImageJ量化软件。
2.5。统计分析
这项研究的结果被表示为 值。学生的 - - - - - -测试是用来比较不同组之间的结果。 被认为是具有统计学意义。所有分析使用GraphPad棱镜version 8的软件。
3所示。结果
3.1。阿拉巴马州促进上皮细胞迁移后受伤
人类结肠上皮细胞NCM460和人类大肠癌细胞腺癌Caco-2是无血清培养系统在12 h形成单层。与控制细胞相比,阿拉巴马州显示增强的损伤修复的细胞治疗剂量依赖性的方式(数字1(一)和1 (b))。如数据所示1(一)和1 (c),剩下的伤口面积NCM460细胞治疗与阿拉巴马州(150年和300年μ米)明显小于控制细胞孵化12 h和24 h后( )。与此同时,其余的伤口面积Caco-2细胞治疗ALA(50, 150年和300年μ米)后被显著降低12 h(孵化(数字1 (b)和1 (d))( )。
(一)
(b)
(c)
(d)
3.2。阿拉巴马州的表达增加肠道粘膜紧密连接因素
揭示ALA对肠道粘膜紧密连接的影响,ZO-1的表达和OCLN测量在mRNA水平。如图2阿拉巴马州NCM460细胞孵化(150年和300年μ米),的mRNA水平ZO-1和OCLN都远高于对照组( ),而50μM阿拉巴马州几乎没有影响的表达ZO-1和OCLN ( )。阿拉巴马州的表达显著增加ZO-1和OCLN肠粘膜上皮细胞在mRNA水平。
3.3。阿拉巴马州促进肠上皮损伤修复通过调节PI3K / AKT、物和p38 MAPK信号通路
以前的研究已经表明增殖蛋白激酶(MAPK) -相关分子在许多细胞系与伤口愈合密切相关,包括上皮细胞、角质细胞,肿瘤细胞(15- - - - - -17]。调查阿拉巴马州在上皮细胞的促生长机制,我们评估的状态MAPK信号通路在ALA-treated NCM460细胞。免疫印迹显示MAPK signaling-related分子PI3K / AKT,小君n端激酶(物),和p38显著抑制治疗ALA(图3(一个))。高浓度的阿拉巴马州抑制一种蛋白激酶和物信号通路(数字3 (b)和3 (c)),而p38信号通路的失活是观察ALA浓度较低(图3 (d))。
(一)
(b)
(c)
(d)
4所示。讨论
许多因素,如炎症、免疫因素、氧化应激,药品,和不平衡的肠道微生物群可能损害肠道上皮细胞功能和损害其屏障功能(18,19]。肠上皮细胞损伤后,上皮细胞迁移、增殖和分化,逐渐愈合(20.]。医学临床应用,促进肠道粘膜伤口愈合,有利于患者的康复各种肠道疾病,包括炎症性肠病(IBD),腹腔疾病和肠道感染(21]。在目前的研究中,我们证明了阿拉巴马州可以增强肠道损伤修复和揭示其机制。
硫辛酸是一种很有效的抗氧化剂存在于线粒体,通过体内胃肠道吸收。蔬菜如菠菜、花椰菜、西红柿和胡萝卜和肉等肝脏富含硫辛酸,但食品补充硫辛酸不足和缓慢生效。因此,阿拉巴马州是常用的药物或营养补充品各种疾病(22]。
现有研究表明,阿拉巴马州可能会加速小鼠皮肤伤口愈合(23)或促进人类术后子宫治疗(24]。然而,它对肠道上皮伤口愈合的影响仍然未知。在这项研究中,我们进行了伤口愈合分析人类结肠上皮细胞(NCM460)和结肠癌细胞腺癌(Caco-2)。低浓度ALA (50μ对损伤修复M)没有明显的影响,而高浓度(150年和300年μ米)的ALA浓度的方式能促进肠上皮损伤修复(数字1(一)和1 (b))。此外,阿拉巴马州显著增强上皮细胞迁移(数据1 (c)和1 (d)),这是一个重要的伤口修复的过程。
紧密连接蛋白1 (TJP1,也称为ZO-1),膜相关细胞质蛋白,扮演着一个重要的角色在细胞间的信息交流障碍non-epithelial和上皮细胞(25]。阿拉巴马州增加ZO-1表达式中观察到我们目前的研究(图2),上皮细胞的增殖和分化密切相关。Occludin (OCLN)是另一个重要的紧密连接蛋白在伤口愈合26]。研究表明,增加OCLN可以维持肠道屏障功能在溃疡性结肠炎患者和小鼠结肠炎27阿拉巴马州],这是符合我们发现增加的表达OCLN在肠上皮损伤修复(图2)。
作为一种抗氧化剂,阿拉巴马州的机理与它对氧化应激的影响。在老鼠实验中,阿拉巴马州预处理显著降低氧化应激和炎症在小肠28]。阿拉巴马州保护仔猪肠上皮细胞(IPEC-J2细胞)对H2O2诱导伤清除羟基自由基(29日]。然而,阿拉巴马州的确切机制在肠上皮损伤修复过程仍不清楚。
增殖蛋白激酶(MAPK) -相关信号通路,包括p38物,兵,和一种蛋白激酶,参与许多细胞反应等我们增殖,分化、凋亡、炎症和氧化应激(30.- - - - - -32]。人们已经发现,MAPK-related信号通路参与伤口愈合。MAPK激活影响扩散、迁移和细胞凋亡的M1-like巨噬细胞和前列腺手术后延迟伤口愈合过程33]。神经胶质细胞line-derived神经营养因子(GDNF)推广障碍成熟不成熟的肠上皮细胞细胞失活的p38 MAPK信号(34]。Delbue等人发现抑制ERK通路获救的紧密联接的屏障缺陷在IEC细胞(35]。活性氧(ROS)是一个重要和常见的信使在各种环境压力和生产能激活多种MAPKs [36]。阿拉巴马州可能调节MAPK信号通过消除过多的活性氧产生后肠道损伤。在我们的研究中,我们发现,肠道上皮细胞损伤的修复,阿拉巴马州可能与PI3K / AKT的失活有关,物和p38 MAPK信号通路(图3),但需要进一步的验证。阿拉巴马州的不同抑制AKT、物和p38可能是因为他们影响血管生成和炎症在不同通路(37]。据报道,氧化应激激活p38 MAPK信号通路,导致减少的表达TJP [38];这可能是阿拉巴马州的一个原因增加ZO-1表达在我们的研究中。
5。结论
总之,我们已经证明了清楚,阿拉巴马州增加NCM460 Caco-2细胞增殖和迁移的表达增加ZO-1和OCLN紧密连接因素。此外,我们发现,阿拉巴马州的积极影响肠道上皮损伤修复可能与MAPK信号通路有关。我们的研究结果提供了一个理论依据阿拉巴马州的未来发展治疗肠道损伤。
数据可用性
使用的数据集和分析在当前研究可从相应的作者以合理的要求。
的利益冲突
没有对所有作者的利益冲突。
作者的贡献
于杨和永肖贡献同样这项工作。
确认
这项工作是由中国国家自然科学基金支持的81172186号(QT),由湖北省自然科学基金2018号cfb504 (QT),武汉大学人民医院的基础和指导。RMYD2018M67 (QT)。